EXTRATO ETANÓLICO E FRAÇÕES DAS PARTIÇÕES

Para se chegar ao extrato etanólico e frações ricas em acetogeninas, foi realizada a percolação do pó das sementes com etanol 96 °GL, seguida de diferentes partições líquido-líquido. Os rendimentos dos processos extrativo e de separação utilizados neste trabalho foram calculados e se encontram na Tabela 9. Para a obtenção de um bom rendimento em processos extrativos é importante a utilização de solventes e métodos adequados ao material vegetal utilizado (BIMAKRA et al. 2011). Diferentes partes das plantas armazenam espécies e concentrações diferentes de constituintes químicos que podem ainda variar de acordo com fatores ambientais (solo, suprimento de água, temperatura, pragas, espécies concorrentes, etc) e de maneira sazonal, variando com as estações do ano ou até mesmo horas do dia (BLANK et al. 2007; STEFANELLO et al. 2010). No caso de Annonas, as acetogeninas costumam ser encontradas em maior concentração nas sementes e, no caso de Annona muricata, essa parte da planta oferece um maior rendimento em extrações com etanol quando comparada a outras partes como folha, casca, fruto, galhos e raiz (ANSANTE, 2014; BRITO, 2014; RANISAHARIVONY et al. 2015). Assim, utilizou-se o etanol, um ótimo solvente extrator, uma vez que é capaz de extrair constituintes em um amplo espectro de polaridade (ANASTAS e WARNER, 2000; FALKENBERG et al. 2010), e o material vegetal seco e em pó grosso (70% > 355 µm), o que melhora a extração por evitar a compactação excessiva do pó e aumentar a superfície de contato (LAROZE et al. 2010). O método extrator foi a maceração, devido ao seu baixo custo, praticidade e capacidade de extrair constituintes minoritários (RANISAHARIVONY et al. 2015).

O processo extrativo realizado a partir das sementes por percolação gerou um extrato etanólico (EE) com rendimento de 15%. Este rendimento foi semelhante ao encontrado por Brito (2014), que usou metodologia similar, portanto, sugere-se que o método aqui utilizado foi eficiente na extração dos constituintes solúveis em etanol presentes nas sementes de A. muricata. O EE foi submetido a partições por 3 métodos diferentes (págs. 40-43), e os rendimentos obtidos das frações que constam na Tabela 9 foram semelhantes aos relatados por outros autores como Brito (2014) e Ranisaharivony e colaboradores (2015). Os maiores rendimentos

obtidos foram aqueles das frações hexânica (FH1, 75%), clorofórmica (FCL3, 72%) e diclorometânica (FDM2, 62%), solventes de baixa e média polaridade. Isso se deve provavelmente ao fato de sementes apresentarem usualmente um teor elevado de óleos fixos (triacilgliceróis), que tendem a se concentrar nos solventes de caráter menos polar em uma partição líquido-líquido com solventes de diferentes polaridades (BRANCO et al. 2010). As frações de polaridade média, FCL1, FAE2 apresentaram um rendimento de 9 e 10%, respectivamente, semelhante ao das frações mais polares FMH1 e FMH2, indicando que os constituintes mais polares estão em teor mais baixo no extrato etanólico das sementes. No entanto, as frações FAE3 e FMH3 da terceira partição, tiveram um rendimento de apenas 2,9 e 3%, respectivamente. Isso ocorreu provavelmente por essas frações serem provenientes de EEH, que presumivelmente extraiu principalmente compostos de baixa e média polaridade do EE.

Tabela 9 - Rendimentos do processo extrativo das sementes de Annona muricata e partições do extrato etanólico

Extrato/frações Método extrativo ^{Quantidade inicial}

(g) ^{Rendimento g (%)}

EE

Maceração a partir do pó das sementes com etanol 96 °GL

(pág. 40) 400 60 g (15%) FH1 Partições do Extrato Etanólico (págs. 40-43) 20 15 g (75%) FCL1 1,8g (9%) FMH1 1,56g (7,8%) FDM2 20 12,4g (62%) FAE2 2g (10%) FMH2 1,6g (8%) FCL3 20 14,4g (72%) FAE3 0,58g (2,9%) FMH3 0,6g (3%)

Legenda: EE – extrato etanólico; FH1 – fração hexânica 1; FMH1 – fração metanol/água 1; FCL1 – fração clorofórmica 1; FDM2 – fração diclorometano 2; FMH2 – fração metanol/água 2; FAE2 – fração acetato de etila 2; FCL3 – fração clorofórmica 3; FMH3 – fração metanol/água 3; FAE3 – fração acetato de etila 3.

