Prospecção de fungos lignocelulolíticos

A maioria das estratégias de conversão da biomassa lignocelulósica em etanol, envolve a depolimerização de polissacarídeos por catálise enzimática. Estratégia essa, que representa um gargalo no processo de conversão da biomassa devido à recalcitrância da parede celular da planta. Uma forma de otimizar esse processo é a bioprospecção de fungos filamentosos lignocelulósicos, por produzirem grande numero e variedade de enzimas que possuem atividades catalíticas diferentes e complementares. Entretanto, as enzimas usadas na hidrólise da biomassa, possuem um alto custo de produção por serem produzidas por sistemas vivos e serem termodinamicamente instáveis. E devido a recalcitrância química e física da lignocelulose, grandes quantidades de enzimas são necessárias para obter razoáveis taxas de degradação. O custo final das enzimas lignocelulósicas ainda é um dos fatores que desfavorecem a industria do etanol lignocelulósico. Embora a produção dessas enzimas ainda possua um custo de produção elevado, estudos visando a diminuição desses custos por meio da bioprospecção de fungos lignocelulósicos estão sendo realizados (Lundell et al., 2010).

Enzimas que depolimerizam a biomassa vegetal são produzidas, em sua maioria, por fungos dos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Humicola, entre outros. Busca por novos organismos, principalmente fungos, que secretam enzimas mais eficiêntes das enzimas já conhecidas e enzimas que atuam sinergicamente com as enzimas comerciais existentes são abordagens para a otimização do processo de hidrólise da biomassa. Melhoria das cepas por metagêneses convensional e molecular, melhoramento das enzimas por engenharia de proteína e evolução direcionada, e melhoria na eficiência de produção de enzimas em escala industrial também visam um sistema de hidrólise da biomassa ótimo (Merino & Cherry, 2007; Banerjee & Scott-Craig, 2010). A partir da bioprospecção de fungos lignocelulolíticos, podem ser isolados micro-organismos que secretem enzimas mais eficientes, otimizando a hidrólise da biomassa.

Estudos de levantamento em larga escala de 156 fungos patogênicos e não patogênicos de plantas, revelaram que as espécies patogênicas apresentaram atividade moderada a alta de seus perfis com atividade hidrolítica. O estudo também revelou que quando testados na biomassa e hemicelulose derivadas de suas plantas hospedeiras, a hidrólise foi mais intensa. Esses resultados mostram que muitos dos fungos patogênicos de plantas são potenciais produtores de enzimas lignocelulolíticas, e são uma fonte promissora de novas enzimas acessórias para complementar o sistema de hidrólise da biomassa de T. reesei, um grande produtor industrial de celulases (King et al., 2011).

Também em estudo de metatranscritômica de solo húmico, foram revelados um grupo dominante de 99% de eucariotos, onde 99% eram do Filo Ascomicota. Baseado na informação de BLAST e busca por motif, foram identificadas 22 famílias de glicosil hidrolases. A família GH18 foi a mais abundante com 14 % do numero total de sequências codantes de enzimas GH. Outras famílias GH também apresentaram resultados significativos como a família GH43 com 10% e as famílias GH1, GH5, GH16 e GH75 com 7% do numero total de sequências que codificam enzimas da família GH. Quase todos os genes que codificam hemicelulases como, xilanase e xilosidade, foram classificados na família GH43. Resultados sugerem que a comunidade eucariótica do solo húmico possui um grande potencial para hidrólise de componentes da parede celular das plantas (Takasaki et al., 2013).

A partir de dados de genômica disponíveis foram analisadas 20 espécies de fungos filamentosos com intuito de investigar o potencial de hidrólise da biomassa de cada espécie. A comparação genômica mostrou que espécies do gênero Aspergilli e Fusaria possuem grandes números de genes que codificam glicosil hidrolases. O perfil de atividade do secretoma à sacarificação da palha de trigo, revelaram que as espécies A. flavus, A. niger, A. fumigatus e A. nidulans, foram capazes de aumentar a taxa de glucose liberada na hidrólise, quando comparados com o secretoma do T. ressei CL847. Dados sugerem que a maioria dos fungos analisados suplementam, o conjunto de enzimas produzidas pelo T. ressei CL847 usadas pela indústria (Couturier et al., 2012).

2JUSTIFICATIVA

A utilização da biomassa vegetal em processos biotecnológicos alternativos para a produção de etanol de segunda geração, é de grande importância na implementação de tecnologias sustentáveis que contribuem na redução da poluição ambiental, além de diminuir o uso das culturas alimentares na produção de combustíveis.

