ADAPTAÇÕES MUSCULARES INDUZIDAS PELA PRIVAÇÃO DE
SONO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
São Paulo 2018
ADAPTAÇÕES MUSCULARES INDUZIDAS PELA PRIVAÇÃO DE
SONO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Hanna Karen Moreira Antunes
Co-orientadora: Profa. Dra. Kil Sun Lee
São Paulo 2018
Mônico-Neto, Marcos
Adaptações musculares induzidas pela privação de sono / Marcos
Mônico-Neto.- São Paulo, 2018. xxiv, 75f.
Tese – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
Muscle adaptations induced by sleep deprivation.
1. Privação de Sono; 2. Regeneração Muscular; 3. Atrofia Muscular; 4. Estresse Oxidativo; 5. Fatores de Crescimento.
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Chefe do Departamento: Prof. Dr. José Carlos Fernandes Galduróz
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EFEITOS DA PRIVAÇÃO DE SONO PARADOXAL NO
METABOLISMO E NA REGENERAÇÃO MUSCULAR DE RATOS
Presidente da banca:
Profa. Dra. Hanna Karen Moreira Antunes
Banca examinadora:
Profa. Dra. Camila Aparecida Machado de Oliveira
Profa. Dra. Luciana Le Sueur Maluf
Prof. Dr. Sérgio Gomes da Silva
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Este trabalho foi realizado no Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP/EPM, com o apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), da Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP), da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2013/00152-5) e do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq).
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estrutura familiar que se dedicou para que eu obtivesse êxito. Assim, dedico este documento à minha família, que me apoiou em todos os momentos dessa trajetória.
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O resultado de um projeto de pesquisa não é mérito de uma única pessoa, mas sim de um grupo de pessoas que trabalham arduamente para que seja concluído. As dificuldades são inevitáveis e o processo difícil, mas o convívio com todos os envolvidos tornou tudo prazeroso. O que tive de mais valioso na pós-graduação foi o convívio, essencial para o crescimento pessoal e inúmeras pessoas participaram desse processo, professores, funcionários, colegas, amigos e familiares. Todas essas pessoas me modificaram ao longo dos 10 anos de convívio, fizeram com que a Universidade fosse também a minha casa e me sinto privilegiado por essa experiência tão incrível. Assim, faço meus sinceros agradecimentos...
Agradeço à minha orientadora, Profa. Hanna Karen, que generosamente me deu a oportunidade de fazer parte do seu grupo, compartilhou os seus conhecimentos e direcionou a minha formação. Tive sua confiança e apoio nos bons e maus momentos. Foram mais de 10 anos de convívio, onde se formou mais que um vínculo entre aluno e professor, mas a amizade e cumplicidade para a vida toda. Durante esses anos, tivemos diversas dificuldades, mas ao olhar para trás, percebo o quanto nos modificamos, fruto de muito trabalho e aprendizado. Cabe ressaltar que formamos uma ótima dupla para as viagens após os congressos!
À minha co-orientadora Profa. Kil Sun Lee, pessoa amável, dedicada, competente e exemplar nas suas condutas. Teve a generosidade de me ensinar as técnicas laboratoriais de forma criteriosa, além dos ensinamentos éticos que são aplicáveis na vida acadêmica e pessoal. Definitivamente é uma pessoa a se espelhar. Tais qualidades se refletem em seus alunos, Márcio Henrique Mello da Luz e Jéssica Monteiro Volejnick Pino, que me auxiliaram nos experimentos, sempre com muita disposição, qualidade e sempre amáveis no convívio. Essas pessoas compartilharam seus conhecimentos para que esse estudo pudesse ser concluído.
À minha esposa, Raquel Munhoz da Silveira Campos Mônico, pelo seu apoio incondicional, sempre amável e correta. Junto dela, renovo minhas energias e construo sonhos. Caminhamos juntos na pós-graduação há mais de 10 anos e nesse tempo, tive um excelente exemplo a ser seguido. Obrigado por conquistar
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Ao prof. Ronaldo Vagner Thomatieli dos Santos, pelo apoio na pós-graduação, pela amizade e ensinamentos cedidos ao longo de tantos anos. Agradeço pela confiança depositada em mim, pelo apoio no egresso do processo de doutoramento e pela sua dedicação, que tanto contribuiu para minha formação.
Ao prof. Daniel Araki Ribeiro e sua aluna Verônica Yujra, pela amizade, parceria e grande troca de conhecimento ao longo desses anos.
Aos amigos/colegas de grupo, que foram tantos. Poderia cita-los como velha-guarda e recém-chegados. Alguns professores da especialização, que se tornaram colegas de pós-graduação, que compartilharam tantos conhecimentos no dia-a-dia, nas reuniões científicas e na cadeira do boteco. Foram verdadeiros amigos, que se apoiaram nos momentos difíceis e comemoraram as vitórias juntos. Tudo começou com um grupo pequeno, Hanna Karen, Murilo Dáttilo, eu e Helton de Sá Souza, dos quais os dois primeiros, iniciaram a idealização desse trabalho e de outros. Assim, foi possível que os demais continuassem com suas trajetórias, auxiliados pela chegada de outros bons amigos, Jorge Fernando Tavares de Souza, Sara Quáglia de Campos Giampá, Camila Maria de Melo. Agradeço a esses bons amigos, pelo convívio divertido e intelectualmente produtivo, sempre serão meus parceiros.
Aos novos colegas de grupo, que possuem grande energia para continuar com o que foi iniciado há alguns anos. Que me ouviram e sugeriram nas reuniões, de forma extremamente amável e produtiva. São eles: Cyro, Mário, Carina, Stephanie, Amaury (esse é da velha-guarda), Henrique e Bruna.
Aos funcionários da Unifesp e da AFIP, que sempre foram tão solícitos e agradáveis no convívio. Não há um só deles que não me auxiliou em algum momento, para que pudesse executar esse estudo e todas as exigências do doutorado. Funcionários da portaria, secretaria, limpeza, manutenção e biotérios trabalharam rigorosamente para manter o ambiente organizado, limpo e seguro. Além disso, ampliaram minha rede de amizade e tornaram tudo mais agradável.
Agradeço aos meus familiares, que me apoiaram incondicionalmente em todos os momentos dessa etapa. O suporte familiar me deu segurança e incentivo para prosseguir e decidir pelas condutas corretas.
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“Ninguém caminha sem aprender a caminhar, sem aprender a fazer o caminho, refazendo e retocando o sonho pelo qual se pôs a caminhar”.
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A disposição estrutural do presente trabalho segue uma nova tendência da pós-graduação na área de saúde, a qual destaca a confecção de artigos a serem publicados em periódicos especializados. Este processo vem ocorrendo há alguns anos na Universidade Federal de São Paulo e diversas dissertações de mestrado e teses de doutorado já foram apresentadas com esta nova distribuição de conteúdo. Assim, os resultados e discussão da presente tese serão apresentados em forma de 2 artigos científicos. Na expectativa de ter elaborado um documento que satisfaça o novo modelo de tese que vem se compondo e que tem como ponto central os artigos científicos, espera-se possibilitar uma leitura completa e satisfatória e ao mesmo tempo divulgar o presente trabalho na comunidade científica nacional e internacional.
O artigo científico 1, que compõem a presente tese, foi previamente publicado e encontram-se disponível na íntegra no Apêndice 2, já o artigo científico 2 será submetido à publicação no futuro.
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Dedicatória ...
