Atividade lisossomal

A atividade lisossomal foi inferida pela atividade da enzima catepsina L. O ensaio fluorimétrico foi realizado usando o kit comercialmente disponível Abcam’s Cathepsin L Activity Assay Kit (Abcam®_{; #ab65306). Esse ensaio se baseia na}

clivagem do substrato sintético acetil – fenilalanina/arginina – amino-4-trifluorometil coumarin (Ac-FR-AFC) pela catepsina L, gerando AFC livre.

4.1.10 Análises estatísticas

As análises foram realizadas usando o programa SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). O modelo linear generalizado (GzLM) foi aplicado para comparação entre grupos, a partir da distribuição gama, determinado pelo critério de informações de Akaike (AIC), com post hoc de Sidak. Para comparação da massa dos músculos sóleo e plantar entre os grupos, os dados foram covariados pelo comprimento da tíbia. A análise da variação da massa corporal a cada 24 h de PS, foi realizada a partir do modelo de equações de estimação generalizadas (GEE), com distribuição linear, determinado pelo índice de aderência QIC (verossimilhança alta em critério de modelo de independência), com post hoc de Sidak. Os dados foram expostos como média ± erro padrão e para todos os cálculos a significância estatística foi considerada quando P≤0.05.

4.2 Resultados

Ao final das 96 h de PS, as concentrações de corticosterona aumentaram nos grupos PS+VEI (P<0,001) e PS+MET (P<0,012) quando comparados ao grupo CTL, além disso, o grupo PS+MET apresentou redução da corticosterona quando comparado ao grupo PS+VEI (P=0,008) (Wald=24.842, df=2, P<0,001) (Figura 14).

Foi observada maior redução da massa corporal nos dois grupos submetidos à PS comparados ao CTL (P<0,001) e maior redução do grupo PS+VEI comparado ao PS+MET (P=0,008) (Wald=93.463, df=2, P<0,001). C o r t ic o s t e r o n a ( n g /d L ) C T L P S + V E I P S + M E T 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 * # *

Figura 14. Concentrações plasmáticas de corticosterona. * diferente do CTL, # _{diferente do PS+MET.}

Dados apresentados como média ± EP. Estatisticamente significante quando P≤0,05.

Ao observar a variação da massa corporal ao longo das 96 h, houve redução em 24 e 48 h de ambos os grupos submetidos à PS comparados ao grupo CTL (P<0,001) e apenas o grupo PS+VEI foi menor que o grupo CTL às 72 h (P=0,016) e 96 h de PS (P=0,013) (Wald=176.203, df=11, P<0,001 - Figuras 15A e B).

Figura 15. Variação da massa corporal. A: delta da massa corporal a cada 24 h de privação de sono.

B: Variação da massa corporal após 96 h de privação de sono. a _{Diferença entre PS+VEI vs CTL,} b

Diferença entre PS+MET vs CTL, * Diferente do CTL, # Diferente do PS+VEI. Dados apresentados como média ± EP. Estatisticamente significante quando P≤0,05.

Após 96 h de PS houve redução da massa do músculo plantar de ambos os grupos privados de sono comparados ao CTL (P<0,001 para ambos), sem diferença entre esses grupos (P=0,06) (Wald=61.678, df=2, P<0,001). Por outro lado, ambos os grupos privados de sono apresentaram aumento da massa do sóleo comparado ao grupo CTL (Wald=12.216, df=2, P=0,002) (Figuras 16A e B).

Figura 16. Massa muscular covariado pelo comprimento da tíbia. A: massa muscular do músculo

plantar. B: massa muscular do músculo sóleo. * Diferente do CTL, dados apresentados como média ± EP. Estatisticamente significante quando P≤0,05.

