UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE
FRAÇÕES DE SEMENTES DE ANNONA MURICATA L.
(ANNONACEAE) DE UM CULTIVO EM TOMÉ-AÇU, PARÁ
THIAGO FREITAS SILVA
BELÉM – PA 2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE
FRAÇÕES DE SEMENTES DE ANNONA MURICATA L.
(ANNONACEAE) DE UM CULTIVO EM TOMÉ-AÇU, PARÁ
Autor: Thiago Freitas Silva Orientadora: Prof.ª Dra. Alaíde Braga de Oliveira Co-orientadora: Prof.ª Dra. Maria Fâni Dolabela
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
BELÉM – PA 2017
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE
FRAÇÕES DE SEMENTES DE ANNONA MURICATA L.
(ANNONACEAE) DE UM CULTIVO EM TOMÉ-AÇU, PARÁ
FOLHA DE APROVAÇÃO
Thiago Freitas Silva
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof.ª Dra. Alaíde Braga de Oliveira (Orientadora) Instituição: PPGCF UFPA
Ass:_______________________________________
Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa Instituição: PPGCF UFPA
Ass:_______________________________________
Prof.ª Dra. Edilene Oliveira da Silva Instituição: ICBIO UFPA
Ass:_______________________________________
BELÉM – PA 2017
AGRADECIMENTOS
A Deus, como criador e sustentador de todas as coisas, única base epistemológica suficiente para o conhecimento, e doador de boas dádivas aos homens, dentre as quais a ciência e a racionalidade.
À minha família, na pessoa dos meus pais, como primeiros educadores e tão dedicados mantenedores, sem os quais eu não teria alcançado quase nada do que tive a alegria de alcançar, e na pessoa dos meus irmãos, companheiros de alegrias e tristezas, que me motivam a ser um bom exemplo como irmão mais velho.
À minha noiva e companheira de laboratório, Anna Carolina Pontes, pelo apoio, ânimo, discussão, crítica, compreensão e exemplo, todos prestados com amor e atenção.
À minha orientadora, Profª Drª Alaíde Braga de Oliveira, pela amizade construída, bem como sua inspiradora dedicação à pesquisa, e admirável paciência para ensinar e orientar alguém comparativamente tão inexperiente.
À minha co-orientadora, Profª Drª Maria Fâni Dolabela, por todo apoio, instrução, aconselhamento e amizade.
À doutoranda no PPGCF da UFMG, Tatiane Freitas Borgati, pelo companheirismo e realização das análises por ressonância magnética nuclear, bem como pelo auxílio na interpretação dos resultados.
Aos colegas mestrandos, Mirian Bastos, João Silva, Valdicley Vale e Heliton Brigido, por toda ajuda na realização do trabalho, risadas compartilhadas, e refeições divididas com alegria, regadas a conversas que podem mudar o mundo.
Ao Prof Dr Geraldo Célio Brandão, pela realização das análises por massas e auxílio na interpretação dos resultados.
Ao ICBIM, da UFU, nas pessoas da Profª Drª Renata C. de Paula, Iasmin Araújo e Juliana Miranda, pela realização dos testes de citotoxicidade e atividade anti-amastigota.
À UFPA, em especial à secretaria e coordenação do PPGCF, representadas pelas sras. Cliciane Melo e Maria Brasília, e pelo Prof Dr José Luiz Vieira.
Aos amigos do Laboratório de Farmacologia e Doenças Negligenciadas da UFPA, e Laboratório de Fitoquímica da UFMG, pela prontidão em ajudar, compartilhando conhecimento ou emprestando uma mão amiga, e por me receberem tão bem, ainda que sendo um aluno de outra instituição.
EPÍGRAFE
“Quem tem conhecimento é comedido no falar, e quem tem entendimento é de espírito sereno”
-Bíblia Sagrada (NVI), Pv 17.27
“Pois o Senhor é quem dá sabedoria; de sua boca procedem o conhecimento e o discernimento”
-Bíblia Sagrada (NVI), Pv 2.6
“O saber ensoberbece, mas o amor edifica”
-Bíblia Sagrada (ARA), 1 Co 8.1
“O primeiro passo em direção ao conhecimento é saber que somos ignorantes”
RESUMO
SILVA, T. F. Análise fitoquímica e atividade leishmanicida de frações de
sementes de Annona muricata L. (Annonaceae) de um cultivo em Tomé-Açu, Pará. Dissertação, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal do Pará, Belém, 2017.
A leishmaniose é uma doença parasitária que representa um problema de saúde mundial. Poucos fármacos estão disponíveis para seu tratamento e estes apresentam graves efeitos colaterais, toxicidade, além de resistência do parasito e o inconveniente da administração parenteral. Annona muricata L., conhecida no Brasil como graviola, constitui rica fonte de acetogeninas, uma classe de produtos naturais com comprovada atividade leishmanicida. Este trabalho teve como objetivo identificar, quantificar e avaliar a atividade leishmanicida de frações ricas em acetogeninas de A. muricata contra formas promastigotas e amastigotas de
Leishmania amazonensis. A partir de sementes coletadas de três exemplares em
Tomé-Açu, Pará, foi preparado um extrato etanólico (EE) por percolação. O EE foi submetido a três diferentes processos de partição líquido-líquido envolvendo solventes de diferentes polaridades, gerando 9 frações: FH1, FCL1, FMH1, FDM2, FAE2, FMH2, FCL3, FAE3 e FMH3. As frações FAE2 e FCL3 foram submetidas a fracionamento por coluna cromatográfica (CC). Análises espectométricas revelaram as frações FAE2 e FCL3 e suas subfrações como as mais ricas em acetogeninas, contento 10 diferentes grupos de acetogeninas. Observou-se ainda uma concentração das acetogeninas em solventes de polaridade média, como acetato de etila e clorofórmio. As frações e subfrações avaliadas foram ativas contra formas promastigotas de L. amazonensis (6,48 ≤ CI50 ≤ 24,36 µg/mL), porém foram
citotóxicas contra macrófagos murinos, apresentando, portanto, baixo índice de seletividade (0,98 ≤ IS ≤ 2,68). Esta citotoxicidade, no entanto, aponta para uma atividade antitumoral. Quanto a atividade anti-amastigota, as amostras foram pouco ativas (9 ≤ % de infecção ≤ 48).
Palavras-chave: acetogeninas; atividade leishmanicida; Annona muricata; RMN
ABSTRACT
SILVA, T. F. Phytochemical analysis and leishmanicidal activity of fractions from seeds of Annona muricata L. (Annonaceae) from a cultivation in Tomé-Açu, Pará. Master’s degree, Pharmaceutical Sciences Postgraduation Program,
Universidade Federal do Pará, Belém, 2017.
Leishmaniasis is a parasitic disease that represents a health problem around the world. Few drugs are available for its treatment, and these present serious collateral effects, toxicity, parasite resistance and the inconvenience of parenteral administration. Annona muricata L., known in Brazil as graviola, is a rich source of acetogenins, a class of natural products with proven leishmanicidal activity. This work aimed to identify, quantify and evaluate the leishmanicidal activity of acetogenin rich fractions of A. muricata against promastigote and amastigote forms of Leishmania
amazonensis. An ethanol extract (EE) was prepared by percolation from seeds
collected from three specimens in Tomé-Açu, Pará. EEwas submitted to liquid-liquid partition by 3 different processes with solvents of varying polarity, giving 9 fractions: FH1, FCL1, FMH1, FDM2, FAE2, FMH2, FCL3, FAE3 and FMH3. Separations by column chromatography (CC) of fractions FAE2 and FCL3 were also performed. Spectrometric analyses revealed fractions FAE2 and FCL3 and its subfractions as acetogenin rich, containing 10 different groups of acetogenins. It was also observed a concentration of the acetogenins in medium polarity solvents as ethyl acetate and chloroform. The fractions and subfractions evaluated were active against promastigote forms of L. amazonensis promastigotes (6,48 ≤ CI50 ≤ 24,36 µg/mL), but
cytotoxic against murine macrophages, thus presenting low selectivity index (0,98 ≤ SI ≤ 2,68).This cytotoxicity, though, points to a antitumoral effect. Regarding the anti-amastigote activity, the samples had low activity (9 ≤ % of infection ≤ 48).
