Genotipagem

4.6.1.1. Marcadores SNP

Para a realização do estudo de ligação no genoma das famílias portadoras de gagueira desenvolvimental persistente todos os indivíduos disponíveis foram genotipados com o uso da plataforma ILLUMINA BeadArray (Illumina, Inc., San Diego, CA – USA).

Para a genotipagem foram utilizados os chips comerciais Sentrix® BeadChip Array – 24X1 InfiniumHD iSelect BC – InfiniumLinkage-24 – HumanLinkage V Panel Set. Neste ensaio cada chip comporta, simultaneamente, amostras de 24 pacientes e é capaz de genotipá-los invidualmente com painéis contendo 6056 marcadores SNP escolhidos pelo fabricante, a partir de validações pelo HapMap DNA assays. Cada marcador neste chip é validado quanto à posição no mapa físico e genético, às distâncias e à sequência única de identificação. Assim, painéis com os arranjos de SNPs, especificamente para análise de ligação, são otimizados para descoberta de ligações entre os genótipos da família e o fenótipo tanto para doenças monogênicas quanto poligênicas.

Para a realização deste ensaio, foram necessários de cada indivíduo 200ng de DNA genômico. A quantidade e a integridade das amostras foram medidas por espectrofotometria e por eletroforese em gel de agarose, conforme descrito anteriormente.

Seguindo o protocolo do fabricante disponível em: www.illumina.com (área do usuário) o resumo dos procedimentos adotados foi:

4.6.1.1.1. Amplificação do DNA genômico

A amplificação das amostras de DNA genômico (200ng) foi iniciada com a fase de denaturação das amostras com MA1 (Multi-sample Amplification 1 Mix) e solução de NaOH [0.1N], seguida de neutralização com MA2 (Multi-sample Amplification 2 Mix). Por fim, para a amplificação, foi adicionado MSM (Multi-Sample Amplification Mix) e incubado a 37 C por 22 horas em forno de hibridização.

4.6.1.1.2. Fragmentação, precipitação, re-suspensão e hibridização

As amostras amplificadas foram fragmentadas enzimáticamente com FMS (Fragmentation Solution) por um proceso controlado (end-point) seguido da etapa de precipitação com PM1 (Precipitation Solution 1) e 2-propanol e, re-suspensão com RA1 (Resuspension, hybridization and wash solution 1). Por fim, as amostras foram dispensada nos BeadChip® arrays para hibridização a 48 C, por 20 horas em forno de hibridização contendo PB2 (Humidifying buffer).

4.6.1.1.3. Lavagens, extensão-marcação dos BeadChip® arrays

Os BeadChip® arrays uma vez hibridizados foram lavados com RA1 para a remoção dos fragmentos de DNA não hibridizados. A reação de extensão de uma única base dos iniciadores hibridizados e sua marcação foi iniciada com a adição de XC1 e XC2 (XStain BeadChip Solution 1 e 2) e TEM (Two-Color Extension Master Mix) promovendo a incorporação de nucleotídeos marcados. Em seguida, foi aplicado formaldeído 95% e EDTA [1mM] para a remoção do DNA hibridizado. Na sequencia, os BeadChip® arrays foram submetidos, sob temperatura de 44 C, a cinco ciclos de banhos intercalados de STM (Superior Two-Color Master Mix) / XC3 (XStain BeadChip solution 3) e ATM (Anti-Stain Two-Color Master Mix) / XC3. Ao final do processo os BeadChip® arrays foram lavados com PB1 e XC4 (XStain BeadChip solution 4) e secos à vácuo.

4.6.1.1.4. Escaneamento e aquisição de dados

Os BeadChip® arrays foram lidos pelo escâner confocal de alta resolução - plataforma Bead Array Reader ILLUMINA® (Illumina, Inc., San Diego, CA – USA).

Os dados referentes ao escaneamento dos BeadChip® arrays foram adquiridos pelo programa BeadScan® (Illumina, Inc., San Diego, CA – USA), mediante a submissão previa de arquivos decodificadores específicos, fornecidos pelo fabricante, para cada BeadChip® array.

4.6.1.1.5. Análise de dados

O programa Illumina GenomeStudio® V2009.2 (Illumina, Inc., San Diego, CA – USA) foi utilizado para a análise dos dados e genotipagem a partir de três arquivos de entrada: o primeiro, em formato Excel (.xls) contendo informações referentes à identificação das famílias, dos indivíduo, posição de referência no BeadChip® array e relação de parentesco; o segundo, arquivo (.bpm) referente aos dados do escaneamento dos BeadChip® array e por último, o arquivo (.egt) específico para o tipo de ensaio, fornecido pelo fabricante.

A qualidade dos genótipos foi analisada a partir do ajuste de parâmetros conforme protocolo do fabricante. De forma bastante ampla, uma das primeiras análises envolveu o parâmetro Gencall Score Cutoff. Os genótipos tiveram sua qualidade mensurada pelo chamado gencall que é um valor de referência (variável de 0 a 1) e que mede a distância entre um determinado genótipo (valor de ponto) e o conjunto de todos os genótipos (cluster). A redução do valor deste parâmetro indica que o genótipo está mais distante do centro do conjunto de genótipos (cluster) aos quais os dados estão associados. Valores de gencall menores que 0,15 não são propriamente genotipados, pois estão tecnicamente muito distantes do centro do cluster e não podem ser denominados como genótipos reais e, portanto o procedimento adotado foi excluí-los (no-call) das análises uma vez que sua presença seria fator crítico para determinar os baixos valores de referência do projeto, comprometendo a qualidade da genotipagem.

