Análises realizadas

Diante dos resultados da caracterização química inicial foi realizada a correção básica recomendada para a cultura da U. brizantha, assegurando que o desenvolvimento das plantas não fosse comprometido por possíveis deficiências nutricionais. Os dois solos receberam o equivalente a 60 kg ha-1 de N, 40 kg ha-1 de P2O5 e 20 kg ha-1 de K2O para tanto foram

utilizados como fertilizantes o sulfato de amônio, o superfosfato triplo e o cloreto de potássio. A adubação fosfatada, entretanto, não foi realizada nas unidades experimentais que receberiam o fungo micorrízico e ou os fungos solubilizadores, visando o aproveitamento do fósforo disponibilizado pela ação dos fungos inoculados. Desta forma, as unidades experimentais não inoculadas, mas que receberam adubação fosfatada, nitrogenada e potássica, foram consideradas controle fosfatado, enquanto as unidades experimentais em que

os solos receberam correção química de nitrogênio e potássio, mas não receberam a adubação fosfatada nem a inoculação dos microrganismos, foram consideradas controle não fosfatado.

O controle fosfatado foi utilizado para comparação entre os resultados da adubação fosfatada e da inoculação com G. clarum e/ ou A. niger 19 e A. niger 26 e o controle não fosfatado foi empregado para comparar os efeitos desses microrganismos com a ausência da adubação fosfatada.

3.3.1 Análises do solo

Realizaram-se análises químicas e microbiológicas do solo e para tanto o mesmo foi coletado em quatro pontos aleatórios dos vasos à 0,10 m de profundidade e peneirado (malha de 2 mm). A análise química do solo e a determinação da atividade da enzima fosfatase ácida do solo foram realizadas aos 0, 90, 180, 270 e 360 dias.

As determinações de fósforo total, fósforo orgânico e fósforo inorgânico foram efetuados aos 180 e 360 dias. As avaliações de fósforo disponível total e fósforo não lábil ocorreram somente aos 360 dias e as microbiológicas aos 0, 90, 180, 270 e 360 dias.

3.3.1.1 Análise química do solo

As amostras de solo foram homogeneizadas, secas ao ar e enviadas para a caracterização química como descrito anteriormente.

3.3.1.1.1 Atividade enzimática da fosfatase ácida

A determinação da atividade da enzima fosfatase ácida foi realizada com base no procedimento de Tabatabai e Bremner (1969). Foi pesado 0,2 g de solo úmido (fresco) em tubos de ensaio. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Adicionaram-se 4 mL de tampão acetato 0,095 mol L-1 _{pH 5,4 e colocaram-se os tubos em banho-maria, à 37°C, por 5}

minutos, para equilibrar a temperatura. Agitando levemente, adicionou-se 1 mL de solução de p-nitrofenil fosfato 0,08 mol L-1. O período de incubação foi por, no máximo, 30 minutos.

Após a incubação, acrescentou-se 1 mL de solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,66

mol L-1 e 4 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 mol L-1 e agitou-se vigorosamente a mistura nos tubos. Filtrou-se o conteúdo em papel de filtro “F. Maia”, faixa azul, nº 42, fazendo, em seguida, a leitura da absorbância do filtrado em espectrofotômetro no

comprimento de onda correspondente a 405 nm. Para cada amostra, fez-se um controle acrescentando-se a solução de p-nitrofenil fosfato 30 mM, após a adição da solução de cloreto de cálcio 0,66 mol L-1 e da solução de hidróxido de sódio 0,5 mol L-1. Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão com solução de p-nitrofenol.

3.3.1.1.2 Fósforo total

O fósforo total foi determinado segundo Vettori (1969) por meio de ataque sulfúrico, como descrito anteriormente.

3.3.1.1.3 Fósforo orgânico

A determinação do fósforo orgânico ocorreu pelo método proposto por Saunders e Willians (1955), como já descrito.

3.3.1.1.4 Fósforo inorgânico

O teor de fósforo inorgânico foi determinado subtraindo-se o fósforo orgânico do fósforo total.

3.3.1.1.5 Fósforo disponível total

O objetivo desse cálculo foi estimar o teor de fósforo disponibilizado em função dos tratamentos solo e inoculação ao final do experimento. Determinou-se o teor de fósforo disponível total por meio da seguinte fórmula:

Pdt= Pat + Pbm + P lábil Onde:

Pdt: teor de fósforo disponível total em mg dm-3_.

Pat: teor de fósforo acumulado total em mg dm-3.

Pbm: teor de fósforo da biomassa microbiana aos 360 dias em mg dm-3_.

3.3.1.1.6 Fósforo não lábil

O fósforo não lábil do solo foi determinado subtraindo-se o fósforo disponível total do fósforo inorgânico do solo.

