Resultados Região 5’ flanqueadora
1- Caracterização dos elementos transcricionais regulatórios presentes nas regiões flanqueadoras do gene gsn
De maneira geral, a ativação ou desativação transcricional de genes desempenha um importante papel na habilidade que os organismos têm em desenvolver respostas adaptativas a diferentes condições ambientais adversas. Embora os mecanismos pelos quais as células detectem e respondam apropriadamente a estas formas de estresse ambientais variados ainda seja bastante desconhecido, um grande número de fatores de transcrição participando destas vias de transdução do sinal estressante já foram identificados.
O glicogênio é considerado uma das principais fontes de reserva de glicose nos microrganismos. A análise prévia da expressão do gsn mostrou que em determinadas condições estressantes como o choque térmico, os níveis de transcrito foram reduzidos e que esta redução foi acompanhada também por uma redução no conteúdo de glicogênio das células estressadas (DE PAULA et al., 2002). O isolamento das seqüências nucleotídicas das regiões flanqueadoras do gene permitiu a identificação de vários prováveis sítios de ligação para fatores de transcrição nestas regiões, dentre eles os elementos HSE e os elementos STRE, os quais se encontram envolvidos no controle da expressão gênica na situação de estresse térmico (FREITAS & BERTOLINI, 2004). Uma vez que um aumento na temperatura de crescimento do fungo resultou em uma redução nos níveis de RNAm gsn, iniciamos o presente estudo investigando o papel dos prováveis elementos de transcrição encontrados na região 5’ flanqueadora do gene, através de ensaios de retardamento em gel. Os resultados obtidos nos ensaios de EMSA para os elementos HSE e para os dois elementos STRE encontram-se discutidos no artigo “Genomic organization of the Neurospora crassa gsn gene: possible involvement of the STRE and HSE elements in the modulation of transcription during heat shock” (Mol. Gen. Genomics, 2004, 272: 550-561), no Anexo 1.
O elemento de transcrição STRE presente na região 3’ flanqueadora do gene também foi analisado por EMSA. Bandas de DNA de mobilidade reduzida foram detectadas para todos os elementos 3’ downstream ao sinal de poliadenilação analisados, sugerindo um provável envolvimento destes no controle da transcrição gênica durante o choque térmico. O controle transcricional mediado por elementos regulatórios presentes na região 3’ flanqueadora de genes é conhecido em organismos eucariotos superiores. É sabido que a expressão do gene da eritropoietina é altamente estimulada na situação de hipóxia em humanos (BECK et al., 1991). Ensaios de deleção realizados nas regiões 5’ e 3’ flanqueadoras do gene mostraram que a remoção de um fragmento de DNA de aproximadamente 600 bp, imediatamente downstream ao sinal de poliadenilação na região 3’ flanqueadora, eliminava completamente a resposta gênica à hipóxia e a reinserção deste fragmento upstream à região 5’ flanqueadora foi capaz de restaurar a ativação da expressão
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gênica durante a hipóxia. Analises posteriores da mesma região fusionada a um gene repórter mostraram a presença de um elemento de transcrição do tipo enhancer, fundamental na expressão gênica da eritropoietina, imediatamente 120 bp downstream ao sítio de poliadenilação do gene, cuja atividade era independente da posição e orientação e era capaz de estimular a transcrição gênica em até 15 vezes em resposta à hipóxia (BECK et al., 1991). O gene que codifica para o hormônio de crescimento humano é controlado negativamente por uma seqüência regulatória cis bastante complexa localizada na região 3’ flanqueadora, a qual também apresenta atividade independente da orientação e da posição. Esta seqüência silenciadora mostrou ser dependente da região promotora e sua presença na região 3’ flanqueadora reduz a taxa de acetilação das histonas associadas ao promotor, resultando numa redução significante do recrutamento da RNA polimerase II no promotor e consequentemente, da expressão gênica (TRUJILLO et al., 2006)
A funcionalidade dos elementos de transcrição CRE, conhecidos por recrutarem componentes da maquinaria transcricional nas regiões promotoras, também foi analisada por ensaios de retardamento em gel. Todos os elementos CRE encontrados no promotor gsn foram analisados quanto à atividade de ligação DNA-proteinas, usando extratos nucleares preparados de micélios submetidos ou não ao choque térmico. As autoradiografias revelaram que em todas as situações estudadas, bandas de DNA de mobilidade reduzida foram detectadas, sugerindo que os elementos CRE localizados no promotor gsn são capazes de serem reconhecidos e ligados por proteínas nucleares do fungo. As proteínas CREB, responsáveis por ligar os consensos CRE são fatores de transcrição cuja atividade é regulada por fosforilação (MAYR & MONTMINY, 2001). A fosforilação leva à dimerização e conseqüente ligação ao elemento regulatório CRE. Em nosso trabalho, embora ortólogos CBP não tenham sido encontrados em banco de dados de N. crassa, a ativação das proteínas do tipo CREB por eventos de fosforilação ficou bastante evidente quando a linhagem mutante do fungo apresentando PKA hiperativa (mcb) foi usada nos ensaios de EMSA. Também a influência dos níveis de AMPc pôde ser comprovada na linhagem deficiente em AMPc (cr-1), para qual uma baixa atividade de ligação DNA-proteína foi observada tanto na presença quanto na ausência do evento estressante, em virtude da atividade PKA estar praticamente ausente nesta linhagem. PROFT et al. (2005) mostraram que o fator de transcrição Sko1p é capaz de reconhecer e ligar seqüências CRE nos promotores de genes responsivos a estresse osmótico e regular a expressão gênica na levedura S. cerevisiae. Através de ensaios de imunoprecipitação de cromatina, os autores também identificaram aproximadamente 40 promotores alvos para o fator de transcrição Sko1p in vivo, sendo que o reconhecimento de alguns destes promotores só foi possível quando na presença de fatores de transcrição assessórios.