LISTA DE ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de Etila
CCS Cromatografia em Coluna de Sílica CCD Cromatografia em Camada Delgada CI50 Concentração Inibitória de 50%
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência DAD Detector de Arranjos de Diôdo
DMSO Dimetilsulfóxido
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado
EE Extrato Etanólico
ESI Eletrospray Ionization
EtOH Etanol
FAE2 Fração Acetato de Etila Partição 2 FCL3 Fração Clorofórmio Partição 3
HEX n-Hexano
MeOH Metanol
RPMI Roswell Park Memorial Institute TMS Tetrametilsilano
UV Ultravioleta
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo biológico de Leishmania spp. ... 24 Figura 2- Estruturas químicas de fármacos leishmanicidas: (A) Anfotericina (B) Miltefosina (C) Estibogluconato de sódio (Pentostam®) (D) Paromomicina (E)
Antimoniato de meglumina (Glucantime®) (F) Pentamidina ... 26
Figura 3 - (A) Arbusto; (B) flor; (C) botão de flor e (D) fruto de Annona muricata ... 28 Figura 4 – Diferentes tipos de unidades γ- lactona que ocorrem em acetogeninas .. 30 Figura 5 – Estruturas químicas de acetogeninas com unidade γ-lactona do tipo A .. 31 Figura 6 - Exemplo de fragmentações características de acetogeninas em espectometria de massas com ionização por impacto eletrônico (Coibina A) ... 37 Figura 7 - Estruturas químicas de anonacina (A) e uvaricina (B) ... 38 Figura 8 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 1. MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1 ... 46
Figura 9 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 2. MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1 ... 47
Figura 10 - Fluxograma da separação dos cristais formados no Extrato Etanólico da porção solúvel em n-hexano. ... 47 Figura 11 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 3. MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1 ... 48
Figura 12 - Disposição das amostras nas placas de 96 poços... 55 Figura 13 - Fórmula para cálculo de células viáveis ... 55 Figura 14 – Cromatograma por CCD do extrato etanólico e porção solúvel em n-hexano ... 63 Figura 15 – Cromatograma por CCD das frações provenientes das partições ... 63 Figura 16 - Cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico e suas frações com tempo de retenção (TR) de picos de interesse... 65 Figura 17 - Espectros de absorção no UV de picos do Extrato Etanólico registrados por CLAE-DAD ... 66 Figura 18 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da primeira partição ... 67 Figura 19 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas por CLAE-DAD referentes às frações da primeira partição ... 68 Figura 20 - Estruturas químicas de duas acetogeninas ... 68
Figura 21 - Espectros de absorção no UV online dos picos majoritários nos cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição ... 70 Figura 22 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição ... 70 Figura 23 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma por CLAE-DAD referentes à fração acetato de etila 2 (FAE2). ... 71 Figura 24 – Cromatogramas em CLAE-DAD das frações da terceira partição ... 72 Figura 25 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas em CLAE-DAD referentes às frações da terceira partição ... 72 Figura 26 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma em CLAE-DAD referentes à fração clorofórmica 3 (FCL3). ... 73 Figura 27- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a partir da fração acetato de etila 2 por cromatografia de coluna em duas diferentes programações. ... 75 Figura 28 - Espectros de absorção no UV online de picos no cromatograma por CLAE-DAD da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a partir da fração acetato de etila por cromatografia de coluna ... 76 Figura 29- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração FAE2(5.5) e espectros no UV online dos picos majoritários. ... 78 Figura 30- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração FAE2(5.6) e espectros no UV online dos picos majoritários. ... 78 Figura 31 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas por CLAE-DAD referentes à subfração FAE2(5.5). ... 79 Figura 32 - - Espectros de absorção no UV online de picos nos cromatogramas por CLAE-DAD referentes à subfração FAE2(5.6). ... 79 Figura 33 – Cromatograma de Íons Totais (CIT) do extrato etanólico no modo positivo. ... 83 Figura 34 – Espectro de massas do Extrato Etanólico registrado na faixa de 450 a 700 m/z. ... 83 Figura 35 - Espectro de massas da FAE2 registrado no intervalo de 450 a 700 m/z. ... 86 Figura 36- Espectro de massas da FAE 2(5.6) compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ... 87 Figura 37 - Espectro de massas da FAE 2(5.5) compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ... 87 Figura 38 - Espectro de massas da FCL3 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.. ... 88
Figura 39 - Espectro de massas da FCL 3.7 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ... 89 Figura 40 - Espectro de massas da FCL 3.9 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ... 90 Figura 41 - Espectro de RMN de 1H de EE, com destaques para os deslocamentos
característicos de acetogeninas ... 92 Figura 42 - Espectro de RMN de 1H de FAE2 seccionado, com destaques para os
deslocamentos característicos de acetogeninas ... 93 Figura 43 - Espectro de RMN de 1H de FCL3 seccionado, com destaques para os
deslocamentos característicos de acetogeninas ... 94 Figura 44 - Espectro de RMN de 1H de EE com adição de antraceno e amplianção
da região com sinais utilizados para quantificação ... 96 Figura 45 - Espectros de RMN 1H de FAE2, FCL3, FCL3.7 e FCL3.12, com adição
de antraceno e amplianção da região com sinais utilizados para quantificação ... 97 Figura 46 - Estruturas químicas das acetogeninas anonacina e solamina ... 98 Figura 47 - Estruturas químicas das acetogeninas corossolona e coibina C ... 99 Figura 48 – Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota de FCL 3.12 ... 102 Figura 49 - Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota de FCL 3.12 ... 102 Figura 50 - Estrutura química da acetogenina bulatacina ... 103
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos
de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 1H ... 33
Tabela 2 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 13C ... 33
Tabela 3 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes acetogeninas em espectros de RMN de 1H ... 34
Tabela 4 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes acetogeninas em espectros de RMN de 13C ... 35
Tabela 5 - Programação A: Condições utilizadas nas análises por CLAE-DAD... 50
Tabela 6 - Programaçao B: Condições utilizadas nas análises por CLAE-DAD... 50
Tabela 7 - Condições utilizadas nas análises por CLUE-DAD-IES-MS ... 51
Tabela 8 - Critérios para classificação da atividade leishmanicida de acordo com valores CI50 ... 56
Tabela 9 - Rendimentos do processo extrativo das sementes de Annona muricata e partições do extrato etanólico... 60
Tabela 10- Resultados da detecção de acetogeninas por cromatografia em camada delgada ... 62
Tabela 11 – Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o eluente utilizado, na coluna cromatográfica da fração acetato de etila 2 (FAE2) ... 74
Tabela 12 - Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o eluente utilizado, na coluna cromatográfica da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a partir da fração acetato de etila 2 ... 77
Tabela 13 - Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o eluente utilizado, na coluna cromatográfica da fração clorofórmica da terceira partição (FCL3) ... 80
Tabela 14 - Massa dos fragmentos esperados de acetogeninas de acordo com sua massa molar. ... 82
Tabela 15 - Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas moleculares 578 e 596. ... 84
Tabela 16 - Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas 576, 580 e 624. ... 85
Tabela 17 - Concentrações de acetogeninas obtida por qRMN de 1H no extrato etanólico e frações analisadas ... 95
Tabela 18 - CI50 das subfrações analisadas para atividade antipromastigota em
Leishmania amazonensis ... 100 Tabela 19 - Atividade anti-amastigota em Leishmania amazonensis das subfrações analisadas (percentual de infecção). ... 101 Tabela 20 - Valores da concentração citotóxica (CC50) das frações analisadas em