Agradecimentos ... vii
Lista de Figuras ... xiii
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos... xv
Resumo ... xx
Abstract ... xxi
1. INTRODUÇÃO ...
22. REVISÃO DA LITERATURA ...
62.1 Sono e privação de sono ... 6
2.2 Respostas metabólicas durante a privação de sono ... 13
2.3 Adaptações musculares ao estresse celular ... 16
2.4 Regeneração muscular ... 22
2.5 Adaptações musculares à privação de sono ... 25
2.6 Objetivos... 29 2.6.1 Objetivo geral ... 29 2.6.2 Objetivos específicos ... 29
3. ARTIGO 1 ...
31 3.1 Método ... 31 3.1.1 Criolesão ... 323.1.2 Privação de sono paradoxal ... 32
3.1.3 Análises sanguíneas ... 34
3.1.4 Processamento dos tecidos ... 34
3.1.5 Western Blot ... 35 3.1.6 Análises estatísticas ... 35 3.2 Resultados ... 36 3.3 Discussão ... 40
4. ARTIGO 2 ...
44 4.1 Métodos ... 44 4.1.1 Animais e grupos ... 44 4.1.2 Privação de sono ... 444.1.3 Preparação e administração da droga ... 45
4.1.4 Extração dos tecidos ... 46
4.1.5 Imuno-histoquímica ... 46
4.1.6 Análises histomorfológicas ... 47
4.1.7 Peroxidação lipídica ... 47
4.1.8 Isolamento da atividade mitocondrial ... 48
4.1.9 Atividade lisossomal ... 48
4.1.10 Análises estatísticas ... 48
4.2 Resultados... 49
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ANEXOS
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Figura 1
Modelo de movimentação contínua para privação de
sono ... 9
Figura 2 Esquema do aparato (vista superior) para privação de sono do modelo disk on water (DOW) ... 10
Figura 3 Modelo modificado das plataformas múltiplas (MMPM) .... 11
Figura 4 Fases da síndrome da adaptação geral, proposto por Hans Selye, 1936 ... 14
Figura 5 Estrutura mitocondrial e a produção de espécies reativas mitocondriais ... 19
Figura 6 Inflamação e regeneração muscular ... 24
Figura 7 Efeitos da privação de sono sobre o musculoesquelético. 27 Figura 8 Desenho experimental (artigo 1) ... 33
Figura 9 Massa muscular do músculo tibial anterior ... 36
Figura 10 Análise de western blot para a proteína PCNA ... 38
Figura 11 A e B (A) Concentrações de corticosterona plasmática; (B) Concentrações de testosterona total ... 38
Figura 12 A-H Fotomicrografias do músculo tibial anterior ... 39
Figura 13 Desenho experimental (artigo 2) ... 46
Figura 14 Concentrações plasmáticas de corticosterona ... 49
Figura 15 A e B (A) Variação da massa corporal a cada 24 h; (B) Delta da massa corporal em 96 h de PS ... 49
Figura 16 A e B (A) Massa muscular do músculo plantar; (B) Massa muscular do músculo sóleo ... 50
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Figura 19 Taxa de consumo de O2 mitocondrial nos músculos
plantar e sóleo ... 52
Figura 20 Fotomicrografia da imunohistoquímica para marcação nuclear de 8OHdG... 53
Figura 21 Atividade da Catepsina L nos músculos plantar e sóleo ... 54
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8OHdG: 8-hidroxi-2-desoxiguanosina
AASM: American Academy of Sleep Medicine Ac: acetil
ACTH: adrenocorticotropic hormone (hormônio adrenocorticotrófico) AFC: amino-4-trifluorometil coumarin
AIC: critério de informações de Akaike Akt: proteína kinase B
ANOVA: análise de variância
ATGL: lipase de triacilglicerol do adipócito AVP: arginina vasopressina
CEDEME: Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia
cm: centímetros
CRH: corticotropin release hormone (hormônio liberador de corticotrofina) CTL: grupo controle
CTL+R: CTL mais período de recuperação de sono Cu: cobre
DAB: diaminobenzidina
DNA: deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico) DNPH: 2,4 dinitrofenilhidrazina
DOW: disk on water (disco sobre a água)
EDTA: ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etienodiamina tetracético) EEG: eletroencefalografia
ELISA: ensaio de imunoabsorção enzimática EMG: eletromiografia
ERK’s: extracelular response kinases ERN: espécies reativas de nitrogênio ERO’s: espécies reativas de oxigênio FR: fenilalanina/arginina
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GH: growth hormone (hormônio do crescimento)
GHRH: Growth hormone releasing hormone (hormônio liberador de GH) GPx: glutationa peroxidase
GzLM: modelo linear generalizado h: horas
H2O2:peróxido de hidrogênio HE: hematoxilina e eosina
HHG: hipotálamo-hipófise-gonadal
HPA: hypothalamic-pituitary-adrenal (hipotálamo-hipófise-adrenal) HSL: hormônio lipase-sensível
Hz: hertz
IGF-1: fator de crescimento semelhante à insulina-1 IL-1: interleucina-1
IL-10: interleucina-10 IL-12: interleucina-12 IL-13: interleucina-13 IL-1β: interleucina-1 beta IL-4: interleucina-4 IL-6: interleucina-6 IL-8: interleucina-8 L: litros
LC3: proteína cadeia leve 3 da proteína 1 associada a microtúbulos M: molar
M1: macrófago tipo M1 M2: macrófago tipo M2
MAFbx: muscle atrophy F-box ou atrigin-1 MDA: malondialdeído
MET: metirapona
mg/kg: miligramas por quilograma mg: miligramas
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mmol: milimol
MMPM: método modificado das plataformas múltiplas Mn: manganês
MnSOD: manganês superóxido desmutase
mTOR: mechanistic target of rapamycin kinase (alvo mecânico de rapamicina) MURF-1: Muscle RING-Finger-1
ng/dL: nanogramas por decilitros nM: nanomolar
Nº: número NO•: oxido nítrico
NREM: non-rapid eye movements (sem movimentos rápidos dos olhos) O2: oxigênio
O2•−: superóxido ºC: graus Celsius OH•: radical hidroxila ONOO−: peróxido nitrito
p62/SQSTM1: sequestossomo 1
p70S6K: proteína ribossomal S6 kinase de 70 kDa PBS: tampão fosfato-salina
PCNA: Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) pH: potencial hidrogeniônico
PI3K: fosfatidil inositol 3 kinase PS: privação de sono
PS+MET: grupo privação de sono tratado com metirapona PS+VEI: grupo privação de sono tratado com veículo PS96: grupo privação de sono por 96 h
PS96+R: privação de sono por 96 h mais 96h de recuperação de sono PSG: polissonografia
PVDF: membrana de fluoreto de polivinilideno
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REM: rapid eye movements (movimentos rápidos dos olhos) RFU: unidade relativa de fosforecência
RG: receptor de glicocorticoide rpm: rotações por minuto
SAL: sistema autofagia-lisossomal Snf1: sucrose non-fermenting 1 SNS: sistema nervoso simpático SOD: superóxido desmutase
Sono N1: estágio N1 do sono NREM Sono N2: estágio N2 do sono NREM Sono N3: estágio N3 do sono NREM
SS1: fase SS1 do sono de ondas lentas de ratos
SS2: fase SS2 do sono de ondas lentas de ratos
SS3: fase SS3 do sono de ondas lentas de ratos
SUP: sistema ubiquitina-proteassomo TA: músculo tibial anterior
TAD: tibial anterior danificado TAS: tibial anterior sadio TBARS: ácido tiobarbitúrico
TGF- β1: fator de transformação do crescimento β1 TNF- α: fator de necrose tumoral-α
Tregs: células T regulatórias u.a.: unidade arbitrária
UCP1: proteína desacopladora 1
UNIFESP: Universidade Federal de São Paulo v/v: volume/volume
VEI: veículo Zn: zinco Δ: variação %: porcentagem
