As subfrações FCL 3.7, FCL 3.9, FCL 3.12, FAE 2(5.4), FAE 2(5.5) e FAE 2(5.6) foram avaliadas quanto à sua atividade antipromastigota pelo método do MTT. Os valores de CI50 determinados para cada subfração encontram-se na Tabela 18. Todas as subfrações apresentaram CI50 < 100 µg/mL e, portanto, foram consideradas ativas de acordo com parâmetros estabelecidos na metodologia.
Atribui-se a atividade antipromastigota dessas subfrações à presença de acetogeninas, confirmada pelas análises espectométricas. Estes resultados são coerentes com dados da literatura, uma vez que acetogeninas isoladas e extratos de
A. muricata têm sido identificados como ativos contra formas promastigotas de
diferentes espécies de Leishmania. Osorio e colaboradores (2007) obtiveram um extrato de acetato de etila das folhas de A. muricata que apresentou CI50 de 25 µg/mL contra formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis. Vila-Nova e colaboradores (2013) isolou duas acetogeninas, anonacinona e corosolona, as quais apresentaram CI50 entre 6,72-8,00 e 16,14-18,73 µg/mL, respectivamente, contra L.
major, L. donovani e L. mexicana. O mesmo grupo, em outro momento, determinou
as CI50 de anonacinona e corosolona contra formas promastigotas de L. chagasi, obtendo valores que variaram de 13,5 a 28,7 µg/mL e 43,5 a 79,9 µg/mL, respectivamente (VILA-NOVA et al. 2011). Ainda, Le Grandic, e colaboradores
Anonacina
Solamina
Figura 47 - Estruturas químicas das acetogeninas corossolona e coibina C
(2004) avaliaram a atividade antipromastigota de doze acetogeninas contra L.
donovani, e encontraram valores de CI50 variando de 4,7 a 47,3 µM. Os valores de
CI50 encontrados para as frações avaliadas no presente estudo, portanto, assemelham-se àqueles encontrados pelos autores citados para acetogeninas isoladas. Este resultado é promissor, uma vez que as frações são de mais fácil obtenção do que as acetogeninas isoladas, o que reduziria o custo de um possível produto com atividade antileishmania obtido a partir de A. muricata.
Dentre as amostras estudadas, FCL 3.7 e FCL 3.9 foram as que apresentaram menor atividade. De acordo com os dados da análise por IES-MS e RMN, estas foram as únicas amostras nas quais a anonacina (Figura 46) não foi predominante, mas sim as acetogeninas corossolona e/ou coibina C/D (Figura 47). Esta diferença na constituição das amostras é provavelmente o motivo da diferença na atividade, uma vez que estudos de estrutura-atividade revelam que uma maior quantidade de hidroxilas e anéis THF, assim como uma hidroxila no carbono C-4, estão associados com maior atividade anticancerígena (OBERLIES et al. 1997; YANG et al. 2009) e, portanto, podem também estar associados com a atividade antipromastigota. A anonacina possui uma maior quantidade de hidroxilas que corossolona e coibina C/D, além de uma hidroxila em C-4, o que a tornaria mais ativa que as demais acetogeninas citadas.
Corossolona
No entanto, os ensaios de atividade antipromastigota são apenas presuntivos quanto a possível atividade antileishmania de uma amostra, já que a forma responsável pelo desenvolvimento das leishmanioses no homem é a amastigota. Além disso, outro parâmetro importante a ser avaliado é a citotoxicidade de uma amostra, para que se possa ser calculado o índice de seletividade (IS) da mesma, que expressa mais adequadamente sua atividade.
Tabela 18 - CI50 das subfrações analisadas para atividade antipromastigota em Leishmania
amazonensis Amostra CI50 + DP (µg/mL) Classificação FCL3(7) 24,63 ± 0,07 Ativo FCL3(9) 15,46 ± 0,52 Ativo FCL3(12) 10,87 ± 0,20 Ativo FAE2(5.4) 12,68 ± 0,75 Ativo FAE2(5.5) 6,48 ± 0,60 Ativo FAE2(5.6) 9,99 ± 0,77 Ativo Anfotericina B 4,9 ± 0,67 Ativo
Legenda: CI50 < 100µg/mL- ativo; 100 < CI50 < 200µg/mL- moderadamente ativo; CI50 > 200µg/mL- inativo (MOTA, 2010); DP: desvio padrão.
Nos ensaios de atividade anti-amastigota avaliou-se o efeito das subfrações FCL 3.11, FCL 3.12, FAE 2(5.4) e FAE 2(5.6) em macrófagos murinos (RAW 264.7) infectados com L. amazonensis (cepa 199). Os resultados foram expressos em porcentagem de infecção de macrófagos nas diferentes concentrações avaliadas (Tabela 19).
Dentre as frações avaliadas, FCL 3.12 apresentou resultados promissores, e seus dados de RMNq de 1H revelaram uma alta concentração de acetogeninas calculadas como anonacina (Tabela 17). Um dado importante, no entanto, é a morfologia alterada dos macrófagos observada em alguns dos experimentos (comparar Figuras 48 e 49), e especialmente em FCL 3.12. Goon-Tae, e colaboradores (2016) ao avaliar o efeito imunomodulatório de um extrato etanólico de A. muricata em macrófagos RAW 264.7, identificou alterações na membrana dos mesmos, associando-as a estimulação da diferenciação celular e da resposta imune
*Só foi possível determinar o percentual de infecção em um dos experimentos pois no outro haviam muitos macrófagos com morfologia alterada, portanto não há média ou desvio padrão.