A detecção de acetogeninas por CCD no extrato e frações revelou a presença destes metabólitos em quase todas elas (Tabela 10, Figuras 14 e 15). EE e EEH

apresentaram perfis em CCD semelhantes quando as placas foram reveladas pelo reagente de Kedde, sugerindo que boa parte das acetogeninas presente no EE são solúveis em hexano, o que levanta a hipótese de um extrato hexânico ser a melhor opção para extração de acetogeninas das sementes de A. muricata, diminuindo uma etapa do processo aqui utilizado. A diferença dos perfis quando revelados por anisaldeído sulfúrico pode estar relacionada a outros constituintes que não acetogeninas, já que o AS é um revelador inespecífico.

Quanto às análises por CCD das frações das partições líquido-líquido, entre aquelas da primeira partição, todas apresentaram resultado positivo para Kedde, o que aponta para o fato de existirem acetogeninas de diferentes polaridades no EE. No entanto, FCL1 apresentou uma mancha mais intensa que as demais frações, o que pode sugerir uma maior concentração de acetogeninas nesta fração, de polaridade média. Nas análises com revelação por AS, os perfis de FCL1 e FMH1 foram semelhantes, com manchas de mesma intensidade, o que sugere que um mesmo grupo de constituintes está presente em ambas frações. Isto pode estar associado, como discutido anteriormente, a utilização de um tempo inadequado no processo de partição para a devida separação dos constituintes. FH1 teve resultado negativo na revelação por AS, possivelmente por uma pequena concentração de acetogeninas nesta fração.

Nas frações da segunda partição líquido-líquido, semelhantemente ao que aconteceu naquelas da primeira partição, FAE2, fração obtida com solvente de polaridade média, foi a que apresentou mancha mais intensa na análise com o revelador de Kedde, sugerindo uma maior concentração de acetogeninas na mesma. FDM2 e FMH2 também apresentaram resultado positivo para acetogeninas, e as manchas revelam tipos de polaridades diferentes em cada uma delas. Na análise por AS, todas frações foram positivas, apresentando mais uma vez tipos diferentes de acetogeninas, pelas suas manchas, o que aponta para uma melhor separação, se comparado a frações da primeira partição.

Nas frações da terceira partição líquido-líquido, mais uma vez todas foram positivas na análise com revelador de Kedde. FCL3, neste caso a fração de menor polaridade, foi a que apresentou mancha mais intensa. No entanto, como já discutido, FCL3 e FAE3 foram obtidas com solventes de polaridade muito

semelhante, por isso pode-se afirmar que mais uma vez as acetogeninas parecem ter se concentrado no solvente de polaridade média. FAE3 apresentou resultado negativo na análise por AS, possivelmente por uma baixa concentração de acetogeninas nesta fração.

Tabela 10- Resultados da detecção de acetogeninas por cromatografia em camada delgada

Amostra Revelador Resultado

EE ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) +

FH1 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) -

FMH1 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) +

FCL1 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) +

FDM2 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) +

FMH2 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) +

FAE2 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) +

FCL3 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) +

FMH3 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) -

FAE3 ^{Kedde +}

Anisaldeído sulfúrico (AS) -

Legenda: EE: Extrato Etanólico; FH1: Fração Hexânica 1; FMH1: Fração metanol/água 1; FCL1: fração clorofórmio 1; FDM2: fração diclorometano 2; FAE2: fração acetato de etila 2; FMH2: fração metanol/água 2; FCL3: fração clorofórmio 3; FAE3: fração acetato de etila 3; FMH3: fração metanol/água 3

Figura 14 – Cromatograma por CCD do extrato etanólico e porção solúvel em n-hexano

Legenda - EEH: porção do extrato etanólico solúvel em n-hexano; EE: extrato etanólico de sementes

Fase móvel - Acetato de etila:Metanol 9:1 Reveladores - A: Kedde; B: Anisaldeído Sulfúrico

Figura 15 – Cromatograma por CCD das frações provenientes das partições

Legenda - FH1: Fração Hexânica 1; FMH1: Fração metanol/água 1; FCL1: fração clorofórmio 1; FDM2: fração diclorometano 2; FAE2: fração acetato de etila 2; FMH2: fração metanol/água 2; FCL3: fração clorofórmio 3; FAE3: fração acetato de etila 3; FMH3: fração metanol/água 3