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Objetivos: Avaliar os efeitos da privação e da recuperação de sono no processo de regeneração muscular e nas concentrações musculares de IGF-1 em ratos submetidos à criolesão. O presente estudo também avaliou as alterações histopatológicas, o dano oxidativo e os efeitos modulatórios da corticosterona em diferentes tipos de fibras musculares de ratos privados de sono. Métodos: Ratos machos, Wistar, com 3 meses de idade, foram submetidos à criolesão do músculo tibial anterior e após, 4 grupos foram estabelecidos: grupo controle (CTL, n=8), grupo privação de sono por 96h (PS96, n=8), grupo CTL+ período de recuperação de sono (CTL+R, n=8) e grupo PS96+período de recuperação de sono por 96h (PS96+R, n=8). Os grupos PS96 e PS96+R foram submetidos à privação de sono por 96 h e ao final, o grupo PS96+R permaneceu por mais 96 h com sono ad libitum. Os grupos controles permaneceram nas caixas moradias pelo mesmo período de privação de sono e recuperação de sono. Foram analisadas as concentrações de IGF-1 muscular, o perfil hormonal (testosterona e corticosterona), a expressão da proteína PCNA e o padrão histopatológico do músculo tibial anterior. Um segundo experimento distribuiu animais da mesma linhagem e idade em três grupos, sendo o grupo CTL tratado com veículo (CTL, n=10), grupo PS tratado com metirapona (PS+MET, n=10) e o grupo PS tratado com veículo (PS+VEI, n=10). A droga metirapona é inibidora da síntese de corticosterona e o propilenoglicol foi utilizado como veículo. Foram analisados o músculo sóleo (fibras oxidativas) e o músculo plantar (fibras glicolíticas) quanto ao padrão histopatológico, o dano oxidativo, a atividade mitocondrial e lisossomal. Resultados: A privação de sono reduziu o IGF-1 muscular, minimizou seu aumento no músculo lesionado e a recuperação do sono foi eficaz para restabelecer as concentrações dos fatores de crescimento. Foi observado um atraso no processo de regeneração muscular nos animais do grupo PS96+R quando comparado ao grupo CTL+R. Ao comparar os diferentes tipos de fibras musculares, foi observado processos patológicos nos animais privados de sono, em ambos os músculos analisados (sóleo e plantar), sendo mais intensos no músculo sóleo, com edema intersticial e degeneração celular. O dano oxidativo foi observado em ambos os músculos, sendo mais intenso no músculo sóleo. O dano oxidativo e a atividade lisossomal aumentaram no grupo PS+VEI, apenas no músculo sóleo e a atividade lisossomal aumentou no grupo PS+MET, apenas no músculo plantar. Conclusões: A privação de sono prejudica o processo de regeneração muscular em ratos e reduz as concentrações de IGF-1 muscular. A recuperação do sono restaurou o padrão hormonal, mas não foi o suficiente para normalizar o processo de regeneração muscular. As alterações histopatológicas induzidas pela privação de sono no musculoesquelético ocorreram de acordo com o tipo de fibra muscular, sendo que as fibras do tipo I sofreram maior dano oxidativo. Além disso, os dados sugerem que a corticosterona potencializa o dano oxidativo no músculo sóleo e o tipo de fibra muscular parece ser determinante para o desfecho dos efeitos da corticosterona durante a privação de sono.
Palavras-chave: Privação de sono, atrofia muscular, regeneração muscular, estresse oxidativo e fatores de crescimento.
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Aims: To evaluate the effects of sleep deprivation and recovery on the muscle regeneration process and muscle IGF-1 concentrations in rats submitted to cryolesion. The present study also evaluated the histopathological changes, oxidative damage and the modulatory effects of corticosterone on different types muscle fibers in sleep deprived rats. Methods: Male Wistar rats, 3-month-old, were submitted to cryolesion of the anterior tibial muscle and after 4 groups were established: control group (CTL, n=8), sleep deprivation group for 96h (SD96, n=8), group CTL + sleep recovery period (CTL+R, n=8) and SD96 + sleep recovery period for 96h (PS96+R, n=8). The SD96 and SD96+R groups were submitted to sleep deprivation for 96h and in the end; the PS96+R group remained for another 96h with sleep ad libitum. Control groups remained in the housing box for the same period of sleep deprivation and sleep recovery. The muscle IGF-1, hormone profile (testosterone and corticosterone), PCNA protein expression and histopathological changes of the
tibialis anterior muscle were analyzed. A second experiment distributed animals of
the same lineage and age into three groups, the CTL group treated with vehicle (CTL, n = 10), SD treated with metyrapone (SD+MET, n=10) and SD treated with vehicle (SD+VEI, n=10). The metyrapone drug is corticosterone synthesis inhibitor and propyleneglycol was used as vehicle. The soleus muscle (oxidative fibers) and
plantaris muscle (glycolytic fibers) were analyzed for histopathological pattern,
oxidative damage, mitochondrial and lysosomal activity. Results: Sleep deprivation reduced muscle IGF-1, minimized its increase in the injured muscle, and sleep recovery was effective in restoring growth factor concentrations. A delay in the muscle regeneration process was observed in the animals of the SD96+R group when compared to the CTL+R group. When comparing the different types muscle fibers, pathological processes were observed in sleep deprived animals, in both analyzed muscles (soleus and plantaris), being more intense in the soleus, with interstitial edema and tissue degeneration. Oxidative damage was observed in both muscles, being more intense in the soleus muscle. Oxidative damage and lysosomal activity increased in the SD+VEI group only in the soleus muscle and, lysosomal activity increased in the SD+MET group only in the plantaris muscle. Conclusions: Sleep deprivation impairs the muscle regeneration process in rats and reduces muscle IGF-1 concentrations. Sleep recovery restored the hormonal pattern, but it was not enough to normalize the process of muscle regeneration. Histopathological changes induced by sleep deprivation in the skeletal muscle occur according to the type of muscle fiber, and type I fibers undergo greater oxidative damage. In addition, the data suggest that corticosterone potentiates oxidative damage in the soleus muscle and muscle fiber type seems to be determinant for the outcome of corticosterone effects during sleep deprivation.
Key words: Sleep deprivation, muscle atrophy, muscle regeneration, oxidative stress and growth factors.
1 INTRODUÇÃO
A privação de sono (PS) tem sido apontada como prejudicial ao musculoesquelético. Estudos em modelos animais demonstraram que a falta de sono reduz as concentrações circulantes do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), do hormônio do crescimento (GH) e da testosterona (Dattilo et al., 2012, Andersen et al., 2005, Everson and Crowley, 2004), além de aumentar as concentrações de glicocorticoides (Torabi-Nami et al., 2013, Hipolide et al., 2006). Considerando as propriedades fisiológicas desses hormônios, um ambiente potencialmente catabólico é gerado com a falta de sono (Yujra et al., 2018, Monico-Neto et al., 2015a, Dattilo et al., 2012, Dattilo et al., 2011, Everson and Crowley, 2004).
O aumento das concentrações de glicocorticoides aumenta a expressão de genes envolvidos com as vias de degradação proteica, como o sistema autofagia-lisossomal (SAL) e o sistema ubiquitina-proteassomo (SUP). Além disso, os glicocorticoides são capazes de reduzir a atividade dos hormônios anabólicos e da principal via de síntese proteica no músculo, a fosfatidilinositol 3 kinase/proteína kinase B (PI3K/Akt). Assim, o aumento das concentrações de glicocorticoides pode simultaneamente reduzir a síntese e aumentar a degradação proteica, sugerindo um efeito deletério da PS sobre o musculoesquelético (Schakman et al., 2013, Dattilo et al., 2011).
A corticosterona é um glicocorticoide e está associada à perda de massa corporal durante a PS, uma vez que ratos tratados com uma droga inibidora da síntese de corticosterona (a metirapona) não apresentaram perda de massa corporal após 96 h de PS (Tiba et al., 2008). Ainda, um estudo mostrou que o treinamento físico prévio por 8 semanas em animais, com posterior PS por 96 h, atenuaram o aumento das concentrações de corticosterona, o que refletiu na atenuação na perda de massa corporal e da atrofia muscular (Monico-Neto et al., 2015a).
Apresar de evidências sugerirem que as concentrações aumentadas de glicocorticoides são responsáveis pelo catabolismo muscular durante a PS, o processo de atrofia muscular pode ser modulado por diversos fatores, sendo alguns deles independentes das concentrações de glicocorticoides. O trofismo muscular pode ser regulado pelo comportamento alimentar, status energético, estímulos mecânicos, fatores pró-inflamatórios e pelo estresse oxidativo (Yakabe et al., 2018, Zhang et al., 2013b, Vainshtein et al., 2014, Mizushima et al., 2008).
