ANÁLISES POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE

Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetros BRUKER AVANCE DPX200 e DRX400 no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear de Alta Resolução – LAREMAR, Departamento de Química, ICEx, UFMG. Os solventes utilizados na solubilização das amostras foram o clorofórmio deuterado (CDCl3) e o dimetilsulfoxido deuterado (DMSO-d6). Os deslocamentos químicos (δ) foram medidos em ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). Como

referência interna foi utilizado o tetrametilsilano (TMS). Para processar os espectros utilizou-se o programa TOPSPIN 3.0 - Bruker.

4.2.9.1 Identificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações a partir das análises de RMN de 1H e de 13C

O EE e algumas frações foram avaliados quanto a presença de acetogeninas a partir da análise de RMN de 1H e de 13C. Buscou-se por sinais referentes a γ-lactona conforme descrito nas Tabelas 1 e 2, e os sinais referentes ao restante da molécula de acordo com as Tabelas 3 e 4. Aquelas amostras que apresentaram estes sinais foram tidas como positivas para a presença de acetogeninas. Em conjunto com dados obtidos pela análise por CLUE-EM-IES, procurou-se confirmar a presença de alguns tipos específicos de acetogeninas já descritas em A. muricata.

4.2.9.2 Quantificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações por RMN

Para a quantificação de acetogeninas por RMN utilizou-se a metodologia descrita por Machado e colaboradores (2014). As amostras analisadas foram inicialmente dissolvidas em CDCl3, e a elas foi adicionado 1,0 mg de antraceno como padrão interno. Em seguida, na análise por RMN de 1H, compara-se a área de sinais referente ao antraceno e às acetogeninas. Estes devem estar em regiões do espectro com pouca ou nenhuma sobreposição de sinais. No caso do antraceno foram escolhidos os sinais referentes aos quatro α-hidrogênios da molécula, que ocorrem como multipleto em torno de δ 8. Para acetogeninas foram escolhidos sinais de hidrogênios presentes na unidade γ-lactona. No caso de anonacina, o sinal referente ao H-35 que ocorre em torno de δ 7,18, e no caso de solamina, o sinal referente ao H-33, que ocorre em torno de δ 6,97. A partir da relação entre os sinais escolhidos do padrão e da acetogenina analisada é possível obter a concentração através da fórmula a seguir:

Equação 1 - Fórmula para cálculo da concentração de acetogeninas

acetogenina selecionadas para este experimento e aos sinais do padrão interno, respectivamente. MT é a razão entre a massa molar da acetogenina (anonacina ou solamina) e o número de prótons referentes ao sinal em 7,18 (H-33/35 em acetogeninas com OH em C-4) ou 6,98 (H-33/35 em acetogeninas sem OH em C-4) ppm, e MIS a razão entre a massa molar do antraceno e o número de prótons na região de δ 8. WIS é a massa do padrão interno (antraceno) em mg, e WL é a massa da amostra em g.

4.2.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA

4.2.10.1 Atividade anti-promastigota

A atividade anti-promastigota foi avaliada através de uma adaptação do método descrito por Okpekon et al. (2004). Formas promastigotas de L. (L.)

amazonensis, durante a fase logarítmica de crescimento, foram centrifugadas a

3500 rpm por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspenso em meio RPMI completo. Os promastigotas do meio foram quantificados em câmara de Neubauer e ajustados para uma concentração correspondente a 5 x 106 parasitos/100 μL. Esta suspensão foi distribuída em placas de cultura de células com fundo chato que já possuíam as amostras a serem testadas (100 μL/poço). Na figura 12, encontra-se detalhada a disposição das amostras na placa. As concentrações utilizadas para as amotras, e controle de solvente foram 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125 μg/mL. O controle positivo foi realizado pela adição de Anfotericina B nas seguintes concentrações: 25; 12,5; 6,25; 3,125, 1,5625 e 0,7812 μg/mL. As placas foram incubadas a 26 °C por 72h. Após o período de incubação das promastigotas com as amostras e fármacos, foram adicionados 10 μL de uma solução brometo 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) a 5 mg/mL em cada poço. A placa foi coberta com papel alumínio, sucedendo-se nova incubação por 4 h em estufa a 26 °C para que o MTT seja metabolizado e consequentemente fossem formados os cristais de formazam. Após 4 h, foi adicionado 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), para solubilizar os cristais de formazam gerados na metabolização do MTT. Para facilitar esse processo foi empregada agitação manual por 5 min.