Baseando-se neste princípio foram analisados os seguintes parâmetros conforme o protocolo disponível em, www.illumina.com/Documents/products/technotes/technote _infinium _genotyping_data_analysis.pdf:

I. Separação dos conjuntos de genótipos (cluster); II. Frequência de denominação alélica (call frequency);

III. Parâmetro AB R (mede a intensidade normalizada (R) do conjunto de genótipos heterozigoto);

IV. Parâmetro AB T (mede o valor theta normalizado (T) do conjunto de genótipos heterozigoto);

V. Parâmetro MI (identificação de erros de herança mendeliana) e erros P-P- C e P-C (ambos medem os desvios na expectativa de herança dos alelos maternos e paternos);

VI. Erros de reprodutibilidade na denominação dos alelos;

VII. Excesso de heterozigotos (indicador para a quantidade excessiva de denominações alélicas heterozigotas, baseadas na expectativa do equilíbrio de Hardy-Weinberg);

VIII. Baixa frequência alélica (mede a baixa frequência dos alelos e pode auxiliar na identificação de genótipos homozigotos erroneamente nomeados).

Depois de completado os ajustes analíticos acima descritos e a edição dos clusters, o programa Illumina GenomeStudio® V2009.2 (Illumina, Inc., San Diego, CA – USA) realizou cálculos estatísticos das amostras obtendo um conjunto de marcadores SNPs (genótipos) de alta qualidade e que foram exportados em arquivo (.xls) para as análises estatísticas.

4.6.1.2. Marcadores microssatélites

Para o refinamento do mapa genético de ligação foram utilizados marcadores microssatélite selecionados a partir do banco de dados Marshfield Clinic & Mammalian Genotyping Service (diponível em: http://research.marshfieldclinic.org/genetics/home/ índex.asp) e do Ensembl Genome Browser (disponível em: http://www.ensembl.org/ index.html).

A seleção dos marcadores (APÊNDICE A) baseou-se nas taxa de heterozigosidade (de 0,5 a 0,80); posição dentro do mapa genético e, preferencialmente, com motivo de repetição acima de dois nucleotídeos.

Cada um dos iniciadores forward para os microssatélites foi marcado na extremidade 5´ com diferentes fluoróforos os quais uma vez incorporados aos fragmentos de DNA durante a amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction), puderam ser detectados pela análise de fragmentos em sequenciador automático capilar.

4.6.1.2.1. Amplificação por PCR

Os fragmentos de DNA contendo os microssatélites foram amplificados por reações de PCR com volume final de 10,0μl, contendo 2,0μl de DNA genômico [10,0ng/ μl], 0,80μl de dNTPs (dinucleotídeos trifosfatados) [200μM/cada] (Bioline dNTP Mix pH 7,5), 1,0μl de tampão para PCR [1X], 0,6μl de MgCl2 [2,5mM], 0,1μl

da enzima HotStar Taq DNA polimerase [0,025U/μl] (QIAGEN®), 0,1μl de cada iniciador específico [0,2μM] e 5,3ul de água ultra pura.

Para as amplificações in vitro dos fragmentos foram utilizados termocicladores de bloco duplo GeneAmp® ABI 9700 (Applied Biosystems®) de acordo com o programa descrito na tabela 4.

Tabela 4. Programa utilizado nas reações de PCR para marcadores microssatélites.

Fases da reação de PCR Temperatura/Tempo Número de ciclos

Desnaturação inicial 95°C / 15 min

Desnaturação 94°C / 45 seg

35X

Pareamento 57°C / 45 seg

Extensão

72°C / 1 min

Extensão final 72°C / 30 min

4.6.1.2.2. Preparação dos produtos de PCR e eletroforese capilar em sequenciador automatic

Os produtos de PCR marcados foram serialmente diluídos em água ultra-pura antes de serem submetidos à eletroforese capilar em sequenciador automático para a detecção dos fragmentos. Por se tratar de um equipamento altamente sensível na captura dos sinais emitidos pelos fluoróforos tal medida visou ajustar a intensidade dos mesmos conforme o tipo de marcação empregada.

Partindo-se de 10μl do produto de PCR foram realizadas as seguintes diluições: para marcações com fluoróforos 6-FAM, VIC, HEX foram adicionados 30μl de água ultra-pura (Vfinal = 40μl) e, nas marcações com NED, 20μl (Vfinal = 30μl) obtendo-se a

primeira diluição (D1). Em seguida, alíquotas de 2μl de cada uma das diluições anteriores (D1) foram adicionadas a 60μl de água ultra-pura (Vfinal = 62μl)

independentemente do tipo de fluoróforo, obtendo-se a segunda diluição (D2).

Para a análise dos fragmentos foram misturados 1,5μl de D2 (amostra) e 9,0μl de GS500 LIZ® size standard (Applied Biosystems®), diluído previamente em formamida Hi-Di™ (Applied Biosystems®) na proporção de 1:200.

As placas de 96 micropoços MicroAmp® PCR (Applied Biosystems®) contendo a mistura acima referida foram agitadas e centrifugadas para homogeneização da mistura e, encaminhadas para análise dos fragmentos no sequenciador ABI PRISM® 3730 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems®). Arquivos de entrada (.txt) contendo informações referentes ao tipo de marcador e identificação da amostra foram utilizados pelo programa Data Collectionpara a detecção dos fragmentos e armazenamento dos dados em arquivos (.fsa).

4.6.1.2.3. Genotipagem

O programa GeneMapper® v.4.0 (Applied Biosystems®), utilizando-se das informações contidas nos arquivos de saída (.fsa), foi responsável por realizar a genotipagem propriamente dita a partir da identificação e nomeação dos alelos (APÊNDICE B). Para informações detalhadas a respeito consultar o manual do

fabricante (disponível em https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/general

documents/cms_070158.pdf). Uma vez os alelos nomeados, os dados da genotipagem foram exportados em arquivos (.xls) para posterior análise estatística.