O musculoesquelético é rico em mitocôndrias, que são as principais produtoras de espécies reativas de oxigênio (ERO’s) e, devido à atividade contrátil dos músculos, há uma grande produção de ERO’s, além de um sistema antioxidante bastante desenvolvido (Jackson, 2005). Na membrana interna das mitocôndrias há alguns complexos proteicos responsáveis pela dissociação da molécula de oxigênio (O2),
processo que gera radicais livres, que são moléculas capazes de abstrair elétrons e alterar a estrutura de componentes subcelulares, como organelas, proteínas, ácido desoxirribonucleico (DNA) e membranas celulares. O sistema antioxidante é formado por enzimas capazes de neutralizar os radicais livres. Caso a atividade antioxidante seja incapaz de neutralizar os danos estruturais causados pelos radicais livres, um mal funcionamento celular pode ocorrer e ativar vias de degradação do conteúdo celular, como o SAL e a apoptose (Bolisetty and Jaimes, 2013).
Durante a PS, há alguns indicativos de que o sistema oxidativo é sobrecarregado, como o aumento do metabolismo, do consumo de O2 e a redução
dos estoques de gordura, sugerindo maior atividade mitocondrial e maior produção de ERO’s (Monico-Neto et al., 2015b, Koban and Swinson, 2005). Além disso, as concentrações aumentadas de corticosterona poderiam aumentar a taxa de oxidação de gordura, pelo aumento da atividade de enzimas como a lipase de triacilglicerol do adipócito (ATGL) e a hormônio lipase-sensível (HSL) (Campbell et al., 2011).
Estudos prévios demonstram que a PS induz a atrofia muscular nas fibras com metabolismo predominantemente glicolítico (fibras do tipo II), possivelmente pela ação catabólica da corticosterona (de Sa Souza et al., 2016, Monico-Neto et al., 2015a, Dattilo et al., 2012). No entanto, as fibras musculares do tipo I também podem sofrer os efeitos da PS, uma vez que elas possuem maior quantidade de mitocôndrias e produzem maior quantidade de ERO’s (Jackson, 2005). Dessa forma, nós hipotetizamos que a PS aumenta o estresse oxidativo no musculoesquelético e causa danos em ambos os tipos de fibras, mas principalmente nas fibras do tipo I. Além disso, a corticosterona pode modular os efeitos do estresse oxidativo induzidos pela ausência do sono.
Além da atrofia muscular, a modulação negativa exercida pela PS nos fatores de crescimento poderia prejudicar outros mecanismos musculares, como o processo de regeneração tecidual. O musculoesquelético possui grande propriedade plástica, pode moldar seu trofismo de acordo com o status energético e é capaz de se recuperar de diversos tipos de dano, seja ele induzido pela atividade contrátil normal, pelo
exercício físico ou por trauma. Para que isso ocorra, uma série de mecanismos permitem que as células se recuperem ou sejam substituídas por novas células (Vainshtein et al., 2014, Richard-Bulteau et al., 2008).
O processo de regeneração muscular envolve alguns passos que dependem da proliferação, fusão e diferenciação de células satélites, além da síntese proteica (Richard-Bulteau et al., 2008). Vários fatores de crescimento participam desse processo, entre eles, o IGF-1 é conhecido por estimular a proliferação e diferenciação de células satélites e aumentar a síntese de proteínas musculares (Rabinovsky et al., 2003, Florini et al., 1996). Assim, durante a PS, a redução das concentrações de IGF-1 poderia prejudicar a capacidade regenerativa do músculo (Dattilo et al., 20IGF-1IGF-1).
Nesse contexto, o presente trabalho verificou a influência da PS sobre as concentrações de IGF-1 muscular e o processo de regeneração tecidual após a indução de uma lesão, bem como possíveis alterações histopatológicas e o estresse oxidativo em diferentes tipos de fibras musculares. Além disso, investigou-se a influência da corticosterona em processos envolvidos com a atrofia muscular após a PS.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Sono e privação de sono
O sono é um estado complexo e essencial para a manutenção das funções vitais, caracterizado por processos ativos e organizados, definido como um período de quiescência e redução da responsividade aos estímulos externos, com características eletroencefalográficas, fisiológicas e comportamentais distintas do estado de vigília (Roehrs and Roth, 2000). A evolução do conhecimento sobre o sono foi impulsionada a partir de 1929, com o desenvolvimento da eletroencefalografia, que permitiu a identificação de estágios distintos que se diferenciavam pela frequência e amplitude da atividade elétrica cerebral (H, 1929). Anos depois, a identificação de movimentos repentinos dos olhos durante o sono, permitiu sua classificação em duas fases distintas, o sono REM (Rapid Eye Movements) e NREM (Non-Rapid Eye Movements) (Aserinsky and Kleitman, 1953, Dement and Kleitman, 1957). Atualmente, a American Academy of Sleep Medicine (AASM) subdividiu o sono NREM em três estágios distintos, o sono N1, N2 e N3 (Silber et al., 2007).
O estágio N1 é considerado um estado de transição da vigília para o sono (sono leve), preenche cerca de 5% de uma noite de sono e predomina ondas com frequências entre 2 e 7 Hz, de baixa amplitude no eletroencefalograma (EEG), associados à lentificação dos movimentos dos olhos. O estágio N2 representa cerca de 45% a 55% de uma noite de sono, é caracterizado por ondas cerebrais de 7 Hz no EEG, com episódios de ondas de 12 a 14 Hz de curta duração, chamados de fusos do sono. Nessa fase há a presença de um grafo elemento no EEG chamado complexo K, que corresponde a uma onda com componente negativo de alta amplitude, seguido imediatamente por um componente positivo mais lento, com duração de 0.5 a 1 segundo, com amplitude de 100 a 400 µV de pico a pico. O estágio N3, conhecido também como sono de ondas lentas, compreende cerca de 20% de uma noite de sono e é caracterizado por ondas com frequências entre 0.5 e 2 Hz, com amplitude mínima de 75 µV no EEG, além da redução da atividade muscular (Silber et al., 2007).
O sono REM representa cerca de 20% a 25% de uma noite de sono, ocorre com maior frequência e tempo na segunda metade da noite e tem como característica, ondas com frequência mista e de baixa amplitude no EEG. Nessa fase do sono é
observado o aumento da frequência cardíaca, da temperatura cerebral, do consumo de oxigênio e um alto grau de ativação autonômica. A atividade muscular reduzida é uma característica relevante nessa fase do sono, sendo ainda menor comparado ao estágio N3 do sono NREM. O sono REM é também conhecido como sono paradoxal, por apresentar atividade cerebral muito semelhante à vigília e quando um indivíduo é acordado nesse estágio, ele é capaz de se lembrar da atividade onírica em mais de 70% dos eventos (Silber et al., 2007).
Na década de 60 iniciou uma série de estudos sobre o sono de ratos, a partir disso, um grande interesse surgiu nessa espécie, devido à semelhança dos estágios com o sono humano. Os estágios do ciclo vigília-sono do rato podem ser classificados como: vigília atenta ou ativa, vigília relaxada ou quieta, sono de ondas lentas (fases SS1, SS2 e SS3), sono pré-paradoxal e sono paradoxal (ou sono REM) (Timo-Iaria et
al., 1970).
O rato tem o ciclo vigília-sono polifásico, ou seja, ocorrem vários episódios de sono, totalizando quase 50 % ao longo de 24 h. Considerando o tempo total, 62 % do sono ocorre no período claro e 33 % no período escuro do dia, sendo que no período entre 12 e 15 horas há um maior predomínio do estágio paradoxal. O rato dorme cerca de 17 % em sono leve (estágio SS1 e SS2), 21 % em sono profundo (estágio SS3) e
9,4 % em sono paradoxal (Landis et al., 1989, Kleinlogel, 1983, van Luijtelaar and Coenen, 1984).