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 18 2 REVISÃO DA LITERATURA ... 21 2.1 Leishmaniose ... 21 2.2 Annona muricata L. ... 26 3 OBJETIVOS ... 40 3.1 Objetivo geral ... 40 3.2 Objetivos específicos ... 40 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 41 4.1 Material ... 41 4.1.1 EQUIPAMENTOS ... 41 4.1.2 SOLVENTES ... 41 4.1.3 FASES ESTACIONÁRIAS ... 41
4.1.4 MEIO DE CULTURA E OUTROS ... 42
4.1.5 REVELADORES PARA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) ... 42
4.1.5.1 Anisaldeído - Ácido Sulfúrico (AS) ... 42
4.1.5.2 Reagente Kedde ... 42
4.1.6 PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO ... 42
4.1.7 MATERIAL BIOLÓGICO ... 43 4.1.7.1 Parasito Leishmania ... 43 4.1.8 MATERIAL VEGETAL ... 43 4.2 Métodos ... 44 4.2.1 ANÁLISES FARMACOGNÓSTICAS ... 44 4.2.1.1 pH ... 44
4.2.1.2 Perda por dessecação ... 44
4.2.1.3 Teor de cinzas totais ... 44
4.2.1.4 Densidade aparente ... 44
4.2.1.5 Granulometria ... 45
4.2.3 PARTIÇÕES LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO ETANÓLICO DE
SEMENTES (EE) ... 45
4.2.3.1. Método 1 - Primeira partição líquido-líquido ... 45
4.2.3.2. Método 2 - Segunda partição líquido-líquido ... 46
4.2.3.3. Método 3 - Terceira partição líquido-líquido ... 47
4.2.4 FRACIONAMENTO DE FAE2 POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE SÍLICA GEL (CCS) ... 48
4.2.5 - FRACIONAMENTO DE FCL3 POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE SÍLICA GEL (CCS) ... 49
4.2.6 DETECÇÃO DE ACETOGENINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGAGA (CCD) ... 49
4.2.7 ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA A DETECTOR DE ARRANJOS DE DIÔDOS (CLAE-DAD). ... 50
4.2.8 ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIÊNCIA ACOPLADA A DETECTOR DE ARRANJO DE DIÔDOS (CLUE-DAD) E ESPECTÔMETRO DE MASSAS COM IONIZAÇÃO POR ELECTROSPRAY (IES-MS) ... 51
4.2.8.1 Identificação de acetogeninas no extrato e frações a partir das análises por CLUE-EM-IES ... 51
4.2.9 ANÁLISES POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE HIDROGÊNIO E CARBONO-13 (RMN de 1H e de 13C)... 52
4.2.9.1 Identificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações a partir das análises de RMN de 1H e de 13C ... 53
4.2.9.2 Quantificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações por RMN 53 4.2.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA ... 54
4.2.10.1 Atividade anti-promastigota ... 54
4.2.10.2 Atividade antiamastigota ... 56
4.2.10.3 Atividade citotóxica ... 56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 58
5.1 Características farmacognósticas do pó das sementes de Annona muricata .. 58
5.2 Investigação de acetogeninas por CCD e CLAE-DAD ... 59
5.2.1 EXTRATO ETANÓLICO E FRAÇÕES DAS PARTIÇÕES ... 59
5.2.2 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DE FAE2 E FCL3 ... 73
5.5 Identificação e quantificação de acetogeninas por qRMN de 1H ... 91
5.6 Atividade antileishmania ... 98
6 CONCLUSÃO ... 104
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são um grupo de doenças negligenciadas, comumente associadas à pobreza, e que tem maior ocorrência em países do norte e leste africano, do sudeste asiático e América Latina. Estima-se que 1,5 milhões de novos casos ocorram por ano no mundo, provocando entre 20 e 30 mil óbitos. São duas as principais manifestações clínicas desta patologia, a leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT). O Brasil é um dos seis países responsáveis por 90% dos casos de LV no mundo. Esta forma da doença atinge 23 das 27 Unidades Federativas, ocasionando de 200 a 300 óbitos/ano. A LT pode ser encontrada em todas as Unidades Federativas, com registro de 233.638 casos entre os anos de 1990 e 2013, os quais se concentram principalmente na região Norte. O Brasil se encontra no grupo de países nos quais ocorre um terço dos casos de LT no mundo (BRASIL, 2014; WHO, 2015).
As leishmanioses são causadas por parasitos de mais de 20 espécies do gênero Leishmania, os quais geram diferentes manifestações da doença, ou casos assintomáticos (BATES, 2008; WHO, 2015). A LV é a forma mais grave, letal se não tratada, e caracteriza-se por febre, perda de peso, hepato-esplenomegalia e anemia. A LT subdivide-se em três: a leishmaniose cutânea localizada (LCL), forma mais comum da doença, manifesta-se através de lesões no local da infecção, as quais são indolores, com bordas bem definidas, fundo avermelhado e base eritematosa. A leishmaniose muco-cutânea (LMC), que causa lesões destrutivas localizadas na mucosa, em geral nas vias aéreas superiores. E a leishmaniose cutânea difusa (LCD), uma forma rara de leishmaniose, relacionada a uma reação imune inadequada. Nesta, uma disseminação do parasito leva ao surgimento de várias lesões não ulcerosas espalhadas pelo corpo (BRASIL, 2014).
O tratamento das leishmanioses, no Brasil, é realizado principalmente por quimioterapia com antimoniais pentavalentes (Sb5+) como Glucantime® ou,
alternativamente, Anfotericina B e Pentamidina. Em geral, os fármacos utilizados contra a leishmaniose requerem tempo prolongado de uso, administração via parenteral e provocam vários efeitos adversos. Estes fatores levam a uma baixa adesão à terapia, o que tem contribuído para o surgimento de parasitos resistentes.
Este quadro aponta a necessidade de desenvolvimento de novos fármacos leishmanicidas. Na área de pesquisa, desenvolvimento e inovação de fármacos várias estratégias podem ser adotadas, dentre as quais a validação do uso popular de plantas com fins medicinais, e a obtenção de moléculas promissoras a partir de plantas (BRASIL, 2014; WHO, 2010).
Annona muricata, árvore arbustiva comum na região Norte, é conhecida no
Brasil como graviola, e possui importância econômica principalmente devido a seus frutos, que são comercializados na forma de polpa, sucos, doces e sorvetes. Além disso, a graviola também é utilizada para fins medicinais. A decocção das suas folhas, por exemplo, é utilizada por comunidades tradicionais brasileiras como analgésico, para emagrecimento e contra o diabetes, e o suco da fruta contra parasitos intestinais (BENEVAL et al. 2016; CAETANO, SOUZA e FEITOZA, 2014). Em outras partes do mundo, no entanto, diferentes usos são atribuídos a várias partes da planta. De especial interesse é a utilização de suas folhas por nativos da Malásia para tratar úlceras decorrentes da leishmaniose tegumentar (BADRIA e SCHAUSS, 2009). Estudos científicos têm servido de fundamentação para este uso ao identificar extratos metanólicos e etanólicos de diferentes partes de A. muricata com atividade promissora contra promastigotas de diferentes espécies de
Leishmania, relacionando esta atividade à presença de acetogeninas nestes extratos
(OSORIO et al. 2007; VILA-NOVA et al. 2013). As acetogeninas são uma classe de metabólitos secundários presentes em todas partes de A. muricata, mas encontrados em maior abundância nas sementes (MOGHADAMTOUSI et al. 2015). Portanto, ainda que o uso tradicional da graviola contra leishmaniose esteja mais relacionado às suas folhas, uma vez que sua atividade leishmanicida está associada a presença de acetogeninas, e as mesmas encontram-se principalmente nas sementes, levando-se em consideração ainda que as sementes são uma parte da planta normalmente descartada no processo produtivo de polpas, estas despontam como de interesse para estudos que investiguem sua atividade leishmanicida, visando seu aproveitamento (LIAW et al. 2010).
Este trabalho buscou avaliar a atividade leishmanicida de sementes de graviola cultivadas na região amazônica (Tomé-Açu, Pará), a qual, sendo comprovada, poderia incentivar o aproveitamento das sementes e, portanto,
agregaria valor ao que normalmente é tratado como resíduo no processo de beneficiamento da graviola para produção de polpas, doces, etc., uma atividade bastante explorada no estado do Pará. Além disso, uma maior valorização das sementes de A. muricata contribuiria para o crescimento da agricultura familiar, principal responsável pelo seu cultivo hoje (LEMOS, 2014; SOUZA, PEREIRA e FONSECA, 2012).
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Leishmaniose
As leishmanioses, um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero
Leishmania, estão entre as doenças classificadas como doenças tropicais
negligenciadas. Possuem uma prevalência global de 14 milhões de casos e uma incidência anual de 1,5 a 2 milhões de novos casos. São também responsáveis por 20 a 30 mil mortes por ano, estimando-se que 350 a 400 milhões de pessoas estejam em risco de infecção. Este grupo de doenças ocorre em 98 países, sendo que 79 destes são países em desenvolvimento (ALVAR et al. 2006; WHO, 2010).