3.3.1.2 Análises microbiológicas

3.3.1.2.1 Carbono do CO2 liberado

A quantificação do carbono do CO2 liberado exigiu 100 g do solo de cada unidade

experimental inicialmente peneirado. Amostras foram colocadas em jarros de vidro com tampa de rosca, onde a umidade do solo foi corrigida até 70% da capacidade de retenção, sendo no centro depositado um frasco contendo 10 mL de NaOH 0,1 mol L-1_{. Os jarros foram}

fechados hermeticamente até o final do período de incubação.

O tempo de incubação foi determinado por meio da curva de calibração, resultante de um monitoramento em dias alternados. A titulação do NaOH livre, à qual foi acrescido 1 mL de solução de BaCl2,foi realizada empregando HCl 0,1 mol L-1. O controle foi feito com

jarros de vidro, sem solo, contendo frascos com NaOH. A titulação da base livre permitiu calcular, por subtração, a quantidade de CO2 que combinou com NaOH (ANDERSON;

DOMSCH, 1989).

3.3.1.2.2 Carbono da biomassa microbiana

Para a determinação do carbono da biomassa microbiana, utilizou-se o método de fumigação - extração proposto por Vance, Brookes e Jenkinson (1987). Foram pesados 10 g de solo úmido em béquer, sempre duas amostras, uma para ser fumigada e outra para ser extraída de imediato não passando pelo processo de fumigação, considerada como controle. A capacidade de retenção de água do solo foi ajustada para 60%. Para fumigação, as amostras foram colocadas em um dessecador previamente forrado com papel de filtro úmido para manter a umidade, contendo um béquer com aproximadamente 30 mL de água destilada e outro com 50 mL de clorofórmio isento de álcool e as pérolas de vidro dispostas no seu interior.

O conjunto foi submetido a vácuo, por 5 minutos, até o clorofórmio borbulhar. A extração das amostras fumigadas e não fumigadas foi feita transferindo-se o solo para erlenmeyer de 125 mL e adicionando-se 50 mL de solução extratora de sulfato de potássio 0,5 mol L-1. Foram agitados por uma hora em agitador horizontal e a mistura foi filtrada em papel de filtro, sendo o filtrado armazenado em câmara fria (7°C) até o momento da determinação.

Para a determinação, foram pipetados 8 mL do filtrado em erlenmeyer de 125 mL, 2 mL de solução de dicromato de potássio 0,066 mol L-1_{, 5 mL de ácido fosfórico concentrado e}

10 mL de ácido sulfúrico concentrado. A mistura foi submetida à digestão por uma hora a 100ºC. Com água destilada, o volume foi ajustado para 75 mL. Depois que a solução atingiu a temperatura ambiente, foram adicionados 3 gotas de solução de difenilamina 1% e titulou-se com solução de sulfato ferroso amoniacal 0,033 mol L-1 em solução de ácido sulfúrico 0,4 mol L-1, até a mudança da cor azul para verde garrafa. Em cada avaliação foi feito um branco com 8 mL de sulfato de potássio 0,5 mol L-1 _{em substituição ao extrato de solo.}

3.3.1.2.3 Determinação do quociente metabólico (qCO2)

O quociente metabólico (qCO2), que representa a quantidade de C-CO2 liberada por

unidade de CBM, segundo Anderson (1994), foi estimada pela razão C-CO2 liberado / CBM,

ou seja: μg C-CO2 g solo fresco-1 h-1/μg biomassa - C g solo-1.

3.3.1.2.4 Determinação do quociente microbiano (qMIC)

O quociente microbiano (qMIC) foi calculado pela expressão (CBM/Corg do solo)/10, de acordo com Sparling (1992).

3.3.1.2.5 Fósforo da biomassa microbiana

A obtenção do extrato para a determinação do fósforo da biomassa microbiana seguiu método proposto por Brookes, Powlson e Jenkinson (1984). Foram pesados 2,5 g de solo úmido em béquer, utilizando-se sempre três sub-amostras de cada amostra para que a primeira fosse fumigada, a segunda recebesse adição de fosfato de potássio (KH2PO4) e a terceira

Para a fumigação, as amostras foram colocadas em um dessecador previamente forrado com papel de filtro úmido para manter a umidade, contendo um béquer com aproximadamente 30 mL de água destilada e outro com 50 mL de clorofórmio isento de álcool e as pérolas de vidro dispostas no seu interior. Este conjunto foi submetido ao vácuo por aproximadamente 5 minutos, até o clorofórmio borbulhar. Em seguida, o dessecador contendo as respectivas sub-amostras fumigadas assim como as adicionadas de KH2PO4 e o

controle foram mantidos, por 24 horas, em estufa BOD a 25°C.