Inegavelmente o sono exerce grande importância sobre a função fisiológica, uma vez que ele está presente em todo o reino animal e se mantém persistente entre as espécies. A necessidade de dormir é suprema aos riscos que os animais se expõem em períodos recorrentes de redução da consciência. Mesmo com a evolução das pesquisas na área da medicina do sono, com o desenvolvimento do EEG e a introdução de modelos animais, até os dias atuais, as funções do sono não foram totalmente esclarecidas. Algumas teorias foram criadas para tentar explica-las, como a teoria restauradora, que foi sugerida baseada na recuperação ou reversão de processos bioquímicos e fisiológicos que ocorrem durante o período de vigília (Krilowicz et al., 1988). A teoria adaptativa baseou-se no comportamento rítmico, que é acompanhado por um comportamento instintivo para se adaptar às pressões ambientais (Webb, 1974). Em seguida foi sugerido um modelo que incorpora ambas as teorias, restauradora e adaptativa, das quais são considerados aspectos
fisiológicos, psicológicos e ambientais, justificando assim a plasticidade que o sono exibe ao longo da vida e os efeitos da PS (Daan et al., 1984).
Muitas outras teorias foram propostas, mas a falta de parcimônia entre os dados levantados pela literatura, torna difícil estabelecer a função do sono, principalmente porque o sono contribui para várias funções diferentes, o que impede que uma declaração única e sucinta possa contemplar precisamente toda sua abrangência. O sono pode variar de acordo com nível de desenvolvimento de cada classe de organismo e ainda, variações intra-espécies podem ser apontadas, como por exemplo, a sua plasticidade que acompanha a faixa etária em diversas espécies. Embora as funções do sono não sejam totalmente elucidadas, reconhece-se que ele é essencial para a sobrevivência e a PS revela efeitos deletérios ao organismo e contribuem para o melhor entendimento desse processo (Chen W, 2005).
A PS pode ser definida como a remoção parcial ou quase total do sono de um organismo. Até o momento não há um método capaz de remover o sono na sua totalidade. Devido ao aumento da pressão do sono com o prolongamento da vigília, ocorrem períodos de micro sonos, que muitas vezes são muito breves para detectar ou prevenir, sendo uma consequência inevitável com o prolongamento excessivo da vigília. Por esse motivo, não podemos considerar modelo algum como privação total de sono (Chen W, 2005).
A PS tem sido a principal abordagem em estudos que visam compreender as funções do sono em experimentos que iniciaram no final do século XIX. Marie De Manacéine, em 1894, observou 10 filhotes de cães em PS e concluiu que a ausência de sono é mais letal que a falta de alimento, uma vez que animais poderiam permanecer em jejum por até 20-25 dias, em contrapartida, apresentavam danos irreparáveis após 96-120 h de PS e morte entre 7 e 9 dias. No mesmo estudo, Dra. Manacéine também observou que os animais mais velhos eram mais resistentes ao prolongamento da vigília, a temperatura reduz cerca de 4 a 5.8 oC momentos antes
da morte do animal, a atividade locomotora fica lentificada e enfraquecida e indicou que o cérebro é o local de predileção com alterações de maior severidade e irreversibilidade (Bentivoglio and Grassi-Zucconi, 1997).
Em seguida, Lamberto Daddi e Giulio Tarozzi (1898) reportaram que cães privados de sono apresentavam áreas de neurodegeneração no sistema nervoso central. George Thomas White Patrick and J. Allen Gilbert (1896) realizaram o primeiro experimento de PS em humanos, deixando indivíduos acordados por 88-90 h e
observaram o prejuízo no tempo de reação, da habilidade motora voluntária, e na memória. O psiquiatra Cesare Agostini (1898) relatou em estudos de caso, que a vigília prolongada causa exaustão progressiva da atividade psíquica, levando à momentos de confusão mental, alucinações, déficit de atenção grave e atitudes emocionais inadequadas, sendo totalmente revertido após um tempo prolongado de recuperação de sono (~15 h). Outros estudos marcaram o histórico das pesquisas com PS, como a descrição do sono REM pelos pesquisadores Eugene Aserinsky e Nathaniel Kleitman (1953), que permitiu anos mais tarde, a identificação do aumento do tempo do sono REM após um período de PS, sendo chamado de rebote de sono REM (Chen W, 2005, Bentivoglio and Grassi-Zucconi, 1997).
Ao longo dos anos, vários modelos animais de PS foram desenvolvidos. A técnica de locomoção forçada consiste em manter até 12 animais simultaneamente privados de sono em um cilindro rotativo, que mantem movimentação lenta durante todo o período (Figura 1). Esse método reduz o tempo total de sono de 47 % para 3.8 %, afetando tanto o sono REM, quanto o NREM (Stefurak et al., 1977).
Figura 1.Modelo de movimentação contínua para privação de sono. Pharmacol Biochem Behav. 1977 Jan;6(1):137-9.
O disco sobre a água (disk on water – DOW) é outro método que utiliza a movimentação forçada. Esse método consiste em alojar dois animais, um de lado de um disco com cerca de 46 cm de diâmetro e 2-3 cm acima da água. Os animais permanecem com eletrodos para monitoramento do EEG e do eletromiograma (EMG) e quando é detectado qualquer fase do sono, o disco gira em uma velocidade lenta (3.33 rpm), forçando os animais caminharem na direção oposta à rotação do disco, sendo acordados e evitando que sejam levados à água. Um dos animais é o controle,
sendo submetido ao mesmo estímulo, no entanto, o sono desse animal não aciona a rotação do disco, tendo seu sono ad libitum enquanto o animal experimental come, bebe, explora o ambiente ou realiza o comportamento de grooming. Estudos prévios que utilizaram o DOW mostraram que os animais privados de sono reduzem cerca de 72 % a 91 % o tempo total de sono versus 28 % a 39 % nos animais controles e o tempo de rotação do disco ocupou cerca de 20 % do tempo total de PS (Figura 2) (Rechtschaffen et al., 1983, Rechtschaffen et al., 1989, Cirelli et al., 1999, Ramanathan et al., 2002).
Figura 2. Esquema do aparato (vista superior) para privação de sono do modelo disk on water (DOW).
Science. 1983 Jul 8;221(4606):182-4.
O método do manuseio suave (Gentle Handling), também conhecido como “privação manual” ou “exposição a novos objetos”, consiste no recebimento de estímulos táteis, olfatórios ou visuais quando o animal entra no estado de sono, que pode ser monitorado por polissonografia (PSG) ou pela observação do comportamento. Esse método exige um monitoramento constante dos pesquisadores, sendo que o número/intensidade de estímulos por hora aumenta consideravelmente com o prolongamento da vigília e, por esse motivo, esse modelo é efetivo apenas por poucas horas (Vyazovskiy et al., 2002, Chen W, 2005).
Um método clássico para privação seletiva do sono REM foi descrito po Jouvet e colegas (1964), conhecido como o método da plataforma única. Consiste em alojar um único animal em um recipiente (semelhante a um balde) com água. Dentro desse recipiente é colocado uma única plataforma estreita (~ 4.5-8 cm), cujo sua superfície
fica aproximadamente 2 cm do nível da água. Dessa forma, o animal é obrigado permanecer sobre a plataforma e com a diminuição do tônus muscular que ocorre no sono REM, o animal toca a face na água, sendo acordado. Os animais controles são mantidos em um recipiente igual, porém, sobre plataformas mais largas (~ 10-18 cm) consideradas suficientes para que ocorra o sono (Jouvet et al., 1964).
O método das plataformas múltiplas é uma variação do modelo descrito por Jouvet e colegas, para controlar o estresse adicional que o modelo impõe ao manter o animal em um espaço restrito, limitando sua movimentação (van Hulzen and Coenen, 1981). Para contornar a limitação da mobilidade restrita, os animais foram colocados individualmente em um tanque cheio com água, onde são colocadas várias plataformas para que o animal possa se locomover. Essas plataformas são espaçadas umas das outras cerca de 10 a 15 cm, para evitar que o animal consiga se apoiar em mais de uma plataforma e dormir.