As leishmanioses podem ser classificadas em dois tipos, de acordo com suas manifestações clínicas, que são: Leishmaniose Visceral (LV), e Leishmaniose Tegumentar (LT). Esta última se subdivide em: cutânea localizada (LCL); mucocutânea (LMC); e cutânea difusa (LCD). A forma da doença que irá se manifestar depende da espécie do parasito infectante; da espécie do vetor transmissor; e de características do hospedeiro (genéticas e de resposta imune). Esta multiplicidade de fatores torna a leishmaniose uma das doenças de mais complexa epidemiopatogênese (SHARMA e SINGH, 2008; WHO, 2015).
No mundo todo são registrados de 200 a 400 mil novos casos de LV por ano. Destes, 90% ocorrem em apenas cinco países, entre os quais está o Brasil, onde o agente causador desta doença é Leishmania (Leishmania) chagasi. O Brasil é o responsável pela quase totalidade de casos de LV nas Américas. Casos autóctones são relatados em 22 dos Estados brasileiros, estando a maioria deles concentrados na região Nordeste (BRASIL, 2014; WHO, 2015). A LV é a forma mais perigosa de leishmaniose e leva a óbito em 90% dos casos se não tratada (BRASIL, 2010).
A LT possui ampla distribuição mundial, com mais de 1 milhão de casos registrados por ano. Nas Américas pode ser encontrada desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina, com exceção de Chile e Uruguai. O Brasil encontra-se entre os encontra-sete paíencontra-ses do mundo com maiores taxas de leishmanioencontra-se cutânea, e é o país da América do Sul com maior número de casos (ALVAR et al. 2012). No Brasil, desde 2003, são notificados casos autóctones de LT em todos os Estados da
Federação, e a região Norte é a que possui o maior número de casos confirmados, tendo sido registrados 233.638 casos entre os anos de 1990 e 2013 (BRASIL, 2014). A LT é uma doença dermatológica infecciosa, não contagiosa que, ainda que muitas vezes não seja fatal, exige atenção por causar deformidades que afetam tanto o âmbito psicossocial como podem incapacitar o indivíduo infectado para exercer suas funções (REITHINGER, 2005).
A LCL, forma mais comum da LT, é uma forma de leishmaniose em que os parasitos se restringem ao local da infecção, causando lesões limitadas que podem ser múltiplas. Esta forma de leishmaniose em muitos casos segue com cura espontânea ou gera um caso assintomático, o que pode ser um problema, pois o infectado passa a agir como reservatório. A LCL pode ser causada por: Leishmania
(Viannia) guyanensis, Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis (BRASIL, 2014).
A LMC é um tipo de leishmaniose que gera mutilações mucocutâneas. Ela inicia-se com uma infecção local, através da qual os parasitos chegam até as mucosas por via linfática ou hematogênica, e ali, devido a uma resposta imune exagerada, ocorrem as lesões. Estas lesões comumente sofrem infecção bacteriana secundária e, diferentemente da LCL, não cicatrizam por si só, o que pode agravar o quadro geral do paciente e eventualmente levar a óbito. O principal agente causador da LMC no Brasil é a L. (V.) braziliensis (LOPES et al. 2010).
A LCD é a forma mais rara de LT e se origina por uma complicação imunológica do hospedeiro. Caracteriza-se por uma intensa proliferação do parasito, gerando várias lesões crônicas não ulcerosas com formação de pápulas, nódulos ou infiltrações difusas. Muitas vezes mesmo com o tratamento a doença não involui, ou então após curto período de tempo há recidiva. No Brasil, a espécie causadora de LCD é L. (L.) amazonensis (BARRAL et al. 1995).
Leishmania é um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida,
família Trypanosomatidae e gênero Leishmania. Este gênero se subdivide em complexos agrupados em dois subgêneros: Leishmania e Viannia. O subgênero
Leishmania reúne espécies causadoras de LT e LV, e são algumas delas: L. (L.) major e L. (L.) tropica, responsáveis pela leishmaniose tegumentar no Velho Mundo;
L. (L.) mexicana, L. (L.) amazonensis, L. (L.) pifanoi e L. (L.) venezuelensis,
causadoras de leishmaniose tegumentar nas Américas; e L. (L.) donovani, L. (L.)
infantum e L. (L.) chagasi, causadoras de leishmaniose visceral. Já o subgênero Viannia agrupa espécies causadoras de LT apenas, como: L. (V.) braziliensis, L. (V). guyanensis, L. (V.) panamensis, e L. (V.) peruviana (LAINSON e SHAW, 1987). No
total, são cerca de vinte espécies patogênicas ao homem (CDC, 2014).
O ciclo biológico dos parasitos causadores da leishmaniose (Figura 1) ocorre quando a fêmea infectada do inseto flebotomíneo do gênero Phlebotomus (vetores nos países do Velho Mundo) ou Lutzomyia (vetores nos países do Novo Mundo), introduz na pele de um mamífero suscetível formas promastigotas metacíclicas do parasito Leishmania (COLLIN et al. 2009; NEVES et al. 2016). No hospedeiro vertebrado, os promastigotas são fagocitados por células mononucleares, principalmente macrófagos, nos quais ficarão restritos ao fagolisossomo (junção do fagossomo com lisossomos). Ali, por influência do ambiente ácido, os promastigotas transformam-se em amastigotas, os quais diminuem a atividade microbicida do macrófago. Após a transformação, eles se multiplicam por divisão binária até que o macrófago se rompa, liberando novos amastigotas que poderão infectar células dendríticas, fibroblastos ou outros macrófagos. O ciclo tem continuidade quando o flebotomíneo se infecta com o parasito ao ingerir células dendríticas ou macrófagos infectados por amastigotas, os quais se transformarão em promastigotas em seu trato gastrointestinal e se multiplicarão por divisão binária até atingirem o estágio de promastigotas metacíclicas, quando o inseto poderá inoculá-las em um novo hospedeiro mamífero, reiniciando-se o ciclo (SHARMA e SINGH, 2008). Apesar desta ser a forma clássica de transmissão da leishmaniose, a infecção também pode ocorrer por transfusão sanguínea, transplante de órgãos ou congenitamente (PAVLI e MALTEZOU, 2010). Além do homem, existem outros hospedeiros vertebrados para a Leishmania, como: roedores, marsupiais e canídeos, inclusive o cão doméstico (Canis familiaris) (GRAMICCIA e GRADONI, 2005).
Figura 1 - Ciclo biológico de Leishmania spp.
Fonte: SILVA, 2012.
Os fármacos de primeira escolha na terapia leishmanicida são os antimoniais pentavalentes (Sb5+), os quais foram desenvolvidos há mais de 70 anos. Existem
dois principais fármacos deste tipo utilizados, o estibogluconato de sódio (Pentostan®) e o antimoniato de meglumina (Glucantime®). O primeiro é produzido
no Reino Unido e geralmente utilizado nos países que o compõe, nos EUA e na maioria dos países da África e Oriente Médio, enquanto o segundo, produzido na França e no Brasil, é mais comumente utilizado em países de língua francesa e na América Latina. Ambos apresentam eficácia limitada, efeitos tóxicos e colaterais frequentes, administração parenteral, e restrição de uso no caso de grávidas e pacientes infectados com HIV (AMATO et al. 2000). Associado a esses fatores, o tratamento prolongado (no mínimo 20 dias, podendo chegar até 40 dias) com altas doses faz com que muitos pacientes abandonem o tratamento antes do seu término, favorecendo o surgimento de resistência do parasito em larga escala. Na Índia por exemplo, o tratamento com antimoniais foi banido, uma vez que em algumas localidades as cepas que infectavam a população possuíam 100% de resistência a esse fármaco (MOHAPATRA, 2014).
Uma opção ao tratamento com antimoniais é a Anfotericina B, um antibiótico que age ligando-se ao ergosterol da membrana plasmática do parasito, aumentando
Transmitidos durante repasto
Transmitidos durante repasto
sua permeabilidade e afetando seu equilíbrio osmótico, causando sua morte. Este fármaco também é de administração parenteral e possui uma série de efeitos tóxicos graves e tratamento igualmente longo, o que restringe seu uso (MOLINA et al. 2007). No entanto, há uma versão deste medicamento conhecida como Anfotericina B Lipossomal que utiliza nanotecnologia para restringir a ação da molécula às células do sistema fagocitário mononuclear, reduzindo assim grandemente seus efeitos adversos. Esta seria a melhor escolha medicamentosa para o tratamento da leishmaniose, mas seu alto custo restringe seu uso em larga escala (BRASIL, 2007; RATH et al. 2003).