As análises relacionadas ao dano oxidativo mostraram que as concentrações de MDA não variaram entre os grupos no músculo plantar (Wald=3.094, df=2, P=0,213), já no músculo sóleo houve aumento do MDA no grupo PS+VEI (P=0,012) comparado ao grupo CTL (Wald=9.125, df=2, P=0,01). A comparação entre os músculos revelou que o sóleo apresentou maiores concentrações de MDA no grupo CTL (P<0,001), PS+VEI (P<0,001) e PS+MET (P=0,005) (Wald=60.036, df=5, P<0,001) (Figura 17). M D A (n M o l/ m g ) CT L PS +V EI PS +M ET 0 .0 0 0 0 .0 0 5 0 .0 1 0 0 .0 1 5 P la n ta r S ó le o # * # #

Figura 17. Peroxidação lipídica muscular mensurada pelas concentrações de malondialdeido (MDA)

no músculo plantar e sóleo. * Diferente do CTL do mesmo músculo, # _{diferença entre os músculos do}

Em relação ao 8OHdG, houve aumento da marcação nuclear nos grupos PS+VEI (P<0,001) e PS+MET (P<0,001) comparados ao CTL no músculo plantar. No músculo sóleo, foi observada maior marcação nuclear em ambos os grupos privados de sono quando comparados ao grupo CTL (P<0,001), ainda, o grupo PS+VEI apresentou maior marcação nuclear quando comparado ao grupo PS+MET (P=0,03). A comparação entre os músculos revelou maior marcação nuclear de 8OHdG no músculo sóleo quando comparado ao plantar nos grupos PS+VEI (P<0,001) e PS+MET (P=0,046) (Wald=284,286, df=5, P<0,001; Figuras 18 e 20).

8 O H D G (n ú m e ro d e c é lu la s p o s it iv a s ) CT L PS +V EI PS +M ET 0 2 0 4 0 6 0 8 0 P la n ta r S ó le o # * * † # * *

Figura 18. Dano oxidativo ao DNA avaliado pela marcação nuclear de 8OHdG nos músculos sóleo e

plantar. * Diferente do grupo CTL do mesmo músculo, # _{diferença entre os músculos do mesmo grupo,}

† diferente do grupo PS+VEI para o mesmo músculo. Dados apresentados como média ± EP. Estatisticamente significante quando P≤0,05.

O consumo de O2 mitocondrial do músculo plantar foi reduzido nos dois grupos

privados de sono quando comparados ao grupo CTL (P<0,001) e não foram observadas diferenças entre os grupos para essa variável no músculo sóleo (Wald=85.488, df=5, P<0.001). A comparação entre os músculos revelou que a taxa de consumo de O2 mitocondrial foi reduzida no músculo sóleo quando comparada ao

Figura 19. Taxa de consumo de oxigênio mitocondrial. * Diferente do CTL, # _{diferença entre os}

músculos do mesmo grupo. N=5/grupo. Dados apresentados como média ± EP. Estatisticamente significante quando P≤0,05. T a x a d e c o n s u m o d e O 2 (u .a .) CT L PS +V EI PS +M ET 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 P la n ta r S ó le o # * *

Figura 20. Dano oxidativo ao DNA avaliado pela marcação nuclear de 8OHdG nos músculos sóleo e plantar. Fotomicrografia da imunohistoquímica

A atividade da Catepsina L no músculo plantar aumentou no grupo PS+MET (P=0,04) quando comparado ao grupo CTL (Wald=6.983, df=2, P=0,03). No músculo sóleo houve aumento da atividade da catepsina L no grupo PS+VEI (P=0,02) quando comparado ao grupo CTL (Wald=7,961, df=2, P=0,019). A comparação entre os músculos revelou que o músculo sóleo teve menor atividade da catepsina L comparado ao músculo plantar em todos os grupos (Figura 21).