Em seguida, Suchecki e Tufik (2000) acrescentaram mais uma variação ao modelo das plataformas, sendo conhecido como o método modificado das plataformas múltiplas (MMPM) (Figura 3). Nesse modelo, um grupo de animais socialmente estáveis são colocados no tanque de PS, contendo um número superior de plataformas ao número de animais privados de sono, assim, os animais podem se locomover sobre as plataformas e interagir entre eles, controlando o estresse adicional do isolamento social, que antes era imposta pelo modelo. Um estudo demonstrou que o MMPM minimiza a elevação de corticosterona nos animais quando comparado ao método das plataformas múltiplas (Suchecki and Tufik, 2000). O MMPM é eficaz para inibir o sono REM e reduzir cerca de 37 % o sono de ondas lentas (Machado et al., 2004).
Os modelos animais de PS supracitados são os mais frequentemente encontrados na literatura, entretanto, algumas limitações devem ser consideradas em cada modelo e as suas possíveis interferências nas variáveis estudadas (Tufik et al., 2009). Cabe ressaltar que a falta de sono representa um estresse por si só, ela é capaz de desencadear respostas semelhantes a outros modelos de estresse, como a imobilização, exposição ao frio e choque nas patas, com ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA – hypothalamic-pituitary-adrenal) e alterações no padrão de rebote de sono (Palma et al., 2000). Além do estresse da falta de sono induzida pelos modelos, há o estresse adicional da mudança de ambiente, em que os animais são retirados do seu local habitual de convívio e são expostos aos aparatos para induzir a PS.
O MMPM expõe os animais ao aumento da humidade e o contato constante da cauda com a água (Figura 3), o que poderia provocar alterações em mecanismos de controle de temperatura corporal e alterar o gasto energético. Além disso, ocorre a alteração do padrão de movimentação dos animais, que passam a caminhar apenas sobre as plataformas. Algumas tentativas foram descritas para padronizar a melhor exposição dos animais controles para esse modelo. Um estudo utilizou plataformas largas, suficientes para os animais experimentarem todas as fases do sono sem que houvesse o contato com a água, no entanto, esses animais apresentaram hipertrofia adrenal similar aos animais experimentais, além de um certo grau de PS paradoxal (Machado et al., 2004). Outro grupo controle foi proposto para esse modelo, colocando os animais sobre uma grade, das quais eles não entrariam em contato com a água, exceto suas caudas, no entanto, um efeito no rebote de sono foi identificado (Suchecki and Tufik, 2000). Atualmente, os animais controles utilizados para o MMPM são mantidos em suas caixas-moradia e deixados na mesma sala que os animais privados de sono (Monico-Neto et al., 2015a).
Os modelos que utilizam movimentação forçada também expõem os animais ao estresse da mudança de ambiente, além do isolamento social e a necessidade do implante de eletrodos corticais e musculares. Outra limitação discutida nesses métodos é que a atividade motora imposta aos animais influencia no padrão do rebote de sono. O modelo do DOW apresenta limitações referentes aos animais controles, sendo que eles permanecem sobre o mesmo disco que os animais experimentais e são acordados quando a rotação do disco é acionada. Assim, o sono dos animais controles só é possível quando não há o acionamento da rotação do disco, o que os
leva a um certo grau de PS (cerca de 28 % a 39 % de restrição de sono) (Rechtschaffen et al., 1989, Cirelli et al., 1999, Ramanathan et al., 2002).
O modelo de privação manual mostrou-se ser mais problemático, por ser impraticável a sua utilização na indução de PS crônica, uma vez que os animais se adaptam rapidamente aos estímulos mais suaves, sendo necessário estímulos mais agressivos para manter os animais acordados, como a imersão em água (Feinberg and Campbell, 1993, Franken et al., 1991, Sternthal and Webb, 1986).
Apesar das limitações encontradas nos modelos de PS, os conhecimentos adquiridos sobre as funções do sono foram impulsionados com suas aplicações. Além disso, estudos alertam sobre os prejuízos do tempo reduzido para o descanso, que tem se tornado uma tendência na população mundial, principalmente nos países mais industrializados. Em um curto período de tempo, a sociedade experimentou mudanças bruscas do comportamento relacionados ao ciclo vigília-sono. Alguns marcos importantes na história foram determinantes para isso, como o surgimento da energia elétrica e a revolução industrial, que implementou linhas de produção contínuas e a necessidade do trabalho em horários que antes eram destinados ao descanso/sono (Foster and Kreitzman, 2014). Além disso, descobertas de novas tecnologias (computadores, tablets, jogos eletrônicos e outros) tem mudado os hábitos da população, que resultou no aparecimento de doenças crônicas em decorrência às alterações metabólicas induzidas pela perturbação dos ritmos biológicos e pela falta de sono (Touitou et al., 2017).
2.2 Respostas metabólicas durante a privação de sono
O estresse, também conhecido como síndrome da adaptação geral, começou a ser descrito por Hans Selye, em 1936, que o definiu como um agente de natureza física (ex: calor e frio), químico (ex: formalina, éter) e psicológico, capaz de aumentar a atividade metabólica e iniciar mecanismos de defesa não específicas para aumentar a resistência ao estressor. O estresse, ou síndrome da adaptação geral, foi dividido em 3 fases. (1) alarme (ativação dos sistemas de resposta ao estresse), (2) resistência (adaptação total ao estresse) e (3) exaustão (exposição prolongado ao estresse, com depleção das reservas energéticas) (Figura 4) (Szabo et al., 2012, Selye, 1950, Selye, 1998).
Em situação de estresse, o organismo estimula o sistema nervoso simpático (SNS) a produzir catecolaminas centralmente e perifericamente. As catecolaminas produzidas centralmente (pelos locus ceruleus) tem o objetivo de estimular a vigília, a atenção ao estressor e a atividade do eixo HPA. Por outro lado, as catecolaminas produzidas perifericamente (pela medula adrenal) tem o objetivo de estimular a mobilização de substratos energéticos, aumenta a frequência cardíaca, a pressão sanguínea, a glicemia e a contração dos músculos cardíacos e esqueléticos. Esse grupo de respostas compreendem a fase 1 de adaptação ao estresse, também conhecida como resposta de luta-ou-fuga (Levine S, 1991).
O eixo HPA inicia suas reações em cascata, no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), onde é produzido e liberado o hormônio liberador de corticotrofina (CRH) e arginina vasopressina (AVP). Esses produtos agem coordenadamente na glândula hipófise para produzir o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), que por sua vez, ao entrar na corrente sanguínea estimula a produção de glicocorticoides, a partir do colesterol, pela glândula adrenal. Uma vez no sangue, os glicocorticoides são capazes de aumentar a mobilização de substrato energético, a glicemia e potencializa alguns efeitos do SNS, como a vasoconstricção. O aumento de glicocorticoides na corrente sanguínea gera um feedback negativo para o PVN, a fim de reduzir a atividade do eixo, fenômeno conhecido como adaptação ao estresse, assim, as concentrações de glicocorticoides tendem a normalizar (Levine S, 1991).
Figura 4. Fases da síndrome da adaptação geral, proposto por Hans Selye, 1936.
Durante a PS, ambos os sistemas de resposta ao estresse, eixo HPA e SNS, são ativados e altas concentrações de catecolaminas e corticosterona são liberados
na circulação (Andersen et al., 2005). Um estudo em ratos demonstrou o aumento das concentrações de corticosterona durante 96 h de PS, com um pico em 24 h e valores intermediários (acima do grupo controle) em 48, 72 e 96 h, mostrando que a adaptação ao estresse da PS não é completa (Galvao Mde et al., 2009). As concentrações de catecolaminas permanecem altas até a normalização do sono (Andersen et al., 2005). Estudos em modelos animais tem demonstrado a importância da ativação do eixo HPA por diferentes estímulos durante a vigília, mostrando que diferentes tipos de estresse são capazes de modular a arquitetura e o tempo do sono subsequente. Assim, o estímulo de choque nas patas aumentou o estado de alerta e reduziu o tempo total de sono, enquanto que a exposição ao frio aumentou o sono de ondas lentas e o tempo total sono. O estresse da imobilização aumentou o número de episódios de sono paradoxal e a PS por 18 h aumentou o tempo dos episódios do sono paradoxal (Palma et al., 2000). Em ratos deprimidos (com hiperatividade do eixo HPA), ocorrem o aumento do sono REM, fragmentação do sono, alteração da distribuição e redução do tempo do sono de ondas lentas (Wichniak et al., 2012). O bloqueio farmacológico da produção de glicocorticoides durante a PS reduz a qualidade do rebote, com redução do tempo do sono REM e do sono de ondas lentas (Machado et al., 2013). Esses dados demonstram que a atividade do eixo HPA pode modular o padrão de sono, sendo que o tempo de vigília, a qualidade e a quantidade do estresse experimentado durante a vigília são decisivos para determinar a arquitetura do sono.
A hiperatividade do eixo HPA observada durante a PS, é capaz de modular a liberação de hormônios anabólicos. O aumento das concentrações do CRH no PVN do hipotálamo está intimamente associada ao aumento da secreção de somatostatina, que culmina na inibição da liberação do hormônio liberador de GH (GHRH), de modo que a PS é capaz de reduzir drasticamente os picos de GH e as concentrações de IGF-1 circulantes, sendo normalizados rapidamente com a normalização do sono (Spiegel et al., 2000, Everson and Crowley, 2004).
O eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (HHG), que tem a testosterona como produto final, também é regulado negativamente pelo eixo HPA. Embora os mecanismos não sejam totalmente elucidados, em uma condição de estresse, o aumento das concentrações de glicocorticoides está associado a apoptose nas células de Leydig, devido a maior produção de ERO’s (Gao et al., 2002, Chen et al., 2012, Gao et al., 2003). Ainda, de forma competitiva entre os glicocorticoides e a testosterona, ambos os hormônios são capazes de se ligar no mesmo sítio de ligação
do receptor de glicocorticoide (RG) no musculoesquelético (Mayer and Rosen, 1975, Mayer and Rosen, 1977). Dessa forma, o aumento das concentrações de glicocorticoides durante a PS pode reduzir tanto a produção de testosterona, como sua ação anabólica.
Atualmente, há um grande corpo de evidências mostrando que a PS gera um desequilíbrio hormonal, favorecendo o aumento da secreção de hormônios catabólicos e a supressão de hormônios anabólicos (Everson and Crowley, 2004, Andersen et al., 2005, Monico-Neto et al., 2015a, Giampa et al., 2016, Koban and Swinson, 2005, Dattilo et al., 2012). Esse desbalanço hormonal ocorre em resposta à ativação dos sistemas de resposta ao estresse (eixo HPA e SNS), que são acionados para que ocorra a adaptação do organismo frente as demandas metabólicas exigidas durante a PS. Como consequência, uma série de alterações metabólicas podem ser listadas, como o aumento da taxa metabólica (Koban and Swinson, 2005, Monico-Neto et al., 2015b), da pressão sanguínea e frequência cardíaca (Giampa et al., 2016), supressão dos hormônios tireoidianos (Everson and Reed, 1995), do sistema imune (Moldofsky et al., 1989), hiperglicemia (Knutson and Van Cauter, 2008), resistência à insulina (de Souza et al., 2017), entre outros. Dessa forma, a PS representa um ambiente catabólico ao organismo, o que é reforçado pela perda de massa corporal em roedores quando são submetidos à essa condição (Monico-Neto et al., 2015a). Em humanos, embora as alterações sejam semelhantes, mas em menor magnitude comparado aos roedores, o débito de sono aumenta a massa corporal a longo prazo, provavelmente induzido pelas mudanças dos hábitos alimentares e redução do nível de atividade física, devido ao estado de fadiga como resultado da PS (Knutson and Van Cauter, 2008).
2.3 Adaptações musculares ao estresse celular
O musculoesquelético é o maior tecido que compõe a massa corporal nos mamíferos, compreende cerca de 45% da massa corporal total e detém a principal reserva de aminoácidos e proteínas. Devido a sua responsividade à vários estímulos hormonais e nutricionais, ele é capaz de regular o suprimento de nutrientes aos demais órgão. Essa propriedade, além de sua óbvia função mecânica, o torna um grande centro modulador do metabolismo em condições normais e essencial em condições de estresse metabólico, como o jejum prolongado e alterações hormonais
(ex: diabetes, síndrome de Cushing). Devido suas funções adaptativas, o musculoesquelético é um tecido altamente influenciado pelo sistema endócrino, assim, a intercomunicação entre o músculo e os demais órgãos tem a tarefa de manter o metabolismo apropriado para a demanda metabólica (Vainshtein et al., 2014).
Além da função endócrina do musculoesquelético, sua função contrátil impõe um alto custo metabólico e induz diversos mecanismos adaptativos provenientes dos estímulos mecânicos, que podem variar de acordo com o padrão da atividade contrátil ou da ação das forças externas ao corpo (Nader and Esser, 2001). Essas propriedades fazem com que o musculoesquelético seja um tecido altamente plástico e tenha uma rápida capacidade de se adaptar às demandas metabólicas, garantindo o funcionamento tecidual e a sobrevivência celular.
Dois importantes mecanismos celulares são descritos como essenciais para manter a homeostase celular, o sistema autofagia-lisossomal (Vainshtein et al., 2014), responsável pela renovação de componentes celulares e o sistema redox, que compreende a capacidade de gerar e neutralizar radicais livres (Jackson, 2005). A falha/excesso em algum desses mecanismos está associada à um mal funcionamento celular e a ativação de mecanismos de apoptose e necrose celular (Faitg et al., 2017, Romanello and Sandri, 2015, Sandri, 2011).
A autofagia é um processo seletivo de captura e entrega de conteúdo citoplasmático ao lisossomo. A partir da interação de uma série de fatores (processo conhecido como nucleação), ocorre a formação de uma membrana de dupla camada, chamado de fagoforo. Durante o alongamento do fagoforo, ocorre o sequestramento do conteúdo citoplasmático que deve ser degradado, como organelas danificadas, complexos proteicos e agregados. Após o alongamento do fagoforo, ocorre a sua maturação, formando uma estrutura conhecida como autofagossomo, que após se fundir com o lisossomo, forma a estrutura conhecida como autolisossomo (Sandri, 2011). No interior do autolisossomo há enzimas proteases responsáveis pela degradação do conteúdo entregue pelo autofagossomo, como exemplo, a catepsina L (Bechet et al., 2005).
Atualmente há diversos fatores capazes de controlar a autofagia, sendo a proteína mTOR (do inglês mechanistic target of rapamycin kinase) uma das principais, cuja fosforilação é capaz de regular negativamente a autofagia em condições normais ou em um ambiente rico em nutrientes. A mTOR pode inibir a autofagia impedindo o processo de nucleação ou regular negativamente diversos efetores que regulam a
transcrição e tradução de proteínas necessárias para que ocorra a autofagia, como a proteína kinase A (Budovskaya et al., 2004), Gcn2 (general control nonderepressible 2) (Talloczy et al., 2002) e Snf1 (sucrose non-fermenting 1) (Huang et al., 1996). A inibição da atividade da mTOR pelo jejum prolongado ou pelo tratamento com rapamicina é capaz de aumentar o fluxo autofágico (Noda and Ohsumi, 1998). Dessa forma, a mTOR é considerada uma proteína chave, que estimula a síntese proteica e um sensor metabólico, cuja atividade é inibida durante o balanço energético negativo (Klionsky, 2005).
Previamente, a autofagia foi considerada uma via não seletiva de entrega de conteúdo celular ao lisossomo, no entanto, é crescente o nível de evidências que demonstram que esse processo ocorre de forma altamente seletiva, gerando a degradação de organelas disfuncionais e proteínas defeituosas. Estudos têm demonstrado que a autofagia é um processo altamente adaptativo, necessário para a manutenção das funções celulares. No entanto, no musculoesquelético, o excesso do fluxo autofágico está associado com a atrofia muscular, uma vez que ele é capaz de degradar uma grande quantidade de conteúdo citoplasmático em uma condição de balanço energético negativo. Por outro lado, a falha em qualquer passo do processo de autofagia, que ocasiona sua inibição, resulta no acúmulo do conteúdo que deveria ser degradado (“lixo celular”), causando o mal funcionamento e morte celular (Sandri, 2011).