Existem ainda outros fármacos leishmanicidas considerados de segunda linha como a Paromomicina, Pentamidina (Lomidina®) e Miltefosina. Apesar da
Pentamidina ser a mais utilizada como fármaco de segunda escolha, é importante chamar a atenção para a Miltefosina, que é o único medicamento utilizado no tratamento das leishmanioses que possui administração por via oral, além de apresentar menos efeitos adversos que os demais. Seu uso se dá principalmente na Índia, mas possui limitações pelo seu efeito teratogênico e pequena janela terapêutica (SINGH, KUMAR e SINGH, 2012).
Em síntese, os fármacos disponíveis para o tratamento da leishmaniose possuem efeitos tóxicos e graves reações adversas (MOLINA et al. 2007), o tempo de tratamento é prolongado e na maioria dos casos por via parenteral, sendo ainda o custo do tratamento elevado (BRASIL, 2014), e a resistência do parasito crescente (MOHAPATRA, 2014).
Mediante o exposto, a busca de novos fármacos assume um caráter de urgência e as plantas despontam como fontes de novas moléculas ativas (CRAGG e NEWMAN, 2013; WHO, 2010).
2.2 Annona muricata L.
A família Annonaceae, à qual pertence a espécie Annona muricata L., é a maior das 6 famílias pertencentes à ordem Magnoliales, e junto da família Magnoliaceae está entre as mais estudadas da ordem citada (APG, 2003). Também conhecida como custard apple family, ou família da ata, esta possui cerca de 135 gêneros e 2500 espécies, as quais podem ser encontradas principalmente em zonas tropicais, sendo algumas poucas espécies encontradas em regiões temperadas (RICHARDSON et al. 2004). Constituída por árvores, arbustos e mais raramente trepadeiras, usualmente perenifólias, esta família recebe seu nome da palavra latina
(B)
(A)
(C)
(D)
(F)
(E)
Figura 2- Estruturas químicas de fármacos leishmanicidas: (A) Anfotericina (B) Miltefosina (C) Estibogluconato de sódio (Pentostam®) (D) Paromomicina (E) Antimoniato de meglumina (Glucantime®) (F) Pentamidina
anon, que significa algo como produção precoce, referindo-se à grande produção de
frutos característica nas Annonaceae (NRCS, 2008).
Muitas das espécies de Annonaceae possuem grande importância econômica como fonte de frutos e óleos comestíveis, como por exemplo Annona squamosa,
Annona muricata e Annona senegalensis; outras como fonte de fragrâncias para a
perfumaria, como Cananga odorata; e de maneira geral, muitas são usadas medicinalmente em vários países para o tratamento de diversas enfermidades, inclusive no tratamento de males associados ao câncer, e tumores (BINDU, 1998; MOGHADAMTOUSI et al. 2015).
Apesar de, relativamente ao seu tamanho, a família Annonaceae ser considerada umas das famílias menos estudadas fitoquimicamente (BINDU, 1988), já foram identificados como componentes de interesse nesta família alcaloides, principalmente isoquinolínicos, e as acetogeninas, as quais são promissoras como agentes antitumorais e antiparasitários. Até o presente momento, cerca de 400 acetogeninas já foram isoladas de Annonaceae (AMINIMOGHADAMFAROUJ, 2011).
O gênero Annona possui mais de 120 espécies catalogadas. No Brasil já foram identificadas 30 dessas espécies na região amazônica, área de maior concentração de espécies desse gênero no continente americano. O gênero Annona tem sido estudado por possuir espécies com grande interesse econômico e alimentício, como Annona muricata L., Annona squamosa L. e Annona reticulata L., além de ser fonte de acetogeninas e alcaloides isoquinolínicos (MOSCA, CAVALCANTES e DANTAS, 2006).
Figura 3 - (A) Arbusto; (B) flor; (C) botão de flor e (D) fruto de Annona muricata
Annona muricata L., conhecida como soursop (inglês), guanabana (espanhol)
e, no Brasil, como gravioleira, é uma árvore terrestre, perenifólia, de caráter ereto, medindo de 5 a 8 metros de altura quando adulta, com uma copa aberta e arredondada. Possui folhas grandes, de um verde escuro brilhante. Sua fruta, graviola, é comestível e de grande tamanho, com formato de coração, chegando a ter entre 15 e 20 cm de diâmetro (Figura 3) (SOUZA et al. 2009).
Além do uso da polpa do seu fruto para a preparação de sucos, sorvetes, doces e cremes, todas as demais partes da planta, como folhas, sementes, cascas, raízes e flores de A. muricata têm sido amplamente utilizados para fins medicinais por comunidades nas Américas, África e Índia. É utilizada para o tratamento de artrite, neuralgia, reumatismo, diarreia, disenteria, febre, malária, escoriações, vermes, cistite, diabetes, dores de cabeça, insônia, abscessos, úlceras provocadas
A A B B D D C C
por leishmaniose, afecções associadas ao câncer e, ainda, como inseticida, larvicida e piscicida (ADEWOLE e CAXTON-MARTINS, 2006; ADEWOLE e OJEWOLE, 2009; BENEVAL et al. 2016; CAETANO, SOUZA e FEITOZA, 2014; MISHRA, AHMAD e SHARMA, 2013).
Os efeitos de A. muricata foram avaliados em diferentes ensaios biológicos/farmacológicos, tendo sido observadas importantes atividades relacionadas aos seus principais constituintes bioativos (alcaloides, acetogeninas, megastigmanas, flavonoides, fenóis e ciclopeptídeos), como: antidepressiva, citotóxica para diversas linhagens de câncer, neurotóxica, moluscicida, antileishmania, inseticida, antimalárica, anti-inflamatória, hipoglicemiante, anticonvulsionante, entre outras (MOGHADAMTOUSI et al. 2015).
2.3 Acetogeninas
Dentre os constituintes bioativos encontrados em A. muricata, as acetogeninas, em especial, têm chamado atenção, e até o momento mais de 100 diferentes representantes desta classe já foram isolados desta espécie, a maioria possuindo atividade anticâncer e antiparasitária (MOGHADAMTOUSI et al. 2015). As acetogeninas são uma classe distinta de metabólitos secundários, com 35 ou 37 carbonos, caracterizados por possuírem uma longa cadeia alifática de 32 ou 34 carbonos, não ramificada, apresentando em uma das extremidades um anel de γ-lactona, além de diferentes funções oxigenadas, que podem ser hidroxilas, carbonilas cetônicas, anéis oxirânicos (epóxidos), anéis tetraidrofurânicos (THF) ou tetraidropirânicos (THP) e, mais raramente, ligações duplas ou tríplices. (ALALI, LIU e MCLAUGHLIN, 1999). A rota biosintética responsável pela formação destes compostos ainda não está totalmente elucidada, mas é provável que eles sejam originados pela condensação de acetilCoA pela rota do acilpolimalonato (SIMÕES et al. 2010; ZAFRA-POLO et al. 1998).
As acetogeninas apresentam uma grande diversidade estrutural e são classificadas de acordo com a presença de grupos funcionais, como epóxidos; número e posição de anéis THF ou THP, e tipo de subunidade de anel de γ-lactona;
a qual pode ser uma lactona-α-β-insaturada (mais comum), cetolactona, γ-hidroxilactona insaturada ou uma β-hidroxilactona. A Figura 4 mostra os principais tipos de anéis γ-lactona em acetogeninas. Quanto aos grupos funcionais, estes podem ser do tipo epóxi, e nesse caso, sem anéis THF, uma vez que os anéis epóxi são considerados precursores dos anéis THF; lineares (sem anel THF); mono-THF, bis-THF adjacentes e não adjacentes, tri-THF e não clássicas com anel THP. Na Figura 5 estão representadas as estruturas de algumas acetogeninas com anel γ-lactona do tipo A, e diferentes grupos funcionais ao longo da cadeia, algumas das quais isoladas de A. muricata, uma das principais fontes de acetogeninas na família Annonaceae. As acetogeninas mais comuns, representando 206 das aproxidamente 417 acetogeninas isoladas até o momento, são as mono-THF com unidade γ-lactona-α-β-insaturada (BERMEJO et al. 2005).
