Análise da expressão de genes CAZy de A oryzae cultivado sob diferentes tratamentos

6.3.6.1 Caracterização de genes codificantes de enzimas CAZy

De acordo com o banco de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy) (http://www.cazy.org/ (Cantarel et al., 2009), um total de 114 famílias CAZy foram identificadas nos tratamentos de A. oryzae BLU37. A família de glicosil hidrolases (GH) foi a mais diversa apresentando um total de 62 famílias. Seguida por 30 famílias de glicosil transferase (GT), 9 famílias de módulos de ligação ao carboidrato (CBM), 8 famílias de carboidrato esterase (CE) e 5 famílias de polissacarídeo liase (PL). As famílias CAZy identificadas não variaram entre as oito bibliotecas de cDNA analisadas.

As famílias CAZy identificadas usando parâmetros estatísticos padj < 0,01 e log2FoldChange < -5 e > 5, as famílias GH1, 10, 105, 11, 12, 13, 15, 16, 2 24, 25, 27, 28, 3, 31, 35, 36, 43, 5, 51, 53, 6, 61, 62, 67, 7, 71, 78, 93, 95 foram encontradas. Famílias CE 1, 12, 16, 4, 5, 8 e PL1, 3, 9 também foram identificadas entre os tratamentos com bagaço de cana em comparação com os tratamentos com glicose. Famílias CBM 14 e 32 foram identificadas somente no tratamento SB48, entretanto, genes pertencentes às famílias de glicosil hidrolases e módulos de ligação ao carboidrato foram identificados em todos os tratamentos (LB36, LB48, SB36 e SB48) como a GH61, CBM1. Genes relacionados a expressão de quitinase como os da família GH18 foram identificados em todos os tratamentos com bagaço de cana com regulação reprimida em mais de 5 vezes em comparação com os tratamentos com glicose (anexo 3).

Genes que codificam famílias de enzimas CAZy e fatores de transcrição diferencialmete expressos foram analisados para os oito tratamentos de A. oryzae BLU37. A partir da análise de aproximadamente 7.120 genes para cada tratamento, os resultados foram semelhantes. Os genes que codificam enzimas da família glicosil hidrolase (GH) são os mais presentes com cerca de 2,57% de genes em cada tratamento. Genes que codificam enzimas das famílias de carboidrato esterases (CE), polissacarídeos liases (PL), glicosil transferases (GT) e módulos de ligação ao carboidrato (CBM), estiveram presentes em menor porcentagem com cerca de 0,29%, 0,19%, 1,25%, 0,09%, respectivamente. Genes que codificam fatores de transcrição representam cerca de 2,33% e genes com anotações preditas ou não anotados representaram cerca de 93,34% do total de genes presentes em cada tratamento.

Baseado nos dados de agrupamento dos genes que representam famílias CAZy, fatores de transcrição e genes não anotados, gráficos de dispersão foram montados (figura 36). Genes GH, CMB, CE, GT e PL são representados por pontos amarelos, verde, vermelho, laranja e azul, respectivamente. Genes que codificam fatores de transcrição são representados por pontos roxos e genes não anotados por pontos cinza. A análise que consistiu em comparações entre dois tratamentos por gráfico, destacou genes diferencialmente expressos com provável participação na hidrólise de carboidratos. A análise

da expressão diferencial de genes CAZy entre os tratamentos de A. oryzae BLU37, usando parâmetros estatísticos de padj < 0,01 e log2FoldChange < -10 ou > 10, resultou na presença de genes das famílias GH e CE somente em comparações entre tratamentos com bagaço de cana e glicose.

Nos tratamentos LB36 x LG36 o gene que codifica a endoxilanase, identificador AO090001000111, da família GH11 teve a sua expressão 10 vezes aumentada no tratamento LB36 em comparação com o tratamento LG36, semelhante foi visto para os genes da xiloglucana específica endo-β-1,4-glucanase (AO090026000102) GH12 11 vezes mais expresso; endo-β-1,4-xilanase (AO090103000423) GH10 12 vezes mais expresso; xilanase (AO090120000026) GH11 13 vezes mais expresso. As celobiohidrolase, identificadores AO090001000348 e AO090038000439, GH7, 6, foram 10 e 11 vezes mais expressas, respectivamente. Os genes da exoarabinase (AO090011000141) GH93 e α-N- arabinofuranosidase (AO090701000885) GH62 foram 11 vezes mais expressos. A endoglucanase (AO090023000787) GH61 foi 10 vezes mais expressa, e o feruloil esterase (AO090701000884) CE1 foi 14 vezes mais expresso (figura 36A).