O desenvolvimento de biotecnologias para a conversão da biomassa lignocelulósica em bioetanol estão sendo realizados principalmente devido a grande disposição e o baixo custo de resíduos lignocelulósicos agroindustriais . O programa de bioetanol brasileiro é um exemplo de produção de cana de açúcar eficiente e alta tecnologia para a produção de bioetanol (Soccol et al., 2010). Entretanto, em ordem de produção em larga escala, um aumento no desenvolvimento de tecnologias será necessário. Um obstáculo central que impede a utilização generalizada da biomassa celulósica são tecnologias de processamento, principalmente na conversão da biomassa em açucares com redução dos custos.

Atualmente a utilização de enzimas celulolíticas e hemicelulíticas são um grande atrativo, visto que estas são específicas e eficientes ao substrato no processo de bioconversão, uma vez que a hidrólise dos biopolímeros é resultante do somatório de ações de diferentes enzimas que agem sinergicamente. Essas são características importantes para a redução de custos do processo. O uso dessas enzimas, também, em conjunto, podem diminuir os passos do processo, assim como, diminuir o impacto ambiental com a diminuição de resíduos.

O etanol tem um grande potencial como substituição da gasolina no mercado de combustíveis. A produção mundial de bioetanol em 2006 foi de 39 bilhões de litros e espera- se que atinja 200 bilhões de litros em 2015. Entretanto o custo para a produção do bioetanol ainda é elevado se comparado ao de combustíveis fosseis. Uma vez que o fungo filamentoso A. oryzae possui um grande potencial para a produção de enzimas lignocelulósicas, estudos biotecnológicos relacionados à bioprospecção dessas enzimas são de grande contribuição para a produção do bioetanol de segunda geração.

Este projeto visa a contribuição em programas de melhoramento genético para um melhor conhecimento e entendimento a respeito de genes expressos por A. oryzae envolvidos no processo de hidrólise e desconstrução de biopolímeros como, a celulose e hemicelulose, encontrados em resíduos agroindustriais como o bagaço de cana de açúcar em estado sólido e líquido. Adicionalmente a expressão de genes de interesse identificados por meio de análise in silico, será validada com ajuda da técnica de transcrição reversa do RNA por PCR quantitativo (qRT-PCR). Os resultados, além de contribuir na otimização e aplicação de técnicas de engenharia genética nos bioprocessos de conversão da biomassa lignocelulósica em bioetanol, contribuirá para a prospecção e crescimento do potencial biotecnológico da produção de enzimas industriais que hidrolizam o bagaço por isolados de Aspergillus. Benefícios ao meio ambiente pelo aproveitamento e diminuição de resíduos agroindustriais poderão ser adquiridos.

3 HIPÓTESE A SER TESTADA

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• A análise global do transcritoma de A. oryzae BLU37 durante diferentes estágios do crescimento na presença do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ou glicose como fonte de carbono, possibilita a identificação de genes envolvidos nos diferentes processos de cultivo.

• A análise funcional do transcritoma de A. oryzae BLU37 durante diferentes estágios do crescimento na presença do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ou glicose como fonte de carbono, possibilita a identificação de genes envolvidos na síntese de enzimas CAZy capazes de degradar a biomassa vegetal.

4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo Geral

O presente projeto tem como objetivo geral a análise da expressão diferencial de genes do fungo A. oryzae associados à utilização do bagaço da cana de açúcar como única fonte de carbono em sistemas de cultivo líquido e semi-sólido.

4.1.2 Objetivos Específicos

1. Analisar o transcritoma diferencialmente expresso de A. oryzae associado ao resíduo agroindustrial, bagaço de cana-de-açúcar, utilizado como única fonte de carbono na fase exponencial de atividade enzimática em sistemas de cultivo líquido e semi- sólido;

2. Selecionar as sequências gênicas diferencialmente expressas na fase exponencial de atividade enzimática de A. oryzae, envolvidas na regulação e expressão de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas mediante análise bioinformática in silico;

5 MATERIAL E MÉTODOS

Figura 24: Diagrama do bioensaio da análise do transcritoma de A. oryzae BLU37 cultivado em culturas líquidas e semi-sólidas, usando bagaço de cana de açúcar e glicose como única fonte de carbono, em cultivos de 36 e 48 horas.