Tipo A:
γ-lactona-α-β-insaturada
Tipo B: cetolactona
Tipo C: γ-hidroxilactona
insaturada Tipo D: β-hidroxilactona
R = H ou OH
1 2 3 4 35(33) 36(34) 37(35) 1 2 3 4 35(33) 36(34) 37(35) 1 2 3 4 35(33) 36(34) 37(35) 1 2 3 4 35(33) 36(34) 37(35)Figura 4 – Diferentes tipos de unidades γ- lactona que ocorrem em acetogeninas
Tipo 1: Linear Ex: Coibina A* Tipo 2: Epóxi Ex: Coronina* Tipo 3: mono-THF Ex: cis-Solamina* Tipo 4: bis-THF adjacente Ex: Robustocina*
Tipo 5: bis-THF não adjacente
Ex: Gigantecina
Figura 5 – Estruturas químicas de acetogeninas com unidade γ-lactona do tipo A * Acetogeninas já isoladas de A. muricata
Quanto à identificação de acetogeninas em plantas da família Annonaceae, diferentes técnicas, em especial espectrométricas, devem ser empregadas em conjunto. Costuma-se inicialmente confirmar a presença de acetogeninas através da detecção da subunidade γ-lactona por análises de cromatografia de camada delgada (CCD), ultravioleta (UV) e infravermelho (IV). Para se definir então o tipo de acetogenina encontrado, são necessários estudos de espectrometria de massas (EM) e ressonância magnética nuclear (RMN), através dos quais deve-se buscar identificar o tipo de subunidade γ-lactona presente na acetogenina investigada, bem como as funções oxigenadas presentes, posicionando-as ao longo da cadeia.
No que diz respeito à utilização de técnicas de RMN, dados já definidos pela literatura para os deslocamentos químicos esperados para cada tipo específico de subunidade γ-lactona e para a detecção da presença de grupos funcionais são necessários na identificação das acetogeninas, inclusive quando em misturas (ALLEGRAND et al. 2010). Como exemplo, as Tabelas 1 e 2 apresentam deslocamentos químicos registrados em RMN de 1H e 13C para os diferentes tipos
de subunidades γ-lactona apresentados na Figura 4. A diferença entre os valores de deslocamento químico para cada tipo de unidade γ-lactona é suficiente para que se possa distinguir entre uma e outra. O tipo D por exemplo não possui H-3 e H-4, contrastando facilmente com os outros; os tipos B e C não possuem H-36(34),
Tipo 6: tri-THF
Ex: Goniocina**
Tipo 7: THP
Ex: Mucocina
Figura 5 (cont.) – Estruturas químicas de acetogeninas com unidade γ-lactona do tipo A ** Único exemplo da classe até o momento
contrastando com A e D, e a diferença do deslocamento químico de H-35(33) entre os tipos B e C permite distingui-los.
Tabela 1 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 1H
Tipos de γ-lactona H-2 H-3 H-4 H-35(33) H-36(34) H-37(35) Tipo A¹ - 2,26 1,52 6,95 4,99 1,42 Tipo B¹ 3,02 1,99 e 2,23 4,54 3,01 e 2,66 - 2,20 Tipo C¹ - 2,40 3,82 6,75 - 1,70 Tipo D¹ 2,55 - - 4,15 4,50 1,38
Tabela 2 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 13C
Tipos de γ-lactona C-1 C-2 C-3 C-4 C-35(33) C-36(34) C-37(35) Tipo A¹ 173,8 134,2 25,6 27,3 148,9 77,4 19,2 Tipo B¹ 178,8 33,4 35 78,9 43,8 205,5 29,9 Tipo C¹ 172,9 133,9 33,3 69,5 150,5 104,1 24,2 Tipo D¹ 177,4 43,78 25,6 27,3 73,7 82,5 18,1
As Tabelas 3 e 4 apresentam valores de deslocamentos químicos das acetogeninas cujas estruturas constam na Figura 5 e representam os diferentes tipos que possuem unidade γ-lactona do tipo A. Em cada exemplo os valores de deslocamento químico (δ) dos hidrogênios de CH2 são muito próximos, e facilmente
identificáveis, em torno de 1,20-1,60. Os δ’s em torno de 3,0 são associados a hidrogênios de anéis oxirânicos, em torno de 3,4 identificam hidrogênios de carbonos ligados a hidroxilas, e os em torno de 3,8 identificam os hidrogênios de anéis THF adjacentes ao oxigênio. Deslocamentos em campo mais alto, em torno de 5,0, estão associados a hidrogênios ligados a carbonos olefínicos. Essa diferença nos valores de deslocamento, associada a dados de massa, permite identificar os grupos funcionais presentes na molécula e determinar sua posição ao longo da cadeia.
Legenda: ¹ BERMEJO, et al. 2005
Tabela 3 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes acetogeninas em espectros de RMN de 1H Hidrogênios Coibina A Tipo 1a Coronina Tipo 2b cis-Solamina Tipo 3c Robustocina Tipo 4d Gigantecina Tipo 5e Goniocina Tipo 6f Mucocina Tipo 7g H-3 2,26 m 2,26 t 2,25 t 2,26 t a 2,38 m b 2,51 m a 2,40 m b 2,53 m a 2,40 m b 2,53 m H-4 1,55 m 1,52 m 1,55 m 1,55 m 3,87 m 3,85 m 3,84 m H-5 1,26 m 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,42 m 1,47 m 1,47 m H-6 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-7 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-8 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,30 m 1,31 m 1,20-1,60 1,10-1,35 H-9 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,49 m 1,45 m 1,44 m 1,10-1,35 H-10 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 3,95 m 3,87 m 3,93 m 1,10-1,35 H-11 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 a 1,57 m b 2,03 m a 1,55 m b 2,07 m a 1,62 m b 2,02 m 1,46 m H-12 1,20-1,40 1,52 m 1,24-1,40 a 1,60 m b 1,97 m a 1,63 m b 1,92 m a 1,64 m b 1,70 m 3,88 m H-13 1,20-1,40 2,95 m 1,24-1,40 3,99 m 3,87 m 3,83-3,92 a 1,49 m b 2,02 m H-14 1,41 m 2,99 m 1,46 m 3,89 m 3,40 m 3,83-3,92 a 1,62 m b 1,92 m H-15 3,42 m 1,71 m 3,41 m a 1,76-1,84 b 1,94-1,96 1,56 m a 1,64 m b 1,96 m 3,8 m H-16 3,42 m 1,71 m 3,81 m a 1,76-1,84 b 1,94-1,96 1,56 m a 1,64 m b 1,90 m 3,43 m H-17 1,55 m 2,99 m 1,74 m 3,89 m 3,40 m 3,83-3,92 1,52 m H-18 2,20 m 2,95 m 1,92 m 3,35 m 3,87 m 3,83-3,92 1,62 m H-19 5,40 m 1,60 m 3,81 m 1,44 m a 1,65 m b 2,07 m a 1,64 m b 1,96 m 3,48 m H-20 5,38 m 2,22 m 3,41 m 1,24-1,28 a 1,73 m b 1,92 m a 1,60 m b 1,90 m 3,15 m H-21 2,05 m 5,39-5,41 1,46 m 1,24-1,28 3,87 m 3,80 m a 1,45 m b 1,70 m H-22 1,20-1,40 5,39-5,41 1,24-1,40 1,24-1,28 3,40 m 3,37 m a 1,43 m b 2,10 m H-23 1,20-1,40 2,05 m 1,24-1,40 1,24-1,28 1,50 m 1,38 m 3,28 m H-24 1,20-1,40 1,31 m 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 3,05 m H-25 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,41 m H-26 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-27 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-28 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-29 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-30 1,20-1,40 1,23-1,39 1,26 m 1,26 m 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-31 1,30 m 1,23-1,39 1,26 m 1,26 m 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35 H-32 0,87 t 1,26 m 0,88 t 0,86 t 1,26 m 1,20-1,60 1,10-1,35 H-33 6,99 d 1,26 m 6,98 t 6,97 d 1,26 m 1,28 m 1,10-1,35
H-34 5,00 dq 0,88 t 4,99 dq 4,98 dq 0,82 t 0,87 t 0,88 t
H-35 1,42 t 6,98 d 1,41 d 1,41 d 7,17 d 7,20 q 7,19 d
H-36 - 4,99 dq - - 5,06 dq 5,06 dq 5,06 dq
H-37 - 1,41 d - - 1,41 d 1,35 d 1,43 d
Tabela 4 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes acetogeninas em espectros de RMN de 13C Carbonos Coibina A Tipo 1a Coronina Tipo 2b cis-Solamina Tipo 3c Robustocina Tipo 4d Gigantecina Tipo 5e Goniocina Tipo 6f Mucocina Tipo 7g C-1 173,9 173,8 173,8 173,9 174,6 174,3 174,6 C-2 134,3 134,2 134,3 134,2 131,1 131,1 131,2 C-3 25,3 25,2 25,1 25,1 33,3 33,2 33,3 C-4 27,3 27,4 27,4 27,3 69,9 69,8 69,9 C-5 29,6 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 37,0 37,2 37,3 C-6 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,8-29,6 25,4-29,7 26-33 C-7 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,8-29,6 25,4-29,7 26-33 C-8 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 26,1 25,8-29,6 25,4-29,7 26-33 C-9 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 35,8 35,8 35,6 26-33 C-10 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 80,1 79,3 79,6 26-33 C-11 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 a 28,4 b 32,2 a 28,2 b 32,3 32,1 35,6 C-12 25,4-29,5 27,8 25,7-29,7 a 28,4 b 28,4 a 28,2 b 28,2 28,3-28,5 79,3 C-13 25,4-29,5 56,4 25,7-29,7 80,7 82,0 81,1-82,3 32,4 C-14 33,5 56,5 34,0 81,5 74,1 81,1-82,3 28,3 C-15 74,6 25,0 74,3 28,4 37,0 28,3-28,5 81,9 C-16 74,3 25,0 82,8 28,4 37,0 28,3-28,5 73,8 C-17 33,5 56,9 28,1 82,5 74,3 81,1-82,3 28,7 C-18 23,4 57,3 28,1 74,7 82,7 81,1-82,3 28,8 C-19 129,0 27,8 82,8 34,5 a 28,2 b 32,3 28,5 73,5 C-20 131,1 25,2 74,3 25,8-29,6 a 28,2 b 28,2 28,8 80,1 C-21 27,2 128,1 34,0 25,8-29,6 82,7 83,0 26,9 C-22 25,4-29,5 131,1 25,7-29,7 25,8-29,6 74,4 74,2 31,9 C-23 25,4-29,5 27,2 25,7-29,7 25,8-29,6 37,0 33,3 70,5 C-24 25,4-29,5 29,6 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 25,6 82,0 C-25 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 25,5
Legenda: a GLEYE, C. et al. 1997; b GLEYE, C. et al, 2001; c GLEYE, C. et al. 1998; d
GLEYE, C. et al. 2000; e ALKOFAHI, A. et al. 1990; f GU, Z. et al. 1994; g SHI, G. et al.