Em seguida, realizou-se a leitura da densidade óptica das amostras em leitor de placas de ELISA, no comprimento de onda de 490 nm. A viabilidade da forma promastigota foi avaliada com base na absorbância dos poços, que é proporcional ao MTT metabolizado. A porcentagem de células viáveis (promastigotas) foi calculada pela seguinte fórmula, adaptada de Ngure et al. (2009):

Figura 13 - Fórmula para cálculo de células viáveis Fonte: NGURE e colaboradores (2009)

A concentração inibitória 50% (CI50)é a concentração que causa a redução de 50% das células em crescimento (viáveis) e foi determinada pelo programa GraphPad Prism versão 6.0. Foram adotados os seguintes critérios para determinação de atividade, adaptados de Mota et al. (2015):

Figura 12 - Disposição das amostras nas placas de 96 poços Legenda:

Tabela 8 - Critérios para classificação da atividade leishmanicida de acordo com valores CI50

CI50 µg/mL Resultados

100 Ativo

Entre 101-200 Moderadamente ativo

Acima de 200 Inativo

4.2.10.2 Atividade antiamastigota

O extrato etanólico de sementes de A. muricata e as frações derivadas deste foram avaliados quanto a sua atividade antiamastigota contra macrófagos infectados por L. amazonensis (cepa 199) adaptando-se método de Neal e Croft (1984). Macrófagos imortalizados (linhagem RAW 264.7) foram distribuídos em placas de 24 poços (1x105 macrófagos/poço) contendo lamínulas circulares. Em seguida, após a adesão dos macrófagos às lamínulas, parasitos da espécie L. amazonensis (cepa 199) foram adicionados aos poços (1x106 parasitos por poço). Para que ocorresse a infecção dos macrófagos pelos parasitos, as placas foram mantidas em níveis de oxigênio de demanda biológica por 24h. Após a infecção, os macrófagos foram adicionados aos poços as amostras teste em cinco concentrações (3,12µg/mL a 50µg/ml – fator de diluição 2), em duplicata. As placas contendo os macrófagos infectados e as amostras foram incubadas por um período de 72h. Após este período, as lamínulas foram retiradas dos poços, coradas por Panótico Rápido® e analisadas em microscópio ótico. A taxa de infecção dos macrófagos (número de macrófagos infectados / número de não infectados, após contagem de 300 macrófagos por lamínula, em triplicata) foi determinada para as amostras testes por comparação com a taxa de infecção do controle sem tratamento (100% de infecção).

4.2.10.3 Atividade citotóxica

O extrato etanólico de sementes de A. muricata e as frações derivadas deste foram submetidos à avaliação da citotoxicidade in vitro contra macrófagos murinos RAW 264.7 segundo adaptação de método de Denizot e Lang (1986). Resumidamente, as células foram distribuídas em microplacas de 96 poços (4x105

células/100μL por poço) e incubadas em estufa de CO2 à 37°C por 24h para a adesão das células à placa. Em seguida, foram adicionados 100μL de meio RPMI

completo contendo diferentes concentrações amostras testadas em triplicata. As placas foram incubadas por mais 24h. Ao final deste período, foram adicionados 28μl/poço de uma solução de MTT a 2mg/mL. Após 1h30m de incubação com o MTT foram adicionados 100μl/poço de DMSO. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 570nm. A dose letal mínima que inibe em 50% o crescimento das células na presença amostras testes e controle (Anfotericina B) foi determinada em comparação com células cultivadas apenas em meio de cultura, consideradas 100% de crescimento. Os resultados foram avaliados no programa Origin 8.5 com determinação das curvas dose-resposta traçadas com ajuste sigmoidal. Foram determinadas as concentrações citotóxicas que inibem em 50% o crescimento das células (CC50) em relação aos controles negativos (meio de cultivo com macrófagos, sem amostras-teste ou Anfotericina B).

4.2.10.4 Índice de Seletividade

Para que se pudesse determinar o grau de segurança na utilização das amostras testadas contra as células alvo, no caso, os macrófagos, foi calculado o Índice de Seletividade (IS) de acordo com a seguinte fórmula (PAGÉ et al. 1993):

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO