Análises estatísticas

As análises foram realizadas utilizando o programa Statistica 12 (StatSoft Inc., Tulsa, OK) e todos os dados são apresentados como média ± erro padrão. A

normalidade dos dados foi averiguada pelo teste de Shapiro Wilk e a comparação das concentrações musculares de IGF-1 entre os grupos foram realizadas pela análise de variância (ANOVA one-way), seguido pelo post hoc de Duncan. ANOVA para medidas repetidas, seguido pelo post hoc de Duncan foi aplicado para análise da variação da massa corporal ao longo da PS. O teste T foi utilizado para comparar as concentrações de IGF-1 muscular entre as patas lesionada e sadia. O teste de correlação de Person foi utilizado para analisar a associação entre PCNA e testosterona. Para todas as análises foi considerado α = 5%.

3.2 Resultados

A massa corporal dos animais reduziu com a PS, nos grupos PS96 e PS96+R foi observado redução de 31±4 g e 25±2 g, respectivamente (P<0,001), enquanto que os grupos CTL e CTL+R permaneceram estáveis (F(3,29)=37.892, P<0,001). Após o

rebote de sono, o grupo PS96+R mostrou uma tendência de recuperação da massa corporal comparado ao grupo PS96 (328 x 308 g, respectivamente, P=0,062). A massa do músculo TA reduziu na pata lesionada quando comparada à pata sadia em todos os grupos (P<0,01), exceto para o grupo PS96 (P=0,3) (F(3,56)=0.98510, P=0,01).

A massa do músculo TA da pata sadia foi menor nos grupos PS96 (P<0,01) e PS96+R (P<0,01) comparado ao CTL, além disso, o grupo PS96+R apresentou maiores valores que o grupo PS96 (P=0,002) (F(3,28)=23.358, P<0,001). A massa muscular das

patas lesionadas entre os grupos mostrou redução no grupo PS96 (P<0,001) e PS96+R (P=0,002), mas nenhuma diferença foi observada entre os grupos privados de sono. (P=0,79), assim como observado na pata sadia (figura 9).

Figura 9. Massa muscular do músculo tibial anterior. Os dados foram normalizados pela massa

corporal. Médias com diferentes letras são estatisticamente significantes (P≤0,05).

M a s s a d o T ib ia l A n t e r io r ( m g ) C T L P S 9 6 C T L + R P S 9 6 + R 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 P a ta s a d i a P a ta le s io n a d a A B C C C A B B

As comparações entre grupos do IGF-1 muscular da pata sadia mostrou concentrações reduzidas nos grupo PS96 comparado aos demais grupos

(F(2,21)=13.464, P<0,001 para todos). Na pata lesionada, foi observado redução do

IGF-1 muscular nos grupos PS96 (P<0,001), PS96+R (P<0,001) e CTL+R (P<0,001) quando comparado ao CTL (F(3,28)=12.150, P<0,001). As concentrações de IGF-1

muscular aumentaram na pata lesionada quando comparada à pata sadia em todos os grupos (CTL, t = -4,81, P=0,001; PS96, t= -4.21, P=0,001; CTL+R, t= -4.81, P=0,001; PS96+R, t= -2.85, P=0,007). As variações (Δ) de IGF-1 (pata lesionada – pata sadia) foi maior no grupo CTL quando comparado aos demais grupos e o grupo CTL+R apresentou valores superiores ao grupo PS96+R (P<0.05), embora as porcentagens de variação sejam semelhantes nos grupos experimentais comparados aos respectivos controles (CTL x PS96 e CTL+R x PS96+R). Os dados do IGF-1 muscular podem ser vistos na tabela 1.