C-26 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33 C-27 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33 C-28 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33 C-29 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33 C-30 25,4-29,5 24,3-29,7 31,9 31,9 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33 C-31 22,6 24,3-29,7 22,7 22,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33 C-32 14,1 31,9 14,1 14,1 31,7 31,9 26-33 C-33 149,0 22,7 148,8 148,9 22,3 22,7 26-33 C-34 77,5 14,2 77,5 77,4 14,4 14,1 14,1 C-35 19,0 148,7 19,2 19,2 151,2 151,9 151,8 C-36 - 77,4 - - 77,9 78,0 78,0 C-37 - 19,2 - - 19,1 19,1 19,1
Quantos às análises de EM, algumas das técnicas utilizadas são a espectrometria de massas com bombardeamento por átomos rápidos (EMBAR), espectrometria de massas com ionização por “eletronspray” (EM-IES), e espectrometria de massas com ionização por impacto eletrônico (EM-IE) (MCLAUGHLIN, 2008; YANG et al. 2009). É possível encontrar na literatura estudos do padrão de fragmentação das acetogeninas em EM que facilitam a sua identificação. A maioria dos dados se refere a fragmentações por EM-IE, uma vez que a maior parte das pesquisas envolvendo acetogeninas foram realizadas na década de 90, e essa era a técnica mais acessível à época (LAPREVOTE e DAS, 1994; SMITH, LIU e WOOD, 1991). Análises por EM-IQ (espectrometria de massas com ionização química) e EMBAR também eram empregadas, geralmente para a definição da fórmula molecular. A Figura 6 apresenta um esquema de fragmentação típico de coibina quando analisada por EM-IE.
Legenda: a GLEYE, C. et al. 1997; b GLEYE, C. et al, 2001; c GLEYE, C. et al. 1998; d
GLEYE, C. et al. 2000; e ALKOFAHI, A. et al. 1990; f GU, Z. et al. 1994; g SHI, G. et al.
37
.
.
Atualmente, no entanto, a fonte de ionização mais comum nos espectrômetros de massas é “eletronspray”, tendo os aparelhos com ionização por impacto eletrônico quase desaparecido (SAWAYA et al. 2004; WU, RODGERS e MARSHALL, 2005). No estudo das acetogeninas e outros lipídios complexos, o método de ionização por eletronspray (IES), por ser mais brando que o método por IE, pode levar à formação de íons primários [M + H]+ com sinais fracos, além da
formação de adutos como [M + Na]+, que podem dificultar a definição da estrutura
(ALLEGRAND et al. 2010). Por isso, é comum adicionar-se iodeto de lítio às amostras estudadas, que leva à formação proeminente de íons [M + Li]+ e seus
fragmentos, possibilitando assim a obtenção de mais informações precisas e relevantes (BENNION et al. 2007). Apesar disso, Gu e colaboradores (1997) desenvolveram um método para identificação de acetogeninas por EM-IES, inclusive em matrizes complexas, que dispensa a utilização de iodeto de lítio, tendo como base a formação de adutos de sódio para auxiliar a identificação. A partir do estudo de acetogeninas isoladas, este grupo de pesquisadores definiu quais seriam as fragmentações características esperadas de uma determinada acetogenina de acordo com sua massa e número de hidroxilas. Este método possibilitou a identificação de sete acetogeninas de massas diferentes em um extrato metanólico de Rollinia mucosa.
Figura 6 - Exemplo de fragmentações características de acetogeninas em espectometria de massas com ionização por impacto eletrônico (Coibina A)
Figura 7 - Estruturas químicas de anonacina (A) e uvaricina (B)
Desde a descoberta da uvaricina (Figura 7B) em 1982, como a primeira das acetogeninas, esta classe de metabólitos tem sido amplamente investigada pelo seu elevado potencial de atividade biológica. De fato, a uvaricina, quando descoberta, foi anunciada como novo agente anti-câncer (TEMPESTA, KRIEK e BATES, 1982), e as acetogeninas de maneira geral foram reconhecidas como os mais potentes inibidores do complexo I (NADH: ubiquinona oxidorredutase) da cadeia respiratória mitocondrial (BERMEJO et al. 2005; ESPOSTI et al. 1994). Hoje são conhecidas, além da atividade antitumoral das acetogeninas, outras atividades importantes como antimalárica, antiparasitária e pesticida (MCLAUGHLIN, 2008).
As acetogeninas, apesar de serem potentes agentes citotóxicos contra células cancerígenas, após serem estudadas por mais de trinta anos ainda não geraram nenhum fármaco anti-câncer. Seu mecanismo de ação ainda não foi completamente elucidado. Restam dúvidas quanto ao sítio de ligação exato e relações estrutura-atividade. Sabe-se que a natureza lipofílica das acetogeninas é fator importante na ligação ao sítio na mitocôndria (TORMO et al. 1999), mas estudos realizados utilizando diferentes acetogeninas, que se distinguiam apenas pelas posições de hidroxilas, ou pela presença de anéis THF, revelaram pouca ou nenhuma variação na atividade apresentada entre elas. Foi demonstrado, no entanto, que as acetogeninas mais ativas são aquelas do tipo bis-THF adjacentes com γ-lactona-α-β-insaturada, além de que um maior número de hidroxilas parece aumentar a atividade (TAKADA et al. 2000).
Em resumo, as acetogeninas, ainda que descobertas há mais de trinta anos, e pesquisadas desde então, continuam sendo importantes alvos de estudos como classe de metabólitos secundários promissora para o tratamento de câncer e outras doenças como malária e leishmaniose.
3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral
Realizar análise fitoquímica e avaliar a atividade leishmanicida de sementes de Annona muricata L.
3.2 Objetivos específicos
Caracterizar, em termos farmacognósticos, o pó das sementes de Annona
muricata L.;
Obter e caracterizar extrato etanólico e frações;
Quantificar as acetogeninas no extrato e frações por RMNq. Avaliar atividade in vitro do extrato etanólico e frações obtidos:
o Antipromastigota frente a cepa de Leishmania amazonensis; o Anti-amastigota frente a cepa de Leishmania amazonensis; o Citotóxica em macrófagos murinos imortalizados.
