Neste capítulo apresentam-se resultados relativos ao teor de compostos fenólicos totais e ao poder antioxidante (DPPH• e FRAP) de 19 infusões de folhas de chá obtidas por infusão durante 5 min, 15 min e 30 min. Para as infusões de 5 minutos foram ainda analisados quatro chás vermelhos e seis tisanas.
Avaliou-se ainda o perfil dos compostos fenólicos de 19 infusões de folhas de chá obtidas por infusão durante 15 min e dos correspondentes extractos aquosos.
3.3.1 - Optimização de parâmetros experimentais
Antes de aplicar os métodos analíticos de avaliação do teor de compostos fenólicos (reacção de Folin-Ciaucolteau), e de determinação da actividade antioxidante (inibição do DPPH• e actividade de redução férrica, FRAP), à totalidade das amostras incluídas neste estudo efectuaram-se alguns estudos prévios de forma a optimizar os parâmetros reacionais de cada metodologia às características da matriz em estudo.
3.3.1.1 – Optimização de parâmetros da reacção de Folin-Ciocalteu - Variação do tempo de reacção no escuro e influência da centrifugação
A optimização da reacção de Folin-Ciocalteu foi anteriormente apresentada (Ver ponto 2.3.1.1.) e as condições de teste seleccionadas correspondem ao tempo de reacção de 30 minutos uma vez que se considerou que a reacção estava próxima do estado de equilíbrio e não obrigava a períodos de incubação muito longos.
3.3.1.2 – Optimização de parâmetros da reacção de DPPH• - Variação do tempo de reacção no escuro
A amostra utilizada nestes testes foi uma infusão de chá verde Gorreana, folha enrolada (VA1), com um tempo de infusão de 5 min e uma razão chá:água de 1:500.
A influência do tempo de incubação no escuro (tempo de reacção) nos resultados da reacção de inibição do DPPH• foi avaliada entre 5 min e 60 min. Assim, repetiram-se os procedimentos descritos para este método variando apenas o tempo de reacção no escuro. Por determinação da % de inibição obtiveram-se os seguintes resultados:
Figura 3. 7 – Variação da % de inibição em função do tempo de incubação, no escuro, da reacção de DPPH
Em face dos resultados obtidos seleccionou
subsequentes pois considerou-se que após este período, a reacção estava próxima equilíbrio e não obrigava a períodos de incubação muito longos.
3.3.1.3 – Optimização de parâmetros da reacção de redução férrica (FRAP) de reacção no escuro
A amostra utilizada nestes testes Gorreana, folha enrolada (VA1), com
A influência do tempo de incubação a 37ºC (tempo de reacção) nos resultados da reacção de FRAP avaliada entre 2 min e 30 min.
variando apenas o tempo de reacção. Por determinação resultados:
Figura 3. 8 – Variação da absorvância em função
Em face dos resultados obtidos seleccionou
subsequentes pois considerou-se que após esse período, a reacção estava próxima do estado de equilíbrio e não obrigava a períodos de incubação muito longos.
ão da % de inibição em função do tempo de incubação, no escuro, da reacção de DPPH
Em face dos resultados obtidos seleccionou-se o tempo de reacção de 15 min para os ensaios se que após este período, a reacção estava próxima
equilíbrio e não obrigava a períodos de incubação muito longos.
Optimização de parâmetros da reacção de redução férrica (FRAP)
-A amostra utilizada nestes testes, tal como no teste do radical DPPH•, foi uma infusão de chá verde Gorreana, folha enrolada (VA1), com um tempo de infusão de 5 min e uma razão chá:água de 1:500. A influência do tempo de incubação a 37ºC (tempo de reacção) nos resultados da reacção de FRAP
30 min. Assim, repetiram-se os procedimentos descritos para este método variando apenas o tempo de reacção. Por determinação da absorvância obtiveram
Variação da absorvância em função do tempo de incubação da reacção de redução férrica (FRAP).
Em face dos resultados obtidos seleccionou-se o tempo de reacção de 4 min para os ensaios se que após esse período, a reacção estava próxima do estado de e não obrigava a períodos de incubação muito longos.
ão da % de inibição em função do tempo de incubação, no escuro, da reacção de DPPH•.
se o tempo de reacção de 15 min para os ensaios se que após este período, a reacção estava próxima do estado de
- Variação do tempo
, foi uma infusão de chá verde um tempo de infusão de 5 min e uma razão chá:água de 1:500. A influência do tempo de incubação a 37ºC (tempo de reacção) nos resultados da reacção de FRAP foi
se os procedimentos descritos para este método obtiveram-se os seguintes
do tempo de incubação da reacção de redução férrica (FRAP).
se o tempo de reacção de 4 min para os ensaios se que após esse período, a reacção estava próxima do estado de
3.3.1.4 –Repetibilidade
Efectuaram-se 8 infusões independentes deste chá com uma razão chá:água de 1:500 sendo cada uma delas submetida às condições para a determinação da capacidade antioxidante pelos testes de Folin-Ciocalteu, inibição do radical DPPH• e poder de redução férrica (FRAP). Os resultados obtidos apresentam-se na Tabela 3.9, à excepção dos obtidos para o método Folin-Ciocalteu uma vez que já foram apresentados no ponto 2.3.1.3. O método Folin-Ciocalteu apresentou uma boa repetibilidade tendo-se obtido, na determinação do teor de compostos fenólicos totais para diferentes amostras, um desvio padrão relativo que não excedeu os 5%.