**Testada apenas na concentração de 50 µg/mL.
provocadas pelo extrato. Esta regulação da resposta imune poderia ser a responsável por inibir a infecção dos macrófagos. Uma outra hipótese levantada é que, devido a sua natureza físico-química, as acetogeninas poderiam atuar como tensoativos, consequentemente desestabilizando a membrana lipídica dos macrófagos. Essa desestabilização impediria a interação de proteínas de membrana do parasito com as da célula, inviabilizando assim sua incorporação pelo macrófago e contribuindo para a redução do percentual de infecção (MORRÉ et al. 1994; OBERLIES et al. 1997; SHIMADA et al. 1998). A possibilidade mais plausível para o que provocou a alteração de membrana dos macrófagos, no entanto, é a citotoxicidade de FCL 3.12, pois foram utilizados para o teste anti-amastigota macrófagos de linhagem cancerígena, e atividade antineoplásica contra diferentes linhagens tem sido associada a acetogeninas (CORIA-TÉLLEZ et al. 2016; GEORGE et al. 2012; MOGHADAMTOUSI et al. 2015).
Tabela 19 - Atividade anti-amastigota em Leishmania amazonensis das subfrações analisadas (percentual de infecção).
Amostras Concentração (µg/mL) ± Desvio padrão
50 25 12,5 6,25 3,12 FCL 3.11 24,5 ± 3,5 25 ± 8,3 28 ± 9,1 39 ± 1,4 37,5 ± 2,1 P er ce n tu ais de inf e cç ão FCL 3.12 11* 9* 30* 44* 47* FAE2 (5.4) 33* 25* 30* 41,5 ± 4,4 38,5 ± 3,2 FAE2 (5.6) 30 ± 2,8 36* 26 ± 2,8 38 ± 4,1 28* Anfotericina B 0**
Figura 48 – Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota de FCL 3.12. A: macrófagos não infectados, não tratados; B: macrófagos infectados não tratados. Cabeças de seta: amastigotas de Leishmania
amazonensis A B 10 μm 10 μm A 10 μm 10 μm 10 μm B C
Figura 49 -Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota de FCL 3.12. A: macrófagos infectados, tratados com FCL 3.12; B: macrófagos não infectados tratados com FCL 3.12; C: macrófagos infectados tratados com anfotericina B. Cabeças de seta: amastigotas de L. amazonensis; setas: vacúolos.
O ensaio de citotoxicidade foi realizado com macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7, avaliando-se as mesmas amostras testadas no ensaio anti-amastigota. Os resultados obtidos (Tabela 20) mostram que todas as amostras foram citotóxicas, com índices de seletividade (IS) inferiores a 10. Como dito anteriormente, esta citotoxicidade provavelmente é devida ao fato de as células utilizadas no ensaio anti-amastigota serem de linhagem cancerígena. A inibição do sistema oxidativo NADH é um efeito característico de acetogeninas e que é especialmente observado em células neoplásicas por possuírem atividade metabólica exacerbada (GRANDIC et al. 2004). Essa tese é reforçada pela pesquisa realizada por Morré e colaboradores (1994), que ao comparar a citotoxicidade de uma acetogenina, bulatacina (Figura 49), contra células cancerígenas HELA e HL-60 com a citotoxicidade contra células normais do fígado de ratos, constatou que a inibição do sistema NADH e, portanto, a citotoxicidade, foi seletiva para células cancerígenas. Assim, é necessário realizar testes de citotoxicidade com células normais para que se possa melhor avaliar a atividade citotóxica das amostras estudadas. Além disso, estes resultados apontam as acetogeninas como potentes inibidores de células cancerígenas, corroborando dados da literatura (KOJIMA et al. 2013; SUN et al. 2016).
Tabela 20 - Valores da concentração citotóxica (CC50) das frações analisadas em linhagem de macrófago murino (RAW 264.7).
Fração CC50 (µg/mL) CI50 (µg/mL) IS (CC50/CI50) FAE2 (5.4) 12,50 12,68 0,98 FAE2 (5.6) 26,74 9,99 2,68 FCL 3.11 17,95 16,80 1,06 FCL 3.12 12,37 10,87 1,13 Anfotericina B 264,10 4,90 53,90 Bulatacina
6 CONCLUSÃO
Os métodos de partição mais eficientes para a obtenção de frações ricas em acetogeninas foram o segundo, realizado com diclorometano, acetato de etila e metanol/água, e o terceiro, realizado com clorofórmio, acetato de etila e metanol/água, os quais geraram as frações FAE2 e FCL3. A separação por CCS revelou-se eficiente em separar acetogeninas, as quais concentraram-se principalmente em solventes de média polaridade. As análises por espectrometria permitiram identificar como principais constituintes dessas frações, e das subfrações de FAE2 analisadas, acetogeninas de massa molar 596, dentre as quais a principal e provavelmente mais abundante é anonacina. Nas subfrações de FCL3, no entanto, as acetogeninas mais abundantes são as de massa 578, sendo a principal a corosolona. Estes dois metabólitos são possivelmente os responsáveis pela atividade antipromastigota encontrada, os quais também apresentaram potencial atividade antitumoral, uma vez que foram citotóxicos contra células RAW 264.7 e consequentemente apresentaram baixa seletividade. Esta citotoxicidade também pode estar associada à ausência de atividade anti-amastigota relevante, pois a lesão dos macrófagos utilizados no teste anti-amastigota pode ter impedido a interação efetiva dos constituintes das frações com as células amastigotas. Faz-se necessário, portanto, a realização de estudos de citotoxicidade utilizando-se células normais para que se possa definir a real citotoxicidade das amostras estudas contra macrófagos e, não havendo citotoxicidade relevante, novos estudos de atividade anti-amastigota. Assim será possível determinar o valor das amostras estudadas na busca de constituintes leishmanicidas.
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