Estudos envolvendo a análise de ligação têm sido aplicados na tentativa de identificar genes envolvidos com a gagueira desenvolvimental persistente familial. No entanto, por ser uma doença de caráter complexo, muito diferente das doenças tidas como mendelianas, esse tipo abordagem é desafiada a cada trabalho, pois há fatores que interferem quanto a eficiência desse método para a identificação clara dos componentes genéticos envolvidos.
Até então há sete estudos (RAZA, M. H. et al., 2011; RAZA, M. HASHIM et al., 2012; RAZA, M. H. et al., 2010; RIAZ et al., 2005; SHUGART et al., 2004; SURESH et al., 2006; WITTKE-THOMPSON et al., 2007) descritos envolvendo a gagueira desenvolvimental persistente familial e as análises de ligação.
A partir de 68 famílias de gagos (188 gagos e 38 fluentes = 226 indivíduos) norte americanos ascendentes de europeus, Shugart et al. (2004) realizaram o primeiro estudo de ligação com a gagueira desenvolvimental persistente familial. Os resultados por eles apresentados sugeriram forte evidência de ligação (escore de 5,143), a partir de análise não paramétrica (NPL – Non-parametric Linkage), no cromossomo 18. Além
disso, apesar de baixo, sugestivos NPL escores para os cromossomos 1, 13 e 16 foram apontados.
Em 56 famílias paquistanesas consanguíneas (144 gagos e 55 fluentes = 199 indivíduos), Riaz et al. (2005) encontraram evidência de ligação com análises NPL nos cromossomos 1, 5, 7 e 12. Com o refinamento do mapa de ligação a partir de marcadores microssatélites a evidência de ligação no cromossomo 12 foi mantida, pois tanto para a análise não paramétrica quanto paramétrica os escores foram de 4,61 e 3,51, respectivamente. Os demais cromossomos apresentaram escores superiores a 2 sugerindo também possíveis ligações no entanto, a forte evidência encontrada em 12q foi sugerida como a responsável por causar a doença que posteriormente foi confirmada por Kang et al. (2010) a partir da identificação dos genes.
Em um terceiro estudo, Suresh et al. (2006) realizaram análise de ligação num conjunto de 100 famílias de norte americanos de ascendência européia, suecos e israelenses. A classificação das amostras foi feita de acordo com o fenótipo e separadas em três grupos: gagueira desenvolvimental persistente – 252 indivíduos; gagueira desenvolvimental recuperada – 45 indivíduos; muito jovens para o estabelecimento do diagnóstico – 19 indivíduos. A análise de ligação foi aplicada e combinada em diferentes etapas. Inicialmente as análises foram aplicadas num grupo (297 indivíduos) envolvendo gagos desenvolvimentais persistentes e recuperados, obtendo-se evidência sugestiva de ligação no cromossomo 9 (LOD escore 2,3), porém ao analisar apenas os 252 indivíduos com gagueira desenvolvimental persistente, o cromossomo 15 foi indicado como sugestivo (LOD escore 1,95). Por fim, segregando as amostras de gagos por gênero, a análise de ligação apresentou resultados mais expressivos: para gagos do sexo masculino, o cromossomo 7 (LOD escore 2,99) e para gagos do sexo feminino, o cromossomo 21 (LOD escore 4,5).
Ainda no mesmo trabalho, Suresh et al. (2006)ao observarem que a cada tipo de abordagem analítica feita, diferentes regiões cromossômicas eram sugeridas e, baseando-se em sugestões de que a gagueira desenvolvimental persistente poderia ser o resultado da combinação de múltiplos genes (poligênica) foram aplicadas análises de ligação condicional, com o objetivo de testar as áreas de ligação com o restante do genoma.
Nas análises condicionais, as interações entre dois lócus podem ser tanto positivas quanto negativas, quando o LOD escore condicional para um marcador sofre um incremento diz-se que há uma interação positiva o que foi observado entre os
cromossomos 2 e 9. No entanto, quando há um decréscimo do LOD escore condicional, diz-se que há uma interação negativa, o que foi observado entre os cromossomos 7 e 12. A partir de um isolado populacional com gagueira desenvolvimental chamado Hutterites cuja origem envolveu um processo evolutivo conhecido como efeito fundador, Wittke-Thompson et al. (2007) realizaram um novo estudo.
Baseados num diagnóstico sobre na impressão pessoal de cada um dos envolvidos em relação à doença 48 indivíduos foram diagnosticados como gagos desenvolvimentais, dos quais 12, recuperados e 36 persistentes. As primeiras análises de ligação do genoma (GWL, genome-wide linkage) sugeriram evidências no cromossomo 3 (p value 0,013); 13 (p value 0,012) e 15 (p value 0,02). Novas análises, agora envolvendo estudo de associação, apontaram para regiões sobrepostas às anteriormente ligadas, além disso, para uma nova região. O cromossomo 3 (p value 0,0047), o 13 (p value 0,0055) e o 9 (p value 0,0067).
A partir dos dados de Suresh et al. (2006), Wittke-Thompson et al. (2007) realizaram um estudo de meta-análise em 105 famílias o que sugeriu dois novos cromossomos como candidatos: o cromossomo 2 (p value 0,013) e o 5 (p values 0,0051 e 0,015).
Mais recentemente, três novos trabalhos integraram a lista de estudos de ligação envolvendo a gagueira desenvolvimental persistente familial. A partir de uma família paquistanesa consanguínea (PKST77) com gagueira desenvolvimental persistente, Raza et al. (2010) identificaram ligação na região 3q13.31 (LOD escore 3,23). O elevado grau de consanguinidade na população do Paquistão permitiu que o modelo de herança autossômica recessiva fosse assumido nas análises paramétricas. A forte evidência de ligação no cromossomo 3 foi confirmada a partir da genotipagem de marcadores microssatélites e SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) seguidos de nova análise. A região 3q13.2-3q13.33 foi confirmada como ligada com a obtenção de um LOD escore 4,23 para a análise de ligação de ponto e, de 4,92 para análises multiponto.
Posteriomente, uma nova família paquistanesa consanguínea com gagueira desenvolvimental persistente (PKST58) foi identificada com ligação para o fenótipo por Raza et al. (2011) na qual dos 26 membros genotipados, 14 foram diagnósticados com gagueira desenvolvimental persistente. A análise de ligação paramétrica sugeriu ligações nos cromossomos 6, 9, 11, 16 e 21 com LOD escores variando de 2,1 a 2,76. O refinamento do mapa de ligação (genotipagem de marcadores microssatélites) em cada uma das regiões com análises de ligação paramétrica e assumindo variações do modelo
recessivo, confirmaram apenas a região 16q como candidata. Seguindo essas evidências e aplicando-se análises de ligação multiponto, com o mesmo padrão de herança recessivo modificado, um LOD escore de 4,42 foi obtido na região cromossômica 16q12.1-16q23.1.
O último estudo realizado até o momento é o de Raza et al. (2012). Neste trabalho, a partir de uma família africana, proveniente da República de Camarões, denominada CAMST01, foi realizado um extenso e complexo trabalho de mapeamento genético envolvendo análises de ligação. Por tratar-se de uma grande família, rara e sem evidências de consanguinidade, contendo 71 indivíduos, dos quais pelos menos 33 foram diagnosticados como gagos desenvolvimentais persistentes, foram aplicados, a partir da genotipagem de marcadores SNPs e microssatélites, diferentes estratégias para as análises de ligação. O heredograma da CAMST01 foi subdivido em cinco outros menores, que permitiram além de facilitar as análises, em vista de limitações impostas pelos programas, realizar combinações sistemáticas com as “subfamílias” facilitando a identificação das regiões ligadas. Preliminarmente, as regiões 3q, 15q, 2p, 3p, 14q e 15q apresentaram evidências de ligação. A partir do uso combinado das “subfamílias” e de modelos de herança, como entre as regiões 2p e 15q, as análises estimaram um LOD escore de 6,57. Além disso, diversos outros pontos do genoma apontaram para fortes evidências de ligação (2,0 <. LOD escore < 3,0). Essa ampla distribuição de regiões ao longo do genoma, possivelmente envolvidas, deve-se a presença de múltiplos alelos com elevada penetrância em diferentes locis, uma vez que são observados, atipicamente, grande número de afetados.
Um resumo de todos os estudos de ligação é apresentado na tabela 3. De todos os cromossomos apontados por estes trabalhos, apenas nove diferentes cromossomos apresentaram a sobreposição de evidências de ligação em pelo menos dois estudos. No entanto, apenas um cromossomo (cromossomo 3) é tido com condições significativas de ligação (RAZA, M. H. et al., 2010; WITTKE-THOMPSON et al., 2007). Até o momento, de todos os trabalhos, apenas Riaz et al. (2005) foi capaz de servir como referência e, auxiliar na descoberta de genes diretamente envolvidos com o desenvolvimento da gagueira, conforme descobertas posteriores de Kang et al. (2010).
Tabela 3. Estudos de ligação desenvolvidos em famílias portadoras de gagueira desenvolvimental persistente. Trabalhos População Cromossomos com significativa evidência de ligação Outros cromossomos com evidências de ligação
Shugart et al. (2004) Norte-americanos e
descendentes europeus 18 1, 2, 10, 13
Riaz et al. (2005) Paquistaneses
consanguíneos 12 1, 5, 7 Suresh et al. (2006) Norte-americanos com ascendência europeia, suecos e israelenses 9, 15, 2 (condicionalmente) 7 masculino sexo- específico e 21 feminino sexo- específico Wittke-Thompson et al. (2007) Isolado populacional - Hutterites 3, 13 2, 5, 9, 15
Raza et al. (2010) Família paquistanesa
consanguínea 3 -
Raza et al. (2011) Família paquistanesa
consanguínea 16 6, 9, 11, 21
Raza et al. (2012) Família africana
camaronesa 2, 15 3, 14