Fase móvel - Acetato de Etila/Metanol 9:1

Reveladores - (A) Kedde (B) Anisaldeído Sulfúrico

EE EEH EE EEH

A B

A reunião dos dados de cada partição líquido-líquido parece mostrar que as acetogeninas, apesar de sua longa cadeia lipofílica, estavam presentes em maior teor nas frações de polaridade intermediária, como acetato de etila (FAE2) e clorofórmio (FCL1 e FCL3), com exceção de FAE3. Isso se deve, provavelmente, ao grande número de funções oxigenadas (hidroxilas, anéis THF e anel lactônico) presentes nas acetogeninas, que contribuem para aumentar sua polaridade, fazendo com que tenham maior afinidade por solventes de polaridade média (FONTANA et al. 1998; TAKADA et al. 2000). A análise por CLAE-DAD, discutida adiante, fortalece esta hipótese, uma vez que se observou nas frações FAE2 e FCL3 uma maior abundância de picos indicativos de acetogeninas, comparativamente às demais frações.

Após a detecção de acetogeninas por CCD, análises por CLAE-DAD também foram realizadas com o objetivo de conhecer o perfil cromatográfico do extrato e frações, bem como detectar acetogeninas pelos seus espectros no UV registrados online. Na Figura 16, que mostra os cromatogramas do extrato etanólico e frações obtidos pela Programação A, se observa que, de maneira geral, parece haver alguns picos comuns aos vários cromatogramas, na faixa de 46 a 54 min. Os espectros no UV referentes aos constituintes destes picos, obtidos online, mostram que todos podem ser atribuídos a acetogeninas, apresentando absorção no UV em torno de 210 nm. Este resultado é promissor, mostrando que as acetogeninas foram extraídas eficientemente pelo etanol.

Na Figura 16A, que corresponde ao cromatograma por CLAE-DAD do EE, é possível verificar vários picos com diferentes tempos de retenção, sugerindo uma composição variada, com substâncias de diferentes polaridades. Tal resultado era esperado, uma vez que os extratos brutos costumam ser matrizes muito complexas, com diferentes constituintes (RAVAOMANARIVO et al. 2014; GOMATHI et al. 2015). Deve-se ressaltar que os picos de maior intensidade aparecem a partir de 46 min, o que, devido às características utilizadas na análise segundo as quais constituintes de baixa polaridade possuem TRs maiores, indica que a maior parte dos constituintes do EE com absorção em torno de 210 nm seja de

TR 21,6 min TR 53,1 min TR 16,2 min TR 3,2 min TR 52,9 min TR 2,4 min TR 14,6 min TR 53 min TR 43,3 min TR 53 min TR 54,1 min TR 52,9 min TR 16,2 min TR 47,7 min TR 47,8 min TR 49 min TR 12,7 min TR 14,7 min TR 12,7 min TR 11,3 min B C G I J H F D E

Figura 16 - Cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico e suas frações com tempo de retenção (TR) de picos de interesse Condição: Programa A - Coluna LiChrospher 100, C-18, 125 x 4 mm, 5 µm; fluxo = 1 mL/min, temperatura 40 °C

Fase móvel: t = 0 min: 95% água e 5% acetonitrila; t = 60 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 65 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 70 min: 95% água e 5% acetonitrila

Legenda: A - extrato etanólico; B - fração hexânica 1 (FH1); C - fração clorofórmica 1 (FCL1); D - fração metanol/água 1 (FMH1); E - fração diclorometano 2 (FDM2); F - fração acetato de etila 2 (FAE2); G - fração metanol/água 2 (FMH2); H - fração clorofórmica 3 (FCL3); I - fração acetato de etila 3 (FAE3); J - fração metanol/água 3 (FMH3).

média a baixa polaridade. O espectro de absorção no UV referente ao constituinte responsável pelo pico de maior intensidade com TR 46,81 min (Figura 17) possui uma absorção máxima próxima a 210 nm (~208 nm), característica de acetogeninas com anel γ-lactônico α-β-insaturado (MELOT et al. 2009; YANG et al. 2010). Além disso, o tempo de retenção é semelhante ao encontrado por outros autores que utilizaram perfis de análise por CLAE semelhantes ao utilizado no presente trabalho (GROMEK et al. 1994; GU et al. 1995). O pico vizinho ao mais intenso, com TR 47,7 min, apresenta máximo de absorção no UV online em 214 nm, podendo também ser atribuído a uma acetogenina. As absorções no UV de outros picos sugerem tratar-se também de acetogeninas com diferentes TRs.