A t iv id a d e d a C a t e p s in a L (R F U ) CT L PS +V EI PS +M ET 0 1 2 3 4 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 _{P la n ta r} S ó le o * # * # #

Figura 21. Atividade da enzima catepsina L nos músculos sóleo e plantar. * Diferente do CTL do mesmo

músculo, # _{diferença entre os músculos do mesmo grupo. N=10/grupo. Dados apresentados como}

média ± EP. Estatisticamente significante quando P≤0,05.

A avaliação histopatológica do músculo sóleo revelou a presença de edema intersticial, associado a infiltrado inflamatório intenso, alteração da disposição das fibras musculares, além de áreas de degeneração tecidual e atrofia muscular (Figuras 22 A-C) dos dois grupos privados de sono, quando comparados ao grupo CTL. A quantificação da área dos componentes teciduais do mesmo músculo revelou a redução do parênquima muscular nos grupos PS+VEI (P<0,01) e PS+MET (P<0,01) quando comparados ao grupo CTL (Wald=12.549, df=2, P<0,01). O aumento do edema tecidual pode ser observado nos grupos PS+VEI (P<0,001) e PS+MET (P<0,001) quando comparados ao grupo CTL (Wald=15.485, df=2, P<0,001) (Tabela 2). No músculo plantar as alterações foram mais sutis, com leve aumento de células inflamatórias nos grupos PS+VEI e PS+MET quando comparados ao grupo CTL e fibras com menor área transversal (Figuras 22 D-F). A área dos componentes celulares examinados não revelou diferenças entre os grupos para a porcentagem de parênquima muscular, tecido conectivo e edema tecidual no músculo plantar (Tabela

2). Não foram encontradas alterações morfológicas e histopatológicas no grupo CTL para ambos os músculos (Figuras 22 A e D).

Tabela 2. Componentes teciduais dos músculos plantar e sóleo após privação de sono por 96 h. Músculo Estrutura/Processo patológico

Parênquima (%) Tecido Conectivo (%) Edema Tecidual (%) Plantar CTL 91.4 ±1.5 8.6 ± 1.5 0 PS+VEI 91.4 ± 1.8 8.7 ± 1.8 0 PS+MET 90.9 ± 2.1 8.7 ± 1.5 0 Sóleo CTL 92.4 ± 1.6 7.6 ± 1.6 0 PS+VEI 72.7 ± 4.7* 7.7 ± 1.4 19.5 ± 4.2* PS+MET 74.5 ± 3.5* 7.5 ± 1.3 18.7 ± 4.5*

* Estatisticamente significante comparado ao CTL, dados apresentados como média ± EP, p<0,05.

4.3 Discussão

O presente estudo revelou que a PS induziu alterações histopatológicas e moleculares de acordo com os tipos de fibras musculares, uma vez que o músculo sóleo é composto predominantemente por fibras do tipo I (fibras de contração lenta) e o músculo plantar é composto predominantemente por fibras do tipo II (fibras de contração rápida) (Lin et al., 2002). Das alterações histopatológicas observadas, podemos destacar o infiltrado inflamatório agudo intenso no músculo sóleo, com áreas de degeneração tecidual nos grupos privados de sono. Um infiltrado inflamatório também foi observado no músculo plantar, porém de leve intensidade, sem a presença de degeneração tecidual.

A alteração das concentrações de corticosterona durante a PS não influenciou no padrão histopatológico, uma vez que o grupo tratado com metirapona apresentou as mesmas características do grupo privado de sono que recebeu apenas veículo. No entanto, as análises moleculares realizadas sugeriram efeitos distintos da corticosterona. As alterações exacerbadas observadas no músculo sóleo, comparadas ao plantar, poderiam ser explicadas, em partes, pela maior marcação nuclear do 8OHdG, uma vez que as fibras do tipo I produzem maiores quantidades de pró-oxidantes comparadas às fibras do tipo II (Jackson, 2005).

