CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ESPÉCIES DE ASPERGILLUS AFLATOXIGÊNICOS
1.5 Métodos de diagnose de micotoxinas: Limitações e estratégias inovadoras
1.5.1 Controle e monitoramento do sistema alimentar
Embora reconhecida como importantes fontes alimentares, e o Brasil ser grande produtor da castanha do Brasil, castanha de caju e amendoim, tem sofrido com questionamentos quanto a qualidade desses produtos exportadas, principalmente pelos Estados Unidos e Europa. Uma vez que as amêndoas são consumidas in natura e a contaminação por aflatoxina pode ser transmitida ao consumidor final. Nesse contexto, a cadeia produtiva da castanha do Brasil têm sido ameaçada pelas dificuldades de adequação aos padrões tecnológicos exigidos pelos mercados importadores.
Visando uma melhoria na qualidade do produto extrativista, a comissão do Codex Alimentarius, estabelecida pela organização de alimentos e agricultura (FAO) e organização mundial de saúde (WHO), desenvolveu padrões internacionais, guias e códigos de boas práticas alimentares, que asseguram a qualidade do alimento comercializado. A integração das atividades da cadeia produtiva asseguram a prevenção e o rastreamento da contaminação (http://www.codexalimentarius.org).
Apesar das boas práticas recomendadas pelo Codex Alimentarius terem aumentado a qualidade das castanhas, a contminação por aflatoxinas ainda ocorre. Em regiões como o Norte do País, onde o extrativismo da castanha do Brasil é realizado por populações ribeirinhas e quase não há beneficiamento, são as mais afetadas pela contaminação. Etapas de secagem a armazenamento, são identificados como pontos críticos de contaminação, devido a exposição do produto a aeração natural para secagem, ou armazenamento das castanhas ainda úmidas.
Uma vez que a contaminação das amêndoas por aflatoxinas pode ocorrer desde os estágios de pré-colheita até os estágios de beneficiamento do alimento, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (http://www.agricultura.gov.br/), publicou uma istrução normativa para o ano/safra de 2011/2012. Nessa instrução normativa, o programa avalia 23 culturas, entre elas castanha do Brasil e amendoim. Foram inclusos às substâncias monitoradas diversos contaminantes, como as aflatoxinas, desoxivalenol, ocratoxina A e fumonisinas.
1.5.2 Identificação morfológica de fungos micotoxigênicos
A detecção de micotoxinas podem ser realizadas através de diversos métodos os quais apresentam diferentes níveis de sensibilidade e podem ser empregados em diferentes estágios. Uma delas é a identificação morfológica. Apesar de ser um método convencional, que requer apenas um laboratório de microbiologia básico, é um método lento que necessita
especialistas em morfologia e taxonomia de fungos. A diagnose morfológica identifica apenas o fungo micotoxigênico, mas não a toxina produzida por este.
A. flavus, A. nomius e A. parasiticus são as espécies de fungos micotoxigênicos mais importantes devido ao seu potencial para produção de aflatoxinas em diferentes sistemas biológicos, principalmente, em castanha do Brasil e amendoim. São fungos que produzem ramificações filamentosas em seu crescimento, denominadas hifas, as quais muitas vezes são chamadas de mofos. Uma rede de hifas conhecida como micélio secreta enzimas que quebram complexas fontes alimentares. Pequenas moléculas resultantes da hidrólise enzimátca são absorvidas pelo micélio gerarando energia para o desenvolvimento do fungo. À olho nu, não é possível observar as hifas individuais, mas densos tapetes de micélios e conídios (esporos assexuados) muitas vezes podem ser vistos (Cast, 2003).
A morfologia do A. flavus apresenta colônias com diâmetro entre 4,0-4,5cm, quando cultivadas em Czapek ágar, possuindo as colônias uma coloração amarelo-verde e tornando- se verde à medida que a colônia vai envelhecendo (figura 2). A cabeça conidial é radial, transformando-se com o tempo colunar, a vesícula é oval possuindo toda a superfície fértil. O conidióforo é longo, incolor e rugoso, e as métulas são pequenas (figura 4). As filíades são pequenas e ampuliformes, os conídios são globulosos a subglobulosos, normalmente áspero e amarelo-verde, variando em tamanho de 3,0-6,0µm (figura 3).
Já a morfologia do A. nomius apresenta colônias, quando cultivadas em Czapek ágar, atingindo 4,0 – 7,0cm de diâmetro em 7 dias à 25°C possuindo coloração entre amarelo esverdeado à verde a medida que a colônia vai envelhecendo. A cabeça conidial pode ser bisseriada ou unisseriada, radial. O conidióforo é incolor e rugoso. A vesícula é globosa a subglobosa. Os conídios também são globosos a subglobosos, rugoso, variando em 3,7-8,1µm à 4,5-6,5µm (Kurtzman et al., 1987).