Nos cromatogramas referentes às frações da primeira partição, FH1, FCL1 e FMH1 (Figura 18), observa-se que na fração FH1 predominam substâncias de baixa polaridade, como era de se esperar, mas também estão presentes substâncias de média polaridade. O pico 1 desta fração (TR 21,6 min), pico de maior área (12,56%), bem como o pico 22 (TR 53,1 min), ambos com max em torno de 210 nm, sugerem a presença de acetogeninas. Em FCL1 estão presentes substâncias de alta, média e

Figura 17 - Espectros de absorção no UV de picos do Extrato Etanólico registrados por CLAE-DAD

Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância

TR 53 min TR 63,8 min TR 55,3 min TR 49,2 min TR 48,7 min TR 53,5 min TR 46,8 min TR 47,7 min

baixa polaridade, e o pico majoritário (TR 52,9 min) provavelmente é devido a uma acetogenina, considerando sua absorção no UV (Figura 19). A fração FMH1 contém, principalmente, compostos polares, como se deduz pela predominância dos picos com TR de até 20 minutos. Seus picos majoritários, 1 (TR 2,4 min, 17,4% área) e 9 (TR 14,6 min, 21,3% área), provavelmente não correspondem a acetogeninas, como se deduz a partir de seus espectros no UV, mas os picos com TR 22,1 min e 25,6 min apresentam, ambos, absorção no UV com max de 209,6 nm, sugerindo a presença de acetogeninas mais polares.

FH1 FCL1 FMH1 21,6 min 53,1 min 52,9 min 2,4 min 14,6 min 22,1 min 25,6 min

Figura 18 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da primeira partição

Legenda: FH1 – fração hexânica 1; FCL1 – fração clorofórmica 1; FMH1 – fração metanol/água 1

É importante observar que as acetogeninas estão presentes em todos as frações desta partição, com tempos de retenção diversos, apontando para acetogeninas com diferentes polaridades, resultado este consonante com aqueles encontrados na análise por CCD. A justificativa para esta constatação é o fato de as acetogeninas apresentarem variada polaridade em função do variado número de funções oxigenadas presentes nessas moléculas. De fato, já foram isoladas acetogeninas com apenas dois grupos hidroxila, como montecristina, portanto de menor polaridade, assim como acetogeninas com três anéis THF e duas hidroxilas, como a goniocina, portanto mais polares (ALALI et al. 1999; BERMEJO et al. 2005).

Figura 19 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas por CLAE-DAD referentes às frações da primeira partição

Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância; A - fração hexânica 1 (FH1); B - fração clorofórmica 1 (FCL1); C - fração metanol/água 1 (FMH1).

A

B

Figura 20 - Estruturas químicas de duas acetogeninas Legenda: A - Montecristina; B - Goniocina

TR 53,1 min TR 16,2 min TR 3,2 min TR 52,9 min TR 25,6 min TR 22,1 min TR 2,4 min TR 14,6 min A A B B B C C C C TR 21,6 min

Nos cromatogramas referentes às frações da segunda partição (Figura 22), nota-se que na fração FDM2 predominam picos com TR > 20 min, como era de se esperar por se tratar de constituintes de baixa polaridade, solúveis em diclorometano (RAO e NAGARAJU, 2003). Os picos mais intensos são aqueles de números 8 (TR 43,3 min, 13,5% área) e 12 (TR 53 min, 28,6% área), sendo que este último apresenta espectro no UV característico de acetogeninas (Figura 21). Na fração FAE2 predominam substâncias de média e baixa polaridade, com dois picos intensos com TR 53,0 (36,0% área) e 54,1 (15,7% área) minutos, ambos com absorção no UV com λmax 209,6 nm, sugestiva de acetogeninas. Os demais picos registrados na faixa de 50 a 55 minutos possuem, todos, absorções em torno de λmax

210 nm (Figura 23), o que sugere uma fração rica em acetogeninas, motivo pelo qual esta foi escolhida para subsequente fracionamento. A fração FMH2 apresenta um perfil semelhante ao de FAE2, com a diferença de um maior número de picos foram detectados nos primeiros 5 minutos, sendo, portanto, substâncias de caráter mais polar, como esperado, uma vez que a fração metanol/água deveria acumular as substâncias de caráter polar. É interessante observar, no entanto, que o pico majoritário na fração FMH2 (TR 52,9 min, 26,4% área) parece corresponder ao pico majoritário encontrado em FAE2 (TR 53,0 min), que foi relacionado à presença de acetogeninas, e o mesmo ocorre com os demais picos próximos ao majoritário. Este fato sugere que a separação na segunda partição não foi eficiente, sendo talvez necessário um maior número de extrações da camada hidrometanólica com acetato de etila para se ter uma melhor extração da provável acetogenina com TR 53,0 min. (ACREE e ABRAHAM, 2006; MELWANKI e FUH, 2008). Mais uma vez, assim como nas frações da primeira partição, todas as frações desta segunda partição apresentaram picos que, pelos seus espectros no UV, devem corresponder a acetogeninas.