Os genes observados com expressão diferencial entre os tratamentos com bagaço de cana e glicose foram semelhantes, entretanto com níveis de expressão diferentes. Comparações entre os tratamentos LB48 e LG48 mostratam níveis de expressão mais elevados quando comparado com os tratamentos LB36 e LG36. Genes que codificam a Endoxilanase (AO090001000111) GH11, xiloglucana específica endo-β-1,4-glucanase (AO090026000102) GH12, endo-β-1,4-xilanase (AO090103000423) GH10, xilanase (AO090120000026) GH11, tiveram a sua expressão aumentada em 11, 14, 14, 15 vezes, respectivamente. As celobiohidrolase (AO090001000348, AO090012000941 e AO090038000439) GH7, 7 e 6 a expressão foi 11, 10 e 12 vezes maior no tratamento com bagaço de cana, respectivamente. A endoglucanase (AO090023000787) GH61 foi 11 vezes mais expressa. Os genes da exoarabinase (AO090011000141) GH93, α-N- arabinofuranosidase (AO090701000885) GH62, arabinofuranosidase (AO090701000886) GH43, tiveram a sua expressão aumentada 13, 12, 10 vezes, respectivamente (figura 36B).

Na análise dos tratamentos SB36 e SG36, os genes da β-xilosidase (AO090005000986) GH3, xiloglucana específica endo-β-1,4-glucanase (AO090026000102) GH12, endo-β-1,4-xilanase (AO090103000423) GH10, xilanase (AO090120000026) GH11, Acetil xilana esterase (AO090011000745) CE1, teveram expressão 12, 10, 12, 15, 14 vezes aumentada. As celobiohidrolases (AO090001000348, AO090038000439) GH7, 6 expressaram 10X mais no bagaço. Os genes que codificam para atividade α-L-fucosidase (AO090005000382) GH95, β-galactosidase (AO090012000135) GH3, exopoligalacturonase (AO090026000784) GH28, exopoligalacturonase (AO090102000011) GH28, α-N- arabinofuranosidase (AO090103000120) GH3, α-N-arabinofuranosidase (AO090701000885) GH62, arabinofuranosidase (AO090701000886) GH43, pectinaesterase (AO090011000745) CE8 tiveram a sua expressão aumentada em 10, 12, 11, 13, 13, 12, 13 vezes, respectivamente (figura 36E).

A análise comparative entre os tratamentos SB48 e SG48 apresentou expressão aumentada em 10 vezes no tratamento SB48 dos genes β-xilosidase (AO090005000986) GH3, endo-β-1,4-xilanase (AO090103000423) GH10, xilanase (AO090120000026) GH11, α- N-arabinofuranosidase (AO090701000885) GH62 e feruloil esterase (AO090701000884) CE1. A β-galactosidase (AO090012000135) GH3 expressou 13 vezes mais no SB48 do que no SG48 (figura 36F).

Análise comparativa entre os tratamentos LB36 x LB48, LG36 x LG48, SB36 x SB48, SG36 x SG48, SB36 x LB36, SB48 x LB48, SG36 x LG36, SG48 x LG48 não resultaram em níveis de expressão igual ou acima de 10 vezes, revelando que os genes diferencialmente expressos estão relacionados com a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar. Uma segunda análise usando o parametro estatistico padj < 0,01 e log2FoldChange < -5 ou > 5 revelou cerca de 104 genes CAZy regulados positivamente identificados entre os tratamentos com bagaço de cana em comparação com os tratamentos com glicose. 23 genes CAZy foram identificados em quatro tratamentos com regulação positiva acima de 5 vezes quando comparado com os tratamentos com glicose. Um total de 21 e 15 genes CAZy foram identificados em três e dois tratamentos, respectivamente. 45 genes CAZy foram exclusivos de um tratamento (figura 37) (anexo 3 e 4).

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Figura 37: Diagrama de Venn mostrando a distribuição do número de genes CAZy com expressão e co- expressão diferencial, com regulação positiva, de acordo com cada tratamento. Circulo vermelho contém os genes CAZy com expressão diferencial no tratamento em cultivo líquido com 36 horas após inóculo. Circulo azul contém os genes CAZy com expressão diferencial no tratamento em cultivo líquido com 48 horas após inóculo. Circulo roxo contém os genes CAZy com expressão diferencial no tratamento em cultivo semi-sólido com 36 horas após inóculo. Circulo verde contém os genes CAZy com expressão diferencial no tratamento em cultivo semi-sólido com 48 horas após inóculo.