Tabela 1. Variação de IGF-1 muscular IGF-1 muscular (ng/dL)

Grupos Pata sadia Pata lesionada Δ (%)

CTL 816±105 3851±249#a _472±44

PS96 356±27* 1442±256a _426±80

CTL+R 990±101 2307±182a _245±28b

PS96+R 776±69 1605±260 a _209±28b

* Diferente de todos os grupos referente à pata sadia, # _{diferente de todos os grupos referente à pata}

lesionada, a _{diferente da pata sadia do mesmo grupo,} b _{Diferente dos grupos CTL e PS96.}

A análise de western blot mostrou que todos os grupos aumentaram a expressão de PCNA na pata lesiona quando comparada à pata sadia (F(7,32)=7.1682,

P<0,001; Figura 10) e as variações são similares nos grupos experimentais quando comparados aos seus respectivos controles (CTL x PS96 e CTL+R x PS96+R).

As concentrações de corticosterona foram maiores no grupo PS96 (P<0,001) em relação aos demais grupos (F(3,28)=17.058,p<0,001, [Figura 11A]) e a testosterona foi reduzida nesse mesmo grupo (P<0,001) quando comparado aos demais grupos (F(3,28)=4.3322, p=0,008, [Figura 11B]). A correlação de Pearson não mostrou associação entre testosterona e PCNA em ambas as patas (pata sadia: r=- 0.41, P=0,83; pata lesionada: r=0.14, P=0,61).

Figura 10. Análise de western blot para a proteína PCNA. Médias com diferentes letras são

significantemente diferentes (P≤0,05).

Os achados histopatológicos são apresentados na figura 12. No grupo CTL, a avaliação histopatológica revelou áreas de degeneração muscular, presença de processo inflamatório agudo e atrofia muscular (Figura 12A). O mesmo ocorreu no grupo CTL+R, porém em menor magnitude comparado ao grupo CTL (Figura 12E). No grupo PS96 foram encontradas as mesmas alterações na maioria dos animais, com áreas de degeneração muscular, presença de processo inflamatório agudo e atrofia muscular, sem alterações em magnitude quando comparado ao grupo CTL (Figura 12C). C o r t ic o s t e r o n a p la s m á t ic a ( n g /d L ) C T L P S 9 6 C T L + R P S 9 6 + R 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 b a a a A T e s to s te r o n a T o ta l (n g /d L ) C T L P S 9 6 C T L + R P S 9 6 + R 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 a b b b B

Figura 11. (A) Concentrações de corticosterona plasmática, (B) concentrações séricas de testosterona

total. Médias com diferentes letras são significantemente diferentes (P≤0,05).

Interessantes achados foram encontrados nos animais submetidos à PS e subsequente rebote (PS96+R), como a recuperação parcial da degeneração muscular e minimização do processo inflamatório quando comparado ao grupo PS96, mas pode-se observar atraso no processo regenerativo, comparado ao seu respectivo

P C N A U n id a d e a r b it r á r ia C T L P S 9 6 C T L + R P S 9 6 + R 0 1 2 3 4 P a t a s a d i a P a t a l e s i o n a d a A _A A G A P D H P C N A G A P D H P C N A 3 6 k D a 3 7 k D a 3 7 k D a 3 6 k D a A B C B B C C

controle (grupo CTL+R), com aumento do tecido conectivo e fibras musculares de menor calibre (Figura 12 G). A pata sadia mostrou total integridade das estruturas em todos os grupos, mas a presença de fibras de menor calibre puderam ser observadas (figuras 12 D e H) nos grupos privados de sono quando comparadas aos seus respectivos controles (Figuras 12 B e F, respectivamente).

Figura 12. Fotomicrografias do músculo tibial anterior, coradas com HE, magnificação de 40x. (Setas)

degeneração muscular, (asterisco) processo inflamatório agudo, (#) células multinucleadas, com centralização de núcleos. As imagens A, B, C e D são referentes a 7 dias após a indução da criolesão (imediatamente após 96 h de privação de sono e seu respectivo controle) e as imagens E, F, G e H são referentes à 11 dias após a indução da criolesão (após 96 h de rebote de sono e seu respectivo controle).