Enquanto que a morfologia do A. parasiticus possui colônias entre 3,2 – 3,5cm de diâmetro, quando cultivadas em Czapek ágar, variando entre amarelo-verde e verde escuro à medida que vai envelhecendo. A cabeça é radial, com hastes longas e ásperas, e vesícula globulosa sendo fértil em toda a sua superfície. Quase não se observa a presença de métulas. As filíades são ampuliformes com longas e amplas terminações. Os conídios são globulosos, bastante ásperos, quase sempre mostram tecido de conectividade, variando em tamanho de 4,0-6,0µm (Singh et al., 1991).
A cabeça conidial de A. nomius é semelhante a de A. flavus, porém são predominantemente unisseriadas, enquanto que em A. flavus são predominatemente bisseriados. Os conídios de A. nomius são mais rugosos do que os conídios de A. flavus, mas não como os conídios de A. parasiticus (Klich and Pitt, 1988).
Isolados aflatoxigênicos de A. flavus, produzem aflatoxinas B1 e B2, e frequentemente ácido ciclopiazonico, não relacionado a micotoxinas, enquanto A. parasiticus, tipicamente produz aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, mas não produz o ácido ciclopiazonico (Horn et al. 1996). A. nomius possui um perfil de produção de micotoxinas similar ao A. parasiticus, entretanto, morfologicamente, é similar ao A. flavus (Peterson et al.
2001). Entretanto, Hesseltine et al. (1970), em uma pesquisa de produção de aflatoxinas por espécies de Aspergillus, relatada pela primeira vez a produção atípica de ambas aflatoxinas, B e G, por isolados de A. flavus.
Por ser uma metodologia lenta e que não estipula a presença de aflatoxinas, a diagnose morfológica atualmente está em desuso para análises laboratoriais de produtos para exportação.
Figura 2: Colônia das espécies membro da seção Flavi em meio de cultura semi-sólido CYA (A, D e G), MEA (B, E e H) e YES (C, F e I) cultivadas por 7 dias a 25°C. A – C: Colônia de Aspergillus flavus. D – F: Colônia de Aspergillus nomius. G – I: Colônia de Aspergillus parasiticus (modificada de Varga et al., 2011).
Figura 3: Conídio de espécies membro da seção Flavi. A: Conídio de A. flavus; B: Conídio de A.
nomius; C: Conídio de A. parasiticus (modificada de Varga et al., 2011).
A!
D!
G!
B!
E!
H!
C!
F!
I!
C!Figura 4: Conidióforo de espécies membro da seção Flavi. A: Conidióforo de A. flavus; B: Conidióforo de A. nomius; C: Conidióforo de A. parasiticus; D e E: Esclerótia de A. nomius (modificada Singh et al., 1991).
1.5.3 Detecção cromatográfica de micotoxinas
A detecção cromatográfica de micotoxinas é a atual metodologia adotada por laboratórios credenciados pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento), Ministério da Saúde, Inmetro, ANVISA, entre outros órgãos responsáveis pela fiscalização de grãos para análise de produtos agrícolas. As analises cromatográficas CCD (Cromatografia de Camada Delgada) e CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência), são usadas na identificação da toxina presente no lote analisado, onde a analise CLAE é mais precisa que a analise CCD.
A CCD é uma metodologia de cromatografia utilizada para separar componentes químicos por polaridade, avaliação da pureza e identificação de aflatoxinas. A identificação das toxinas específicas e suas concentrações é feita por comparação visual da intensidade dos pontos de interesse do padrão da análise. A técnica normalmente utiliza uma placa de sílica gel que consiste de uma fase estacionária imobilizada em uma cuba de vidro e um solvente atuando como fase móvel. A amostra é dissolvida em um solvente volátil e aplicada na forma de um ponto na fase estacionária. A placa de sílica gel é então colocada verticalmente em um reservatório e o solvente move-se em direção ao topo da placa por capilaridade. O CCD é uma metodologia que tem uma grande versatilidade para o uso de solventes. Aflatoxinas são fortemente fluorescentes quando sob a luz ultravioleta, com excitação a 365nm e emissão a 430nm. As diferentes aflatoxinas movem-se a taxas diferentes devido a diferenças no seu comportamento de partição entre a fase móvel líquida e a fase estacionária. O CCD é o método padrão da AOAC para análise de aflatoxinas desde 1971 (AOAC Official Method 971.24, 2000). As análises realizadas por essa técnica são demoradas, dificultando a analise de grandes amostragens. Utiliza um grande volume de solventes, entre eles o clorofórmio, encarecendo a analise e podendo causar danos a saúde dos analistas. Além das análises serem lentas, a CCD não detecta concentrações de aflatoxinas menores do que 5 ppb, tornando a técnica menos precisa (Lin, et al., 1998).
Entretanto, pode ser uma escolha de método de detecção de aflatoxinas onde técnicas de equipamentos avançados não estão disponíveis.