A extração das três sub-amostras foi feita transferindo-se o solo para erlenmeyer de 125 mL, onde foram adicionados 50 mL de solução extratora de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,5 mol L-1 pH 8,5. Agitou-se por trinta minutos em agitador horizontal e filtrou-se

a mistura em papel de filtro, o extrato foi armazenado em câmara fria (7°C) até o momento da determinação.

Para a determinação do fósforo da biomassa microbiana foi utilizado o método proposto por Watanabe e Olsen (1965). Foram pipetados 2 mL do filtrado em tubo de ensaio, onde foram adicionados 0,2 mL de solução de ácido sulfúrico 2,48 mol L-1 _{e 0,8 mL de}

reagente B. Todos os tubos foram agitados e submetidos a incubação em banho-maria, a 45°C, por vinte minutos. Após a incubação, foi feita a leitura das amostras no espectrofotômetro em absorbância de 820 nm. O mesmo procedimento foi utilizado para as três sub-amostras. Em cada avaliação foi feito um branco com 2 mL de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,5 mol L-1 pH 8,5, em substituição ao extrato de solo.

3.3.1.2.6 Porcentagem de colonização micorrízica

Para a determinação da porcentagem da colonização micorrízica, as raízes coletadas durante o peneiramento das amostras de solo de cada unidade experimental (um grama) e preservadas em álcool 50%, foram lavadas em água corrente, cortadas no comprimento de 1 cm, clarificadas em KOH 10%, acidificadas com HCl 1% a 90°C, coloridas com azul de tripano 0,05% e preservadas em lactoglicerol (PHILLIPS; HAYMAN, 1970). A verificação da porcentagem de segmentos colonizados ocorreu em placa quadriculada onde foram realizadas, por repetição, observações de 100 segmentos interceptados pelas linhas da placa sob microscópio estereoscópico (40x)((GIOVANETTI; MOSSE, 1980).

3.3.1.2.7 Contagem de esporos

A contagem do número de esporos do fungo micorrízico arbuscular realizou-se em 100 g de solo peneirado por repetição, segundo uma associação de métodos de decantação e peneiramento úmido (GERDEMANN; NICOLSON, 1963) e de centrifugação e flutuação com sacarose (JENKINS, 1964), como anteriormente descrito.

3.3.2 Análises das plantas

Todas as análises de plantas foram realizadas aos 0, 90, 180, 270 e 360 dias, exceto a massa seca vegetal total, o fósforo acumulado total, a massa seca radicular e o fósforo radicular analisados aos 360 dias.

3.3.2.1 Atividade da enzima fosfatase ácida

A determinação da atividade da fosfatase ácida exigiu a coleta de segmentos do limbo foliar de algumas folhas intermediárias (BESFORD, 1980). Foram utilizados 100 g do material recém coletado, os quais foram incubados em 8 mL de paranitrofenilfosfato em tampão de acetato de sódio (pH 4,0). Após incubação por 20 minutos a 30 °C, no escuro, 5 mL da mistura foram alcalinizados com 2 mL de NaOH 2 mol L-1. A quantidade de paranitrofenol formado foi estimada por colorimetria, em espectofotômetro a 420 nm, sendo expresso em µg p-NPP g-1 _h-1_.

3.3.2.2 Massa seca da parte aérea

A parte aérea das plantas foi cortada a 10 cm do solo e seca à 65ºC em estufa, com circulação forçada de ar até a obtenção de massa constante, quando foi medida para a obtenção da massa seca da parte aérea.

3.3.2.3 Fósforo acumulado na parte aérea

A parte aérea seca foi triturada em moinho tipo Wiley e submetida à análise para determinação de fósforo no Laboratório de Nutrição de Plantas do Departamento de Fitossanidade, Engenharia Rural e Solos da Faculdade de Engenharia - UNESP/Campus de Ilha Solteira, seguindo metodologia proposta por Malavolta, Vitti e Oliveira (1997).

3.3.2.4 Massa seca radicular

O sistema radicular foi separado do solo com o auxílio de peneiras, lavado e seco à 65ºC em estufa com circulação forçada de ar, até a obtenção de massa constante, quando foi obtida a massa seca radicular.

3.3.2.5 Fósforo acumulado radicular

O sistema radicular seco foi triturado em moinho tipo Wiley e submetido à análise para determinação de fósforo foliar no Laboratório de Nutrição de Plantas do Departamento de Fitossanidade, Engenharia Rural e Solos da Faculdade de Engenharia - UNESP/Campus de Ilha Solteira, seguindo metodologia proposta por Malavolta, Vitti e Oliveira (1997).

3.3.2.6 Massa seca total

Somaram-se os valores de massa seca da parte aérea e do sistema radicular e determinou-se o valor da massa seca total.