4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Materiais
4.1.1 EQUIPAMENTOS
Balança analítica - Bioprecisa, modelo FA2104 N Eletronic Balance; Cabine de fluxo laminar vertical – Pachane, modelo PA 310;
Coluna de fase reversa LiChrospher® RP 18 (5 µM) 12,5 cm LiChrocart 125-4 (Merck Millipore®);
Cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE-DAD), modalidade analítica, Waters®, equipado com injetor automático, mod. 2695; detector de arranjos de diodos (DAD), mod. 2996; bomba mod. L-6200A; integrador, mod. C-R4A; Cromatógrafo líquido de ultra eficiência acoplado a espectrômetro de massas
(CLUE-PDA-MS/ESI) marca WATERS ACQUITY® H-Class Core System. Espectômetro de RMN Bruker Advance DPX 200;
Incubadora de CO2- Ultrasafe, modelo HF212 UV; Leitora de Microplacas - Biotek, modelo ELX 808; Medidor de pH, Marconi, modelo PA200;
4.1.2 SOLVENTES
Acetato de etila, ácido fórmico, ácido fosfórico, clorofórmio, diclorometano, n-hexano, hidróxido de amônio, metanol (Isofar®);
Acetonitrila grau CLAE, metanol grau CLAE (Tedia Company®); Água deionizada (sistema Milli-Qplus);
Clorofórmio deuterado (Merck®); DMSO-D6 (Sigma Aldrich®); Etanol (Souza Cruz®).
4.1.3 FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica gel 60 G (90% < 55 µm) para cromatoplacas (Merck®)
4.1.4 MEIO DE CULTURA E OUTROS
Fosfato de sódio dibásico anidro P.A- Labsynth produtos para laboratório; Gentamicin (Sulfato de gentamicina) 80 mg/2mL solução injetável - Nova
Farma Indústria Farmacêutica LTDA;
Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) com glutamina e 25 MM; Bicarbonato de sódio- Sigma Aldrich;
MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium 500 mg, Sigma-Aldrich;
Penicilina G - Sigma Aldrich; Soro bovino Fetal – Gibco®.
4.1.5 REVELADORES PARA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
4.1.5.1 Anisaldeído - Ácido Sulfúrico (AS)
Misturou-se anisaldeído (0,5 mL) com ácido acético glacial (10 mL), em seguida adicionou-se metanol (85 mL) e ácido sulfúrico concentrado (5 mL). A seguir, o reagente foi armazenado em frasco âmbar sob refrigeração (2-8°C; WAGNER; BLADT; ZGAINSKI, 1984).
4.1.5.2 Reagente Kedde
Solução A: Ácido 3,5-dinitrobenzóico a 3% em metanol. Solução B: KOH a 5,7% em água. As soluções foram combinadas no momento da pulverização nas placas (MULIA et al. 2015).
4.1.6 PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO
O meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 (com L-Glutamina e sem bicarbonato de sódio) incompleto foi preparado utilizando-se cerca de 800 mL de água ultrapura (Milli-Q®) em béquer, à qual foram adicionados sob agitação constante: bicarbonato de sódio (2 g), D-glicose (2 g; dextrose), tampão HEPES
(5,98 g), RPMI 1640 em pó (10,4 g). O conteúdo foi então transferido para balão volumétrico de 1L e o volume completado com água ultrapura. Logo após, ajustou-se o pH do meio para 7,2. O meio foi esterilizado em membrana de 0,22 μm e acondicionado em frascos estéreis mantidos a 4 ºC.
Para o preparo de 40 mL do meio RPMI completo, foram adicionados ao meio RPMI incompleto, preparado de acordo com o descrito acima, 4 mL de soro fetal bovino desnaturado (a 56 °C) e 0,4 mL de uma solução de antibiótico (10.000 U/mL de penicilina + 10.000 µg/mL de estreptomicina, Gibco®), previamente preparada. O preparo deste meio segue o Protocolo Experimental do Instituto Evandro Chagas.
4.1.7 MATERIAL BIOLÓGICO
4.1.7.1 Parasito Leishmania
A espécie de parasito utilizada foi L. (L.) amazonensis. Para o ensaio antipromastigota utilizou-se cepa isolada de caso humano procedente de Ulianópolis, Estado do Pará, gentilmente cedido pelo Instituo Evandro Chagas, cujo código é MHOM/BR/2009/M26361. Para o ensaio anti-amastigota utilizou-se a cepa 199 cedida pelo ICBIM/UFU. Cepas diferentes foram utilizadas em cada teste por questões de disponibilidade.
4.1.8 MATERIAL VEGETAL
As sementes foram obtidas em três diferentes remessas, entre abril-maio de 2015, todas advindas de frutos produzidos em cultivo particular, no município de Tomé-Açu, Estado do Pará, sob as coordenadas 2°25'S 48°07'W. Uma exsicata foi produzida, mas ainda aguarda identificação.
As sementes de A. muricata foram lavadas em água corrente e imersas brevemente por 3 vezes em etanol a 70%, seguindo-se a isso a secagem a 40 °C em estufa com ventilação de ar forçado por sete dias. Após a secagem das sementes, estas foram reduzidas a pó em moinho de facas.
4.2 Métodos
4.2.1 ANÁLISES FARMACOGNÓSTICAS
4.2.1.1 pH
A determinação do pH foi efetuada de acordo com a Farmacopeia Brasileira V ed. (BRASIL, 2010). Uma amostra de 3g do pó foi adicionada à água destilada para o preparo de uma solução a 1%, que foi então aquecida em chapa elétrica por 5 minutos. O extrato em seguida foi filtrado por algodão e levado ao potenciômetro. O procedimento foi efetuado em triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.1.2 Perda por dessecação
A perda por dessecação consiste em um método gravimétrico para determinação de água e substâncias voláteis em drogas vegetais. Conforme descrito na Farmacopéia brasileira, uma amostra de 2g do material vegetal em pó foi transferida para pesa-filtro, em seguida levada à estufa a 110 ºC por 5 horas. Após esse período a amostra arrefeceu em dessecador e foi pesada novamente para calcular a diferença na massa (BRASIL, 2010). O procedimento foi efetuado em triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.1.3 Teor de cinzas totais
A determinação de cinzas totais abrange tanto as cinzas de origem fisiológica quanto não fisiológicas. Uma amostra de 3g do material vegetal em pó foi pesada e transferida para um cadinho previamente tarado, e então incinerada em mufla (Quimis®), obedecendo-se um gradiente de temperatura a fim de se evitar projeções
do material: 30 minutos a 200ºC, 60 minutos a 400ºC e 90 minutos a 600ºC (BRASIL, 2010). O procedimento foi realizado em triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.1.4 Densidade aparente
A densidade aparente considera o volume total da amostra incluindo o espaço vazio entre os grãos. Neste procedimento o material vegetal foi colocado em uma proveta até preencher o volume de 15 mL. A proveta então foi pesada em balança
analítica e os valores de densidade foram obtidos através do quociente entre o valor da massa e volume (SAMPAIO e SILVA, 2007). O procedimento foi realizado em triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.1.5 Granulometria
A granulometria foi determinada de acordo com a Farmacopeia Brasileira, com adaptações. Uma amostra de 10g do pó foi adicionada à sequência de peneiras 1,70 mm; 710 µm; 355 µm; 180 µm e 125 µm, as quais foram levadas ao agitador mecânico por 15 minutos. Ao final deste tempo a quantidade retida em cada peneira foi pesada e definido o tipo do pó (BRASIL, 2010). O procedimento foi realizado em triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE SEMENTES (EE)
O extrato etanólico foi preparado por maceração exaustiva, utilizando-se 400g do pó das sementes e etanol 96 °GL como solvente extrator. O extrato resultante foi recolhido e concentrado em evaporador rotativo até resíduo, obtendo-se assim o extrato etanólico (EE) das sementes, de caráter pastoso, que foi conservado (no congelador de uma geladeira) a -2 °C.
4.2.3 PARTIÇÕES LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO ETANÓLICO DE SEMENTES (EE)
O EE obtido foi dividido em três porções de aproximadamente 20g cada. Para cada uma delas seguiu-se um processo diferente de partição líquido-líquido a fim de que se pudesse avaliar qual seria o método mais apropriado para a obtenção de uma fração rica em acetogeninas.