Em relação ao sistema redox no musculoesquelético, por ser um tecido rico em mitocôndrias e, associado ao fato dele apresentar uma grande atividade contrátil, o caracteriza como um tecido com alto potencial de produção de radicais livres. Radical livre é qualquer espécie que contém um ou mais elétrons desemparelhados (Halliwell and Gutteridge, 1984) e o termo ERO’s se refere a uma variedade de moléculas reativas, que são derivadas do O2 e que podem ser radicais livres. Além disso, há a
produção de espécies reativas de nitrogênio (ERN), que se referem às espécies reativas derivadas do nitrogênio, que podem ser classificadas como íons (peróxido nitrito) e não íons (óxido nítrico) (Jackson, 2005).
Através da dissociação parcial da molécula de O2 na cadeia respiratória
mitocondrial, é formado o superóxido (O2•−), que pode reagir com o oxido nítrico (NO•)
e formar o peróxido nitrito (ONOO−), ou alternativamente reagir com a enzima
manganês superóxido desmutase (MnSOD) para formar o peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 pode sofrer ação enzimática da glutationa peroxidase (GPx) para
formar água, ou na presença de ferro, rapidamente é formada a espécie mais reativa conhecida, o radical hidroxila (OH•) (Bolisetty and Jaimes, 2013). A figura 5 ilustra a
produção de ERO’s e ERN’s.
Figura 5. Estrutura mitocondrial e a produção de espécies reativas mitocondriais. Em virtude de suas
bicamadas lipídicas, a mitocôndria pode ser subdividida em membrana externa, espaço intermembranoso, membrana interna e matriz. A parte inferior da imagem demonstra a produção do ânion superóxido através dos diferentes complexos da cadeia transportadora de elétrons. O superóxido reage com o óxido nítrico (NO•)para formar o peróxido nitrito (ONOO−). Alternativamente, o superóxido
é convertido pela MnSOD em H2O2 que é subsequentemente convertido em água pela glutationa
peroxidase (GPx). Na presença de ferro, o H2O2 é rapidamente convertido para o radical hidroxila (OH•).
Traduzido de Bolisetty e Jaimes, Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 6306-6344.
Uma vez que as ERO’s são formadas, há dois possíveis destinos. Um deles é a interação das ERO’s com quaisquer estruturas subcelulares, como membranas, organelas, proteínas, lipídeos e DNA. Essas interações ocorrem para que os radicais livres se estabilizem, a partir da abstração de elétrons, às custas do dano de outras estruturas que perderam seus elétrons, causando prejuízos ao funcionamento celular, mutações, autofagia e apoptose. Outro possível desfecho é a neutralização por enzimas antioxidantes, como as isoformas mitocondrial e citoplasmática de SOD (MnSOD e CuZnSOD, respectivamente), catalase e GPx, ou pelos eliminadores diretos de ERO’s, como glutationa, vitamina E e o ácido ascórbico (Jackson, 2005).
Muitos estudos têm demonstrado os efeitos deletérios da produção excessiva de radicais livres no musculoesquelético, ou mesmo em situações em que o sistema neutralizador está comprometido ou insuficiente (McArdle et al., 1999, Abrigo et al., 2016, Musaro et al., 2010), condição chamada de estresse oxidativo. Uma vez que os radicais livres não são neutralizados, ocorre uma série de alterações nas estruturas subcelulares, que podem ser mensurados a partir da análise de alguns produtos, como a peroxidação lipídica, a oxidação proteica e a mutação do DNA. No entanto, em condições fisiológicas, as ERO’s e ERN’s têm se mostrado capaz de interagir com diversas sinalizações para modificar a expressão gênica e atividade vasomotora, principalmente após o exercício físico. Embora os mecanismos não sejam totalmente elucidados, os radicais livres possivelmente estão associados com expressões gênicas associadas ao aumento de força muscular com o treinamento físico (Haddad, 2002, Droge, 2002, Stamler and Meissner, 2001).
O musculoesquelético possui algumas peculiaridades quanto a capacidade de produção e neutralização de radicais livres. As fibras musculares do tipo I, caracterizadas pelo metabolismo predominantemente oxidativo (fibras de contração lenta), possuem maior capacidade de produção de radicais livres, quando comparadas às fibras musculares do tipo II, que por sua vez possuem o metabolismo predominantemente glicolítico (fibras de contração rápida). As fibras do tipo I possuem maior número de mitocôndria, que são as principais produtoras de ERO’s, além disso, possui maior atividade de enzimas antioxidantes (Jackson, 2005). Por esse motivo, as fibras do tipo I são mais susceptíveis ao dano pelo estresse oxidativo. Por outro lado, as fibras musculares do tipo II possuem maior propensão à atrofia pela a atividade de vias que são ativadas pelos glicocorticoides, como SAL e SUP, por serem ricas em RG (Schakman et al., 2013).
Cabe ressaltar que ambos os mecanismos de adaptação celular, o SAL e o sistema redox se comunicam entre si, podendo haver uma modulação recíproca. O estresse oxidativo é capaz de estimular o SAL, devido seu efeito lesivo nas estruturas subcelulares, principalmente pela maior ocorrência de disfunções mitocondriais, que é um dos principais ativadores de autofagia, processo também conhecido por mitofagia (Zhang et al., 2013b, Dobrowolny et al., 2008), por outro lado, a redução do fluxo autofágico gera o acúmulo de mitocôndrias danificadas, que resulta na maior produção de ERO’s (Wohlgemuth et al., 2010).
Toda condição de estresse celular, que eleva a atividade das vias catabólicas, a um nível superior à síntese proteica por um tempo prolongado, resulta em atrofia muscular. A atrofia muscular é um processo caracterizado pela redução do volume muscular e está associada à grande perda de proteínas contráteis, que resulta na proporcional perda da capacidade de gerar força (di Prampero and Narici, 2003) e a limitação das atividades de vida diária. A perda de massa e força muscular é atualmente um problema de saúde pública, visto que é a principal causa de queda em idosos, levando a um subsequente aumento da morbidade e mortalidade (Brocca et al., 2017). Em síndromes caquéticas, como no câncer, cardiopatias, insuficiência renal, entre outras, o trofismo muscular é um preditor de sobrevida, o que justifica estudos relacionados a essa temática (Tisdale, 2004, Ventadour and Attaix, 2006, Cunha et al., 2012).
Histologicamente, a atrofia muscular é caracterizada pela redução da área transversal das fibras musculares, com consequente perda de conteúdo mitocondrial e do retículo sarcoplasmático (Roseno et al., 2015). É observado a desintegração de miofibrilas, com linhas Z estendidas e lesão mitocondrial. A redução da vascularização, a proliferação de tecido conjuntivo e o aumento do fluido intersticial é característica do processo atrófico. As células satélites abandonam seu estado de quiescência e se tornam ativas, com potencial disponibilidade, caso ocorra algum sinal de regeneração (Lu et al., 1997). Apesar desse aparente estímulo inicial, após 3 dias, a atividade proliferativa das células satélites é reduzida durante a atrofia muscular induzida pela suspensão da cauda em ratos (Darr and Schultz, 1989). No entanto, esse fenótipo pode variar de acordo com a predominância do tipo de fibra que compõe o músculo analisado e com o modelo de atrofia aplicado.
Assim, o músculo esquelético é um tecido altamente plástico, capaz de se adaptar rapidamente às condições de estresse celular, para garantir a quantidade suficiente de substrato energético para a demanda metabólica. Alguns mecanismos celulares são reconhecidos como essenciais para que o ocorra o processo adaptativo, sendo o SAL, o SUP e o sistema redox. A proteína mTOR é um sensor metabólico que modula a atividade de vias de síntese e degradação proteica e, a persistência do estresse celular gera adaptações no sarcômeros, que resultam na atrofia muscular, prejuízo da funcionalidade e deterioração da qualidade de vida.