3.3.2.7 Fósforo acumulado total

Após a determinação do teor de fósforo e em função da massa seca produzida definiram-se os teores de fósforo acumulado na parte aérea e no sistema radicular (mg unidade experimental-1) por meio da multiplicação da massa seca (g) pelo teor de fósforo assimilado (g kg-1_{). Em seguida realizou-se a somatória do teor de fósforo acumulado na parte}

aérea (mg unidade experimental-1) aos 0, 90, 180, 270 e 360 dias juntamente com o teor de fósforo do sistema radicular (mg unidade experimental-1) verificado ao final do experimento obtendo-se o fósforo acumulado total.

3.3.3 Análise de água

3.3.3.1 Dureza

A determinação dos teores de carbonato de cálcio e carbonato de magnésio seguiu metodologia proposta por Vanzela (2004). Para tanto, a água utilizada para a irrigação das plantas fornecida pelo Sistema de Abastecimento de Ilha Solteira foi coletada a cada 4 dias, com as 4 amostras depositadas em garrafas de polietileno de dois litros, previamente higienizadas e lavadas com água destilada. As garrafas, contendo as amostras de água, foram acondicionadas em geladeira sendo, posteriormente, levadas ao Laboratório de Hidráulica e Irrigação do Departamento de Fitossanidade, Engenharia Rural e Solos da Faculdade de Engenharia - UNESP/Campus de Ilha Solteira.

3.3.3.2 Teor de fosfato

A determinação do teor de fosfato foi realizada de acordo com método proposto por Apha et al. (1992). Para tanto, a água utilizada para a irrigação das plantas fornecida pelo Sistema de Abastecimento de Ilha Solteira foi coletada a cada 4 dias, com as 4 amostras de água depositadas em garrafas de polietileno de dois litros, previamente higienizadas e lavadas com água destilada. As garrafas contendo as amostras foram acondicionadas em geladeira sendo, posteriormente, levadas ao Laboratório de Água e Solo da UNESP/Campus de Jaboticabal.

3.3.4 Delineamento experimental e análise de dados

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 6 repetições, e esquemas fatoriais diferenciados. O esquema adotado para avaliar as variáveis da caracterização química do solo (fósforo-resina, potencial de hidrogênio, potássio, cálcio, magnésio, acidez potencial, soma de bases, capacidade de troca catiônica e saturação por bases), a atividade da enzima fosfatase ácida do solo e as variáveis microbiológicas foi fatorial 5x2x7, correspondendo aos tratamentos: épocas, solos e inoculação com 5, 2 e 7 níveis, respectivamente.

Os níveis de épocas foram: 0, 90, 180, 270 e 360 dias. Solo apresentou os níveis: LVdA e LVd1. O tratamento inoculação contou com os níveis: controle fosfatado (CF), controle não fosfatado (CNF), A. niger 19 (CNF+A19), A. niger 26 (CNF+A26), G. clarum (CNF+G), G. clarum + A. niger 19 (CNF+A19+G) e G. clarum + A. niger 26 (CNF+A26+G). O fósforo total, fósforo inorgânico e fósforo orgânico foram avaliados no esquema fatorial 2x2x7 empregando os mesmos níveis dos tratamentos solo e inoculação anteriormente citados, porém com apenas dois níveis para épocas 180 e 360 dias. O fósforo disponível total e o fósforo não lábil foram analisados no esquema fatorial 2x7 utilizando os mesmos níveis de solos e inoculação já descritos.

As variáveis da planta (atividade da enzima fosfatase ácida, massa seca da parte aérea, fósforo acumulado na parte aérea, massa seca radicular, fósforo acumulado radicular, massa seca total e fósforo acumulado total) foram analisadas no esquema fatorial 2x7 com os tratamentos solo e inoculação nos mesmos níveis anteriores. Entretanto, a massa seca radicular, o fósforo acumulado correspondente, a massa seca total e o fósforo acumulado total foram avaliados apenas ao final do experimento, ou seja, aos 360 dias, ao passo que as demais variáveis foram analisadas aos 0, 90, 180, 270 e 360 dias. A comparação entre épocas não foi efetuada para que a discussão do presente trabalho não perdesse o foco de seu objetivo, ou seja, não fosse considerada a influência das mudanças climáticas sobre a planta ao longo de um ano.

Os dados obtidos nas avaliações foram analisados estatisticamente pelo teste F e as médias comparadas pela análise de regressão polinomial para o tratamento épocas quando este apresentou cinco níveis e pelo teste T de Student quando considerou-se apenas dois níveis, assim como para o tratamento solo. O teste Scott Knott foi aplicado para o tratamento inoculação. A análise de correlação foi feita para todos os parâmetros. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2000).

Os dados da caracterização química dos solos referentes a cálcio, magnésio, acidez potencial, e capacidade de troca catiônica foram transformados para logarítimo na base 10 (BANZATO; KRONKA, 2006).