57 89 AcOEt:MeOH 9:1 (v/v) 12 13 709 421 AcOEt:MeOH 7:3 (v/v) 14 15 16 17 18 106 90 50 40 17 AcOEt:MeOH 1:1 (v/v) 19 20 37 81 AcOEt:MeOH 2:8 (v/v) 21 22 0 0
5.4 Análises por CLUE-EM-IES de frações contendo acetogeninas
EE e as frações FAE2, FAE2(5.5), FAE2(5.6), FCL3, FCL3.7 e FCL3.9 foram investigadas quanto a presença de acetogeninas por CLUE-EM-IES de acordo com a metodologia descrita por GU, e colaboradores (1997), com modificações.
Inicialmente foi obtido um cromatograma de íons totais (CIT) de EE (Figura 33), para que se pudesse saber em que tempo haveria uma maior abundância de íons. A figura mostra que a maioria dos íons se encontra entre os TR de 7 e 12 minutos, faixa em que se espera a eluição de substâncias de média e baixa polaridade, inclusive acetogeninas. Por isso, selecionou-se esse intervalo do CIT para que a partir dele fosse extraído o espectro de massas, que se encontra na Figura 34. No espectro é possível identificar pelo menos seis picos que poderiam corresponder a acetogeninas através das suas massas moleculares + 1H ([M + H]+), e são eles os picos de massa 613, 597, 595, 579, 563 e 531, os quais corresponderiam a acetogeninas de massa 612, 596, 594, 578, 562 e 530. De acordo com a metodologia utilizada, para que esses picos se confirmassem como de acetogeninas, seria necessário identificar no espectro picos que indicassem uma
subsequente perda de hidroxilas na forma de água (-18 amu) a partir de [M + H]+, além do aduto com sódio [M + Na]+. Cada massa destas citadas está associada a um grupo de isômeros de acetogeninas, que possuem um número determinado de hidroxilas e, portanto, devem apresentar um número determinado de perdas subsequentes de água de acordo com a Tabela 14. Por exemplo, para que se confirmasse que o pico de massa 597, pico de maior intensidade no espectro analisado, está de fato associado ao grupo de acetogeninas de massa 596, seria necessário identificar no espectro um pico de massa 619, correspondendo ao aduto com sódio, e picos de massa 579, 561, 543 e 525, que correspondem à perda de quatro hidroxilas na forma de água. Esses picos podem de fato ser identificados no espectro de EE, assim como aqueles esperados para o grupo de acetogeninas de massa 612, 594, 578, 562 e 530, descritos na Tabela 14.
Tabela 14 - Massa dos fragmentos esperados de acetogeninas de acordo com sua massa molar. M [M + Na]+ [M + H]+ [M + H - H2O]+ [M + H - 2H2O]+ [M + H - 3H2O]+ [M + H - 4H2O]+ [M + H - 5H2O]+ [M + H - 6H2O]+ 530 553 531 513 495 - - - - 562 585 563 545 - - - - - 576 599 577 559 541 - - - - 578 601 579 561 543 - - - - 580 603 581 563 545 527 - - - 594 617 595 577 559 541 - - - 596 619 597 579 561 543 525 - - 612 635 613 595 577 559 541 523 - 614 637 615 597 579 561 543 525 507 624 647 625 607 589 571 553 - -
Figura 33 – Cromatograma de Íons Totais (CIT) do extrato etanólico no modo positivo.