Na década de 1980 laboratórios analíticos que realizavam análises por meio de CCD, mudaram para CLAE por ser mais precisa e por ser uma técnica de quantificação altamente automatizada com alta seletividade e sensividade em análises de aflatoxinas. Atualmente métodos CLAE são amplamente usados devido a sua superior performance e confiança quando comparado com CCD. Laboratórios credenciados pelo MAPA que realizam análises de alimentos no Brasil, usam a metodologia CLAE. No CLAE, a fase móvel líquida ou solvente é usado para mover a amostra através da coluna. Nessa coluna contem uma matriz que irá separar componentes e contaminantes diferentes estruturalmente de acordo com a especificidade da matriz, que é a fase estacionária imobilizada. O analíto é então dividido em duas fases a medida em que passa pela coluna e conduzindo à separação de compostos, devido à diferença de coeficientes de partição. Normalmente, para aflatoxinas, são usados detectores de fluorescência com emissão de luz a 435nm e absorção a 365nm (Hussain, 2011). CLAE mostra ser mais eficiente e rápida, por sua eficiência em separar e quantificar as toxinas em baixas concentrações, variando entre 0 a 320ppb (Chu, 1992). A metodologia de CLAE utilizada para a detecção de aflatoxinas é específica. Esta consiste na utilização de clunas de imunoafinidade específicas para aflatoxinas na extração e purificação do extrato em análise.
Outro método analítico de toxinas é a cromatografia líquida de ultraperformance com detecção fluorescente acoplado com espectrometria de massa em tandem (UPLC-MS/MS), um método promissor devido a sua alta especificidade e por ser um método de detecção com ampla aplicabilidade que disponibiliza dados qualitativos e quantitativos. Considerando que a contaminação de alimentos por diversas espécies de fungos produtores de micotoxinas e diferentes tipos de toxinas produzidos por uma espécie de fungo, métodos de determinação de múltiplas micotoxinas em uma única analise deverão ser usados (Diana Di Mavungu et al., 2009). Analises simultaneas usando a metodologia de UPLC-MS/MS para a determinação simultânea de micotoxinas já foram descritas. Ventura et al. (2006) detectou AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 e ocratoxinas A em amostras de cevada. E Soleimany & Khatib, (2012) detectou afaltoxinas, ocratoxina A, zearalenona, deoxinivalenol, fumonisinas, toxinas T-2 e HT-2 em 80 amostras de cereais coletados em mercados da Malásia. Um total de 60 amostras apresentaram pelo menos uma dessas toxinas acima do limite de detecção.
No Brasil, as análises de alimentos são realizadas por laboratórios credenciados pelo MAPA, Ministério da Saúde, Inmetro, ANVISA, entre outros órgãos responsáveis pela fiscalização de grãos (Figura 5). Entretanto, uma parte dos produtos agrícolas consumidos produzidos no Brasil não passam por analises de qualidade, devido ao grande volume de produtos amostrados. Métodos rápidos e preventivos de detecção de fungos micotoxigênicos são importantes para a análise de qualidade eficiente dos produtos agrícolas brasileiro.
Apesar de ser amplamente utilizada para a analise de qualidade de grãos, a cromatografia não identifica fungos potencialmente produtores de aflatoxinas, somente a
toxina. Resultados negativos quanto à presença de aflatoxinas devem ser considerados, pois podem apresentar resultados positivos no seu destino final. Isto ocorre porque durante o transporte, normalmente por via marítima, as condições podem se tornar favoráveis ao desenvolvimento de fungos micotoxigênicos e a síntese de toxinas, que passam despercebidos durante as análises (Freire et al., 1996).
Figura 5: Localizações de laboratórios credenciados pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento), ANVISA, e outros (Midorikawa, 2009).
1.5.4 Detecção Imunológica de micotoxinas
Devido a biotecnologia avançada, testes baseados em anticorpos altamente específicos estão disponibilizados comercialmente para medição de aflatoxinas em alimentos em menos de dez minutos.
Métodos imunológicos para a detecção de AFB1 pode ser Radio imunoensaio de fase
sólida (RIA), coluna de imunoafinidade ou ELISA (Enzyme linked immune-sorbent assay). 1. LACQSA!(MAPA)! 2. Ministério!da!Agricultura! 3. FUNDAÇÃO! EZEQUIEL! DIASIFUNED! 1. CTAA/EMBRAPA! 2. INCQS/FIOCRUZ! 1. LAMIC!–!UFSC!(MAPA)!
2. FUNDAÇÃO! UNIVERSIDADE! DO! RIO!GRANDEILab.!Micotoxinas! 3. CENTRO! DE! DIAGNÓSTICO! E!
PESQUISA! EM! PATOLOGIA! AVIÁRIAICDPA!
!
1. Grãos!&!Alimentos!(MAPA)! 2. JLA!Brasil!(MAPA)! 3. SFDK!(MAPA)! 4. SGS!do!Brasil!(MAPA)! 5. CERELAB!(MAPA)! 6. LAN/ESALQ/USP!(MAPA)! 7. ITALIANALI!(Anvisa)!8. Instituto! de! Ciências! BiomédicasI USP!
9. E.S.A.!LUIZ!DE!QUEIROZIUSP! 10. INSTITUTO!ADOLFO!LUTZ!
11. FACULDADE! DE! ENGENHARIA! DE!