3.3 Discussão

Os achados do presente estudo confirmam a hipótese inicial, demonstrando pela primeira vez que a PS prejudica a recuperação de lesões musculares em ratos. Além disso, a PS reduz as concentrações do IGF-1 muscular e minimiza o seu aumento após a criolesão. A expressão da PCNA foi analisada como marcador da iniciação de proliferação celular, mas nós observamos que a sua expressão não é influenciada pela PS.

A análise do IGF-1 muscular mostrou o efeito deletério da PS sobre o músculo sadio e lesionado, além da capacidade da recuperação do sono em normalizar as concentrações de IGF-1. Até o momento, apenas a redução do IGF-1 circulante havia sido demonstrada com a PS, mas há uma regulação intrínseca no musculoesquelético que poderia responder de forma distinta à PS (Adams and McCue, 1998). Além disso, o presente estudo demonstrou que o IGF-1 muscular reduziu com a PS, assim como as concentrações circulantes (Everson and Crowley, 2004, Monico-Neto et al., 2015a, Monico-Neto et al., 2015b), demonstrando que os mecanismos musculares intrínsecos estão associados com a redução do IGF-1 com a PS (Monico-Neto et al., 2015a).

Conforme o esperado em um processo regenerativo, houve um aumento das concentrações de IGF-1 da pata lesionada; entretanto, observou-se a minimização desse aumento no grupo PS96, que poderia ser explicada pelos altos níveis de citocinas pró-inflamatórias e corticosterona (Kimoff et al., 2011, Yehuda et al., 2009, Adams, 2002, Suchecki and Tufik, 2000, Fan et al., 1996). Diversos mecanismos podem ser ativados pelo IGF-1 em um processo de regeneração muscular, entre eles estão as atividades mitogênica e miogênica. A atividade mitogênica pode ocorrer pela sinalização Ras-Raf para a extracelular response kinases (ERKs), resultando na proliferação celular. A atividade miogênica pode ser ativada pela PI3K, resultando na fosforilação das proteínas eukariotic initiation factor-4-binding protein (4EBP1) e proteína ribossomal de 70 kDa (p70S6k), estimulando a síntese de novas proteínas (Adams, 2002, Coolican et al., 1997). Assim, a redução de IGF-1 poderia explicar o atraso do processo de regeneração muscular observado nas análises histopatológicas do grupo PS96+R e poderia ser alvo de intervenção para minimizar esses efeitos, como previamente sugerido (Monico-Neto et al., 2015a).

Assim como o IGF-1, as concentrações séricas de testosterona também reduziram com a PS, que poderia ser explicado pelo aumento das concentrações de

corticosterona, uma vez que ambos os hormônios competem pelo mesmo receptor e, além disso, a corticosterona induz apoptose nas células de Leydig, que são produtoras de testosterona (Mayer and Rosen, 1975, Mayer and Rosen, 1977). Quando os animais foram submetidos ao rebote de sono, as concentrações de IGF-1 retornaram aos valores basais, assim como demonstrado previamente com a corticosterona e a testosterona (Andersen et al., 2005, Dattilo et al., 2012).

A massa muscular da pata sadia apresentou o mesmo resultado observado em um estudo prévio, com a atrofia do músculo TA nos animais privados de sono, com parcial recuperação após o rebote de sono (Dattilo et al., 2012). Por outro lado, na pata lesionada, houve atrofia muscular com a PS, mas o período de 96 h de rebote de sono não foi suficiente para restabelecer a massa muscular, mesmo que parcialmente. A somatória de fatores catabólicos e inflamatórios induzidos pela lesão muscular e pela PS poderia minimizar a capacidade adaptativa do musculoesquelético e prejudicar o ganho de trofismo muscular nesse estágio da regeneração, através da ativação de vias de degradação ou inibição das vias de síntese proteica (Dattilo et al., 2011, Dattilo et al., 2012).