Foram consideradas como mais abundantes no EE, diante da intensidade relativa dos picos dos seus fragmentos, aquelas acetogeninas de massas moleculares 596 e 578. Apesar de alguns dos fragmentos esperados para as acetogeninas com essas massas se sobreporem (Tabela 14), o pico de massa 601, que corresponde ao fragmento [M + Na]+ das acetogeninas de massa 578, claramente se distingue, apontando para a existência de acetogeninas de massa 596 e 578 no EE. É importante ressaltar que estas massas não estão associadas a uma acetogeninas apenas, mas a um grupo de isômeros de acetogeninas e é, portanto, impossível determinar, através dessa metodologia, se está presente no EE, por exemplo, apenas a acetogenina corossolona, de massa 578, ou anocatacina A, também de massa 578, ou ambas. Seria necessário isolar uma substância de massa 578, e em conjunto com a análise de RMN então determinar de qual isômero se trata. A Tabela 15 mostra acetogeninas já isoladas de sementes de A. muricata que correspondem às massas 596 e 578, e pode-se observar que há várias. A anonacina, uma das possíveis acetogeninas encontradas de massa molecular 596, é descrita como majoritária nas diferentes partes de A. muricata, podendo chegar a até 70% do seu conteúdo de acetogeninas (CHAMPY et al. 2005). De fato, no presente estudo os picos relativos à massa molecular 596 foram aqueles com maior intensidade em todas frações e subfrações analisadas, com exceção de FCL 3.7 e FCL3.9, e supõe-se, portanto, que os mesmos estejam associados a anonacina ou
cis-anonacina. Quanto ao grupo de acetogeninas de massa 578, a corossolona é
descrita como acetogenina mais comum e, portanto, provavelmente presente em maior quantidade nas amostras estudadas.
Tabela 15 - Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas moleculares 578 e 596.
M Nome Posição das
hidroxilas Configuração relativa de anéis THF Fórmula molecular 578 Corossolona (CO, 10) 15, 20 tr / t / tr C35H62O6 Anocatacina A 4, 23 t / tr / t / tr C35H62O6 Anocatacina B 4, 23 c / tr / c / tr C35H62O6 596 cis-Anonacina 4, 10, 15, 20 tr, c, tr C35H64O7 cis-Goniotalamicina 4, 10, 13, 18 tr, c, tr C35H64O7
Arianacina + Javoricina 4, 12, 15, 20 tr, t, tr C35H64O7
Gigantetrocina B 4, 14, 17, 18 t / tr-tr C35H64O7
Muricatetrocina A+B 4, 16, 19, 20 t /er ou tr-tr C35H64O7
Muricina A 4, 19, 26, 27 t / tr-tr C35H64O7
Muricina Ba 4, 19, 26, 27 t / tr-tr C35H64O7
Muricina C 4, 21, 24, 25 t / tr-tr C35H64O7
a Possui carbono com configuração S na posição 4, diferentemente de muricina A. De fato é a única acetogenina conhecida com essa configuração;
Legenda: M – massas molar; c - cis; t - trans; er - eritro; tr - treo. Fonte: BERMEJO, e colaboradores (2005).
O espectro de massas de FAE2 (Figura 35) revelou a presença da maioria dos fragmentos também encontrados em EE, com exceção dos fragmentos provenientes de acetogeninas de massa 530 que, ainda que presentes, apresentaram intensidade muito baixa. Estes resultados reiteram os resultados de CLAE-DAD, mostrando que o método de partição líquido-líquido foi eficiente em separar as acetogeninas em uma fração de polaridade média. Em adição aos fragmentos já encontrados em EE, foi possível identificar fragmentos relativos a acetogeninas de massa molecular 580 (Tabela 14), que provavelmente estavam em menor concentração em EE, e por isso ocultos pela presença de outros constituintes. Em FAE2 os grupos de acetogeninas majoritários foram aqueles de massa 578, 580 e 596. A Tabela 16 mostra acetogeninas já isoladas de sementes de A. muricata de massa molar 580 e que podem, portanto, estar presentes em FAE2.
Tabela 16 -Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas 576, 580 e 624.
M Nome Posição das
hidroxilas Configuração relativa de anéis THF Fórmula molecular 576 Coibina C+D (Dupla em C21/19) 17/15, 18/16 tr-c C37H68O4 580 Murisolina 4, 15, 20 tr / t / tr C35H64O6 Corosolina 10, 15, 20 tr / t / tr C35H64O6 Muricina H 19, 24, 25 t / tr-tr C35H64O6 624 cis-Annomontacina 4, 10, 17, 22 tr / c / tr C37H68O7
FAE 2(5.5) e FAE 2(5.6), originadas do fracionamento de FAE2 por CCS, foram analisadas em seguida. FAE 2(5.5) apresentou quase que exclusivamente fragmentos correspondentes a acetogeninas de massa molecular 596 (Figura 36) que, como discutido anteriormente, provavelmente correspondem à anonacina ou
cis-anonacina. FAE 2(5.6), semelhantemente, apresentou principalmente fragmentos
relativos a acetogeninas de massa molecualr 596 (Figura 37), mas também foi possível identificar fragmentos associados a acetogeninas de massa molar 624. O padrão de fragmentação para acetogeninas com essa massa encontra-se na Tabela 14 e, como mostra a Tabela 16, uma única acetogenina com essa massa, cis-anomontacina, foi até o momento isolada de sementes de A. muricata, podendo-se deduzir então, que a mesma está presente em FAE 2(5.6).