Até o momento não encontramos dados na literatura para demonstrar o estresse oxidativo no musculoesquelético com a PS. Um único estudo verificou a

produção de pró-oxidantes e enzimas antioxidantes, bem como a peroxidação lipídica (através do conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico [TBARS]) e a oxidação proteica (através dos níveis de 2,4 dinitrofenilhidrazina [DNPH]), não sendo observado qualquer indicativo de estresse oxidativo (Gopalakrishnan et al., 2004). No entanto, o músculo utilizado para mensurar esses indicadores não foi mencionado. Assim, esse é o primeiro estudo que demonstrou que o musculoesquelético sofre estresse oxidativo com a PS.

O presente estudo mostrou, através da marcação de 8OHdG, que ambos os músculos (glicolítico e oxidativo) sofrem estresse oxidativo induzido pela PS, sendo mais pronunciado nas fibras do tipo I. O 8OHdG é formado a partir da reação do radical hidroxila (HO•) com a guanina, é o dano mais abundante do DNA e se torna pró- mutagênico quando não reparado (Valavanidis et al., 2009). Uma vez que o metabolismo predominantemente oxidativo é marcadamente aumentado nas fibras do tipo I, o músculo sóleo seria mais susceptível a esse tipo de dano (Jackson, 2005). A alta demanda metabólica durante a PS gera um balanço energético negativo (Koban and Swinson, 2005, Monico-Neto et al., 2015b), o que é sugestivo de um ambiente favorável ao estresse oxidativo, seja pelo aumento da produção de pró-oxidantes, pela redução dos mecanismos antioxidantes ou ambos. Dessa forma, a mitocôndria, a membrana celular e as proteínas ficariam mais susceptíveis ao estresse oxidativo, sugerindo maior atividade de vias relacionadas à degradação proteica e apoptose (Adhihetty et al., 2005).

Os dados de estresse oxidativo foram acompanhados pelo aumento da atividade da catepsina L no músculo sóleo, levando-nos a especular que o estresse oxidativo prejudicou o funcionamento celular, com consequente ativação de vias de adaptação celular. A catepsina L é uma protease que se torna ativa em contato com o meio ácido do interior do lisossomo, assim, a atividade dessa enzima é um marcador indireto para mensurar a atividade lisossomal (Bechet et al., 2005). A PS não alterou as concentrações de MDA no músculo plantar, porém houve aumento da marcação nuclear para 8OHdG, sem aumento da atividade lisossomal. Mesmo que discreto, o músculo plantar foi susceptível ao estresse oxidativo e a atrofia muscular pode ser observada, corroborando um estudo prévio (Monico-Neto et al., 2015a). Essas alterações podem ser, em parte, consequência das adaptações metabólicas frente ao aumento da demanda metabólica imposta pela PS e o dano oxidativo (Aragno et al., 2004, Vainshtein et al., 2014).

Figura 22. Fotomicrografia dos músculos plantar e sóleo, n=5/grupo. (A) sóleo do grupo controle; (B) sóleo do grupo PS tratado com veículo; (C) sóleo do

grupo PS tratado com metirapona; (D) plantar do grupo controle; (E) plantar do grupo PS tratado com veículo e (F) plantar do grupo PS tratado com metirapona. Setas indicam processo de degeneração celular e asteriscos indicam infiltrado inflamatório.

O consumo de O2 mitocondrial do músculo plantar foi menor nos grupos

privados de sono. Dados recentes da literatura têm demonstrado o aumento da perda mitocondrial durante o processo de atrofia muscular, quando ocorre a depleção de hormônios andrógenos em fibras glicolíticas (Rossetti et al., 2018). Complementando esses dados, o melhor controle de qualidade mitocondrial atenua a atrofia muscular induzida por nefrectomia em ratos (Wang et al., 2017). Assim, a atrofia muscular induzida pela PS poderia reduzir o conteúdo mitocondrial e proporcionar a redução da taxa de consumo de O2.