Sabe-se que alguns métodos de PS, como o método da plataforma única (Jouvet et al., 1964), onde os animais permanecem isolados sobre uma única plataforma em um espaço e mobilidade restritos, poderia reduzir o estresse mecânico das fibras musculares e alterar os mecanismos biomoleculares envolvidos na síntese e degradação de proteínas musculares. Para controlar estressores adicionais impostos pelo modelo (isolamento social e imobilidade), houveram duas adaptações do modelo da plataforma única. Primeiro, van Hulzen e Coenen (1981) introduziram diversas plataformas em um tanque, permitindo que o animal se desloque pelas plataformas, evitando a imobilidade, sendo chamado de método das plataformas múltiplas (van Hulzen and Coenen, 1981). Anos mais tarde, Suchecki e Tufik (2000) aplicaram uma segunda adaptação, colocando um grupo de animais socialmente estáveis em um tanque com diversas plataformas, reduzindo o estresse originado pelo isolamento social que os animais eram submetidos nos modelos descritos acima. Dessa forma, foi originado o método modificado das plataformas múltiplas, com melhor controle de estressores induzidos pelos primeiros modelos propostos, a imobilidade e o isolamento social. Considerando que a imobilidade é um fator que poderia prejudicar a regeneração muscular, o método modificado das plataformas múltiplas foi utilizado (Suchecki and Tufik, 2000).

O presente estudo demonstrou o aumento da expressão da proteína PCNA após 7 dias do procedimento de criolesão nos grupos CTL e PS96 e após 11 dias nos grupos CTL+R e PS96+R, sem apresentar qualquer influência da PS. O aumento da expressão de PCNA pode ser apontada como o primeiro sinal de proliferação celular, coincidindo com o início da fase S do ciclo celular (Johnson and Allen, 1993). Seu pico ocorre em torno de 3-5 dias após uma lesão muscular e tende a reduzir em torno de 10-14 dias em diferentes protocolos (Richard-Bulteau et al., 2008, Duguez et al., 2002). Um estudo prévio monstrou a influência da testosterona sobre a expressão de PCNA (Coolican et al., 1997), mas essa associação não foi demonstrada no presente estudo. Para um melhor entendimento, futuros estudos são necessários com menor tempo entre as análises (ex: 24, 48, 72 h de PS). Outro fator que poderia prejudicar a compreensão da cinética da PCNA é a impossibilidade de privar animais de sono imediatamente após a indução da lesão muscular, devido aos princípios éticos relacionados ao bem-estar animal.

O aumento da PCNA e do IGF-1 no músculo lesionado, junto com a presença da centralização dos mionúcleos, recuperação parcial da degeneração muscular e minimização do processo inflamatório, sugere a ativação de células satélites, proliferação e diferenciação de mioblastos nas fibras musculares dos grupos submetidos ao rebote de sono (Duguez et al., 2002). Entretanto, o aumento do tecido conectivo e menores fibras musculares indicam um atraso na regeneração muscular nos animais previamente privados de sono. Embora o tempo de rebote de sono não tenha sido o suficiente para recuperar o atraso no processo regenerativo no grupo PS96+R, nós acreditamos que recuperar o sono após um período de PS é essencial para o processo de regeneração muscular, uma vez que as concentrações de hormônios anabólicos (IGF-1 e testosterona) e corticosterona retornam aos níveis basais com 96 h de rebote de sono. Assim, a avaliação por um tempo maior poderia detalhar todas as fases do processo de regeneração até sua total resolução.

Assim, podemos concluir que a PS prejudica o processo de regeneração muscular em ratos, reduz as concentrações de IGF-1 muscular e minimiza seu aumento no músculo lesionado. A recuperação do sono por 96 h foi capaz de restaurar as concentrações basais dos fatores de crescimento e da corticosterona, mas não foi o suficiente para normalizar o processo de regeneração muscular.

ARTIGO 2

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4 ARTIGO 2

“Efeitos da corticosterona nas alterações histopatológicas e no dano oxidativo nos diferentes tipos de fibras musculares induzidos pela privação de sono”.

Marcos Mônico-Neto, Kil Sun Lee, Márcio Henrique Mello da Luz, Jéssica Monteiro Volejnik Pino, Daniel Araki Ribeiro, Caroline Margonato Cardoso, Hanna Karen Moreira Antunes.

4.1 Métodos