Figura 37 - Espectro de massas da FAE 2(5.5) compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.
Figura 36- Espectro de massas da FAE 2(5.6) compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.
FCL3, apesar de ter sido obtida por partição do EE por um método diferente do utilizado para obtenção de FAE2 (Itens 4.2.3.2 e 4.2.3.3, págs. 42-44), apresentou perfil muito semelhante ao desta (Figura 38), com predominância de grupos de acetogeninas de massa molar 578, 580 e 596, aqui representadas pelos seus íons moleculares [M+1], que podem corresponder às acetogeninas descritas nas Tabelas 15 e 16. A partir disso e dos dados já discutidos de CLAE-DAD, pode-se inferir que ambas as metodologias utilizadas para particionar EE foram eficientes em separar acetogeninas. Levando-se em consideração, no entanto, que FCL3 foi obtida a partir de uma única etapa de partição, enquanto que FAE2, a partir de duas, a primeira seria mais adequadamente utilizada para a separação de acetogeninas, já que uma única etapa de partição reduziria a perda de material.
O espectro de massas de FCL 3.7, diferentemente das outras frações, apresentou predominantemente fragmentos associados a acetogeninas de massa
Figura 38 - Espectro de massas da FCL3 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z..
molar 578 e 576, ainda que também estejam presentes fragmentos relativos às acetogeninas de massa molar 596 (Figura 39). A Tabela 14 mostra os fragmentos esperados de acetogeninas com massa molar 576, e a Tabela 16 mostra que apenas duas acetogeninas com essa massa, Coibinas C e D, isoladas em mistura, foram até agora encontradas em sementes de A. muricata. Logo, pode-se inferir que as mesmas se encontram nesta subfração.
Semelhantemente, FCL 3.9 apresentou principalmente fragmentos referentes a acetogeninas de massa molar 578 e 580 e, em menor intensidade, 576. Pela primeira vez, fragmentos associados a acetogeninas de massa molar 596 praticamente não foram detectados (Figura 40).
Em resumo, o grupo de isômeros de acetogeninas de massa molar 596 foi aquele de maior intensidade em EE, FAE2, FAE 2(5.5), FAE 2(5.6) e FCL3. Provavelmente a acetogenina mais abundante com esta massa nestas frações e subfrações seja a anonacina, já descrita como acetogenina majoritária em A.
Figura 39 - Espectro de massas da FCL 3.7 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.
muricata. As frações FCL 3.7 e FCL 3.9, no entanto, apresentaram principalmente
acetogeninas de massa molar 578 e 580, mostrando que as metodologias de separação por CCS, ainda que menos eficientes que metodologias mais sofisticadas como CLAE preparativo, são uma opção válida para separação de acetogeninas. No total, foi possível identificar pelo menos dez grupos de acetogeninas, de acordo com suas massas moleculares (530, 562, 576, 578, 580, 594, 596, 612, 614 e 624), que podem corresponder a mais de vinte diferentes acetogeninas, dado a existência de vários isômeros. O número possível de isômeros de acetogeninas para, praticamente, cada uma das massas molares consideradas faz com que seja virtualmente impossível a diferenciação entre os mesmos em matrizes complexas como são estas frações e subfrações. Para tanto seria necessário o isolamento ou obtenção de misturas com reduzido número de acetogeninas. Os dados disponíveis permitem sugerir a presença das acetogeninas cis-annomontacina e coibinas C e D, uma vez que são as únicas acetogeninas de massas molares 624 e 576, respectivamente, já isoladas de sementes de A. muricata.
Figura 40 - Espectro de massas da FCL 3.9 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.