No músculo sóleo não houve diferença entre os grupos na taxa de consumo de O2 mitocondrial, que poderia ser explicado por uma possível redução da densidade e

do número mitocondrial, que impediria o aumento do consumo de O2, assim como

ocorre em outras síndromes caquéticas, como a insuficiência cardíaca (Drexler et al., 1992). Além disso, o edema intersticial encontrado no músculo sóleo poderia prejudicar a perfusão tecidual e contribuir para a miopatia encontrada (Lavine and Sierra, 2017). Nós especulamos que o infiltrado inflamatório/edema/dano oxidativo evidenciado nas fibras oxidativas, podem ter exercido um potencial dano mitocondrial, impedindo consequentemente o aumento do consumo de O2 durante a PS.

Em outros modelos de estresse metabólico, como a restrição calórica, o músculo apresenta rápida capacidade de se adaptar, através do aumento do fluxo autofágico, ocorre maior produção de substrato energético para a demanda metabólica (Wohlgemuth et al., 2010, Mizushima et al., 2004). O estresse induzido pela PS representa um grande desafio ao musculoesquelético e frente ao aumento da demanda metabólica, ocorre a ativação dos principais sistemas de resposta ao estresse, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal e o sistema nervoso simpático, que aumentam a liberação de glicocorticoides e catecolaminas, respectivamente (Andersen et al., 2005, Hipolide et al., 2006). Como consequência, há o aumento do metabolismo e maior mobilização de substrato energético, uma vez que são observadas redução da gordura corporal e atrofia muscular (Wronska and Kmiec, 2012, Dattilo et al., 2012, Hipolide et al., 2006, Koban and Swinson, 2005). No presente estudo, o tratamento com metirapona não foi capaz de inibir completamente o aumento da corticosterona durante a PS, mas o valor médio observado foi 56% menor ao dos animais privados de sono que receberam apenas veículo, com valores aceitáveis para um grupo controle (Tiba et al., 2008).

A redução das concentrações de corticosterona refletiu na menor perda de massa corporal, corroborando achados prévios (Tiba et al., 2008), no entanto, a massa e o tamanho das fibras do músculo plantar não acompanharam o comportamento da massa corporal. O aumento da massa do músculo sóleo pode ser explicada pelo edema observado nesse tecido, porém, a relação entre proteólise/apoptose e PS pode ser sugerida ao observar fibras de menor tamanho e a degeneração tecidual nos grupos privados de sono na análise histopatológica. Esses resultados demonstram que a ativação das vias relacionadas à atrofia muscular não ocorrem exclusivamente pela ação da corticosterona, mas possivelmente sofrem influência do estresse oxidativo (Li et al., 2003, Abrigo et al., 2016) e inflamação (Yujra et al., 2018, Ma et al., 2017).

Estudos prévios têm demonstrado que o aumento da corticosterona de forma aguda (até 7 dias) é capaz de reduzir o estresse oxidativo e melhorar a resposta imune inata (Vagasi et al., 2018, Caro et al., 2007). Nossos resultados não corroboram esses estudos, uma vez que houve redução da marcação nuclear de 8OHdG no músculo sóleo dos animais tratados com metirapona, quando comparados aos animais tratados com veículo e nenhuma diferença entre esses grupos foi observada no músculo plantar. Além disso, os dados apontaram que a corticosterona exerce influência sobre a atividade da catepsina L durante a PS de acordo com o fenótipo muscular. No músculo plantar, a atividade da catepsina L foi aumentada com a inibição da corticosterona, já no músculo sóleo não houve alterações. Esses dados complementam resultados previamente publicados, sugerindo que altas concentrações de corticosterona influenciam em parte, o processo de autofagia muscular durante a PS (Monico-Neto et al., 2015a).

As divergências encontradas entre os músculos em relação a ação da corticosterona poderiam ser explicadas pela maior quantidade de receptores de glicocorticoide nas fibras do tipo II, comparados às fibras do tipo I. Assim, as fibras do tipo II são mais susceptíveis à atrofia muscular induzida pelos glicocorticoides (Shimizu et al., 2011), em contrapartida, seria o maior beneficiado pelo efeito protetor contra o estresse oxidativo induzido pela PS.