1! 12! 5! 27! 23! 3! 13! 3! 9! 6! 2!

Figura 36:. Analise comparativa de dispersão dos genes relacionados a famílias CAZy, fatores de transcrição e não anotados. A: LB36 x LG36; B: LB48 x LG48; C: LB36 x LB48; D: LG36 x LG48; E: SB36 x SG36; F: SB48 x SG48; G: SB36 x SB48; H: SG36 x SG48; I: SB36 x LB36; J: SB48 x LB48; K: SG36 x LG36; L: SG48 x LG48. Cultural líquida (L), cultura semi-sólida (S), suplementado com bagaço de cana (B), suplementado com glucose (G), cultivo por 36h (36), cultivo por 48h (48). Pontos amarelos: genes da família CAZy GH, pontos verdes: genes da família CAZy CBM, pontos vermelhos: genes da família CAZy CE, pontos laranjas: genes da família CAZy GT, pontos azuis: genes da família CAZy PL, pontos roxos: fatores de transcrição, pontos cinzas: genes não anotados.

E F G H

6.3.9.4 Fatores de transcrição

A partir do banco de dados Fungal Transcription Factor Database (http://ftfd.snu.ac.kr/index.php?a=view), uma análise usando os paramentros estatísticis de pvalue ajustado < 0,01 e log2FoldChange < -2 ou > 2, 44 genes pertencentes à cinco famílias de fator de transcrição, foram encontrados (anexo 5 e 6)

A análise comparativa entre os oito tratamentos, quatro tratamentos com bagaço e quatro tratamentos com glicose, usando parâmetros estatísticos padj< 0,01 e log2FoldChange < -5 e > 5 identificou dois genes relacionados a fatores de transcrição. O gene AO090023000362 da família Zn2Cys6 e o AO090005001041 da família C2H2 zinc finger tiveram a sua expressão aumentada em 5 e 7 vezes nos tratamentos LB48 e SB36, respectivamente. Entretanto, dois genes da família bHLH relacionados a reprodução do fungo nos tratamentos LB36, LB48 e um gene da família Zn2Cys6 no tratamento SB48 tiveram a sua expressão reprimida em 5 vezes (anexo 5 e 6).

Dois fatores de transcrição AO090038000234 e AO090038000233 induzidos por maltose, foram reprimidos em cinco e seis vezes, respectivamente, em comparação entre os tratamentos LB36 e SB36. Análise comparativa entre os tratamentos com glicose mostrou que o gene AO090005001041, um fator de transcrição ortólogo do gene BrlA, também teve a expressão aumentada de cinco a seis vezes nos tratamentos LG36 e SG36, e SG48 e SG36, respectivamente. A partir das análises comparativas dos níveis de expressão entre os oito tratamentos, o gene XlnR, responsável pela regulação de genes celulolítico e xilanolítico, mostraram níveis de expressão não significativos.

7 DISCUSSÃO

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7.1 Confirmação da posição taxonômica do A. oryzae BLU37

Aspergillus seção Flavi é um taxon que inclui espécies com a cabeça de conídios amarelo-verde a marrom e escleródio escuro. Entretanto, a classificação dentro dessa seção é difícil, com consideráveis divergências de caracteres morfológicos, resultando em variabilidade genética intra e interespecífica entre os membros dessa seção (Kumeda and Asao, 1996; Klich & Pitt, 1988). A partir da região consenso do isolado A. oryzae BLU37, a análise BLASTn apresentou homologias com oito espécies do grupo de Aspergillus seção Flavi, incluindo A. oryzae. Entretanto análise RefSeqGene Blast confirmou a posição taxonômica da região rDNA ITS analisada com A. oryzae RIB40. Apesar da difícil resolução taxonômica de diversas espécies na secção Flavi, características morfológicas em conjunto com a análise molecular de regiões como, rDNA ITS, β-tubulina e calmodulina, têm sido usadas para inferir as relações filogenéticas dentro dessa seção (Kumeda and Asao, 2001; Frisvad et al., 2005; Pildain et al., 2008; Varga et al., 2011).

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6.2 Perfil da atividade enzimática A. oryzae BLU37 cultivado em bagaço de cana-de-