A ^{A B} B C C TR 53 min TR 54,1 min TR 53 min TR 16,2 min _{TR 52,9 min} TR 43,3 min

Figura 21 - Espectros de absorção no UV online dos picos majoritários nos cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição

Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância; A - fração diclorometano 2 (FDM2); B - fração acetato de etila 2 (FAE2); C - fração metanol/água 2 (FMH2).

53,0 min FDM2 FAE2 FMH2 43,3 min 53,0 min 54,1 min 52,9 min ^{54,1 min}

Figura 22 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição

Legenda: FDM2 – fração diclorometano 2; FAE2 – fração acetato de etila 2; FMH2 – fração metanol/água 2

Figura 23 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma por CLAE-DAD referentes à fração acetato de etila 2 (FAE2).

Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância

Nos cromatogramas referentes às frações da terceira partição (Figura 24), claramente se nota que a maioria das substâncias menos polares se concentrou na fração FCL3, enquanto que as mais polares se concentraram nas frações FAE3 e FMH3. Isso ocorre porque o clorofórmio, primeiro solvente utilizado nesta partição, possui caráter menos polar que o acetato de etila (4,1 e 4,4 P’ respectivamente), o que levou a uma maior concentração dos constituintes mais polares na fração acetato de etila, que apresentou perfil semelhante à fração FMH3. Os espectros no UV relacionados aos constituintes responsáveis pelos picos mais intensos na fração FCL3 (TR 47,8, 39,9% área e 49 min, 12,31% área) apresentam λmax em torno de 210 nm (Figura 25), sugerindo a presença de acetogeninas. Vários outros picos registrados para esta fração também apresentam espectros no UV característicos de acetogeninas (Figura 26), revelando que FCL3 é uma fração rica em acetogeninas. No cromatograma de FAE3, os picos majoritários, com TR de 12,7 (20,9% área) e 14,7 min (16,0% área), apresentam espectros no UV (Figura 25) característicos de alcalóides aporfínicos que são frequentes em Annonaceae e descritos para A.

muricata (LEBOEUF et al. 1981), sendo que na fração na fração FMH3 está

presente um mesmo alcaloide com TR 12,7 min (TSIMOGIANNIS et al. 2007). Mais uma vez aqui, as frações FAE3 e FMH3 apresentaram perfis muito semelhantes, levantando a questão da ineficiência da partição com esses dois solventes, já discutida anteriormente, sugerindo que a partição final com metanol/água seria dispensável. Mesmo assim, esta terceira partição foi a mais eficiente para a separação e concentração de acetogeninas dentre aquelas testadas.

TR 55,3 min

TR 58,4 min TR 59,8 min TR 61,3 min

Figura 25 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas em CLAE-DAD referentes às frações da terceira partição

Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância; A - fração clorofórmica 3 (FCL3); B - fração acetato de etila 3 (FAE3); C - fração metanol/água 3 (FMH3).

Figura 24 – Cromatogramas em CLAE-DAD das frações da terceira partição

Legenda: FCL3 – fração clorofórmica 3; FAE3 – fração acetato de etila 3; FMH3 – fração metanol/água 3

TR 49 min TR 14,7 min TR 12,7 min TR 11,3 min TR 12,7 min TR 47,8 min A A B B C C FCL3 FAE3 FMH3 49,0 min 47,8 min 12,7 min 14,7 min 12,7 min 14,7 min

Figura 26 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma em CLAE-DAD referentes à fração clorofórmica 3 (FCL3).

Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância

Em resumo, a análise fitoquímica até este ponto revelou que, como esperado, acetogeninas estão presentes no EE, e que dentre as frações obtidas por partição líquido-líquido, as mais promissoras foram FAE2 e FCL3, por apresentarem maior número de picos sugestivos de acetogeninas nas análises por CLAE-DAD, e principalmente na região de substâncias de média polaridade (TR 45-60 min.), onde é mais provável que as acetogeninas destas frações se encontrem. Por esse motivo as mesmas foram submetidas a fracionamento por cromatografia de coluna de sílica gel (CCS).