No presente estudo, duas limitações devem ser consideradas, sendo que a falta do grupo controle tratado com metirapona é a principal delas. Além da síntese de corticosterona, a metirapona é capaz de inibir a atividade do citocromo P450, que é necessária para a produção de ERO’s pelo fator de transformação do crescimento β1

(TGF- β1). A literatura tem demonstrado que o tratamento com metirapona pode reduzir a degeneração, o dano oxidativo e o status energético em neurônios de ratos (Baitharu et al., 2012), além de reduzir a apoptose nos hepatócitos (Albright et al., 2003). Em contrapartida, não foi observado qualquer efeito sobre a produção de ERO’s nas células de Leydig (Parthasarathy and Balasubramanian, 2008) e hepatócitos (Herrera et al., 2004). Embora os efeitos musculares, a partir da inibição do citocromo P450, pelo tratamento com metirapona não seja conhecido, nós especulamos que as ERO’s geradas durante a PS, não seriam produzidas exclusivamente pelo TGF- β1 e que esse fator pouco poderia influenciar nos resultados obtidos.

A segunda limitação a ser considerada está relacionada ao modelo de PS aplicado, visto que o animal necessita permanecer sobre as plataformas e aumentam o grau de atividade da musculatura das patas traseiras, comparado ao grupo CTL. Portanto, o MMPM pode superestimar os efeitos da PS por uma limitação do modelo. Dados previamente publicados pelo nosso grupo demonstraram que a PS induz alterações semelhantes nos músculos mastigatórios de ratos, porém, em menor magnitude (Yujra et al., 2018). As diferenças na magnitude das alterações encontradas, nos diferentes grupos musculares, sugerem que o grau de ativação muscular é positivamente associado à intensidade dos achados. Dessa forma, o músculo sóleo, que possui ação antigravitacional, poderia ser o mais afetado, não apenas pela sua característica metabólica, mas também pela sua ação motora no modelo aplicado.

Por fim, podemos concluir que as alterações histopatológicas induzidas pela PS no musculoesquelético ocorrem de acordo com o tipo de fibra muscular, sendo que o músculo composto por fibras do tipo I sofrem maior estresse oxidativo verificado pelo aumento da marcação do 8OHdG. Além disso, os dados sugerem que a corticosterona potencializa o dano ao DNA nas fibras do tipo I e o tipo de fibra muscular parece ser determinante para o desfecho dos efeitos da corticosterona durante a PS.

5 CONCLUSÕES

A PS prejudica o processo de regeneração muscular em ratos, reduz as concentrações de IGF-1 muscular e minimiza seu aumento no músculo lesionado. A recuperação do sono por 96 h foi capaz de restaurar as concentrações basais dos fatores de crescimento e da corticosterona, mas não foi o suficiente para normalizar o processo de regeneração muscular.

Os achados demonstraram que as alterações histopatológicas induzidas pela PS no musculoesquelético ocorrem de acordo com o tipo de fibra muscular, sendo que o músculo composto por fibras do tipo I sofrem maior estresse oxidativo verificado pelo aumento da marcação do 8OHdG. Além disso, os dados sugerem que a corticosterona potencializa o dano ao DNA nas fibras do tipo I e o tipo de fibra muscular parece ser determinante para o desfecho dos efeitos da corticosterona durante a PS. Mais estudos são necessários para clarear os mecanismos e para o desenvolvimento de estratégias que atenuam os efeitos da PS. Embora esse estudo seja aplicado às ciências básicas, uma nova área de pesquisa emerge para futuras investigações, objetivando possíveis aplicações clínicas em populações específicas, como atletas, pacientes hospitalizados e trabalhadores por turnos.

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