Tabela 3. 9 – Inibição do radical DPPH• expressa em % e do poder redutor férrico expresso em mg GAE/L
infusão, para diferentes amostras de chá Gorreana – Folha Enrolada (n=8).
Replicadas
(n=8) % inibição FRAP (mg GAE/L)
1 28,6 17,6 2 28,1 17,7 3 27,9 17,6 4 26,8 17,8 5 28,1 17,5 6 28,6 17,6 7 29,5 17,8 8 27,4 17,7 Média 28,1 17,7 Desvio Padrão 0,80 0,2 Desvio Relativo (%) 2,90 0,9
Qualquer dos métodos apresentou uma boa repetibilidade tendo-se obtido um desvio padrão relativo de 2,90% para o método do radical DPPH• e de 0,9% para a metodologia FRAP. Estes resultados permitem concluir que nas condições seleccionadas os efeitos de matriz e as condições reaccionais seleccionadas não introduzem factores de variabilidade que influenciem de forma importante a determinação da % de inibição do DPPH• e do poder redutor férrico para as infusões de 5 min.
Foi também determinada a repetibilidade do método de análise do HPLC. Assim, foram injectadas 5 amostras de infusões de 15 min de chá verde (Encosta da Bruma) e de chá preto (Broken Leaf). A repetibilidade do método foi obtida pela determinação da média das áreas absolutas dos picos identificados a 280 nm, por ser a este comprimento de onda que são detectados os compostos maioritários dos chás analisados, e o respectivo desvio padrão e desvio relativo. Os valores obtidos são listados na tabela 3.10.
Tabela 3. 10 – Média, desvio padrão e desvio relativo das áreas absolutas dos picos identificados a 280 nm nos chás dos Açores Encosta da Bruma (chá verde) e Broken Leaf (chá preto).
Chá verde – Encosta da Bruma Chá preto – Broken Leaf
Picos Média Desvio Padrão
Desvio
Relativo (%) Picos Média
Desvio Padrão Desvio Relativo (%) A1 4106005 549018,5 13,37 D2 6926922 1019056 14,71 A2 4016762 680198,3 16,93 D3 1131510 76338,79 6,75 A6 3806800 372350,9 9,78 D4 1031747 70107,45 6,80 A7 63143500 2614633 4,14 D5 1049749 150036,9 14,29 A8 6290400 960089,1 15,26 D6 43611046 1287837 2,95 A9 26668205 3044174 11,41 A10 1517022 96027,44 6,33 A12 10751334 1096894 10,20
Esta determinação visou avaliar a repetibilidade do sistema cromatográfico antes de proceder à análise das amostras e verificar se seria necessário efectuar alguma modificação nas condições de análise seleccionadas. Os desvios padrão relativos variaram entre 2,95% e 16,93% mas como estes ensaios foram realizados no início da utilização do sistema de HPLC os valores obtidos foram um pouco superiores aos posteriormente registados nos duplicados de amostra. Com o desenrolar dos ensaios a coluna cromatográfica foi estabilizando diminuindo o desvio padrão relativo nas medições efectuadas. Estabeleceu-se o desvio padrão percentual de 10% como um critério de aceitação ou seja, sempre que a variação percentual na área absoluta dos duplicados foi maior que 10 %, a análise foi repetida.
3.3.2 - Actividade antioxidante de infusões de chás e tisanas
A actividade antioxidante das amostras de chá verde e preto obtidas por infusão das folhas de chá durante 5, 15 e 30 minutos foi avaliada por determinação do seu conteúdo de fenólicos totais, pelo método da sequestração do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•) e pela determinação do poder
de redução férrica (FRAP). Todos os resultados foram expressos como equivalentes de ácido gálico
(mg/L de chá).
3.3.2.1 – Fenólicos totais
Em relação às infusões de 5 e 15 minutos de chás verdes e pretos já foram feitos os respectivos comentários no ponto 2.3.3.3.
No entanto, referindo os resultados individuais para cada infusão e pela análise dos resultados obtidos verificou-se que, nas infusões de 5 minutos, a maior quantidade de fenólicos totais extraída das folhas de chá, significativamente superior aos chás analisados, foi observada no chá verde comercial (VC1) com um teor de 817,81±1,74 mg/L de infusão, enquanto a menor quantidade foi no chá preto “Gorreana Broken Leaf” (PA3) com um teor 129,02±3,00 mg/L de infusão, o qual foi significativamente inferior aos chás analisados.
Relativamente às infusões de 15 minutos, a maior quantidade de fenólicos totais extraída das folhas de chá, significativamente superior aos outros chás, foi verificada no chá verde comercial com menta (VC5) com o teor de 942,48±3,76 mg/L de infusão, enquanto a menor quantidade foi no chá preto “Gorreana Broken Leaf” (PA3) com um teor de 152,47±2,89 mg/L de infusão. Os chás pretos dos Açores apresentaram teores de fenólicos totais significativamente inferiores aos outros.
No que diz respeito às infusões de 30 minutos, os teores de fenólicos mais elevados foram obtidos no chá verde com menta (VC4) e no chá verde Salutem (VC3) com valores de 991,74±8,82 e de 983,29±1,05 mg GAE/L de infusão, sendo estes valores significativamente superiores a todos os
outros chás analisados. A infusão que apresentou menor teor de fenólicos totais foi a de chá preto Gorreana Broken Leaf, com um valor de 187,20±1,92
inferior aos restantes chás.
Figura 3. 9 – Teor de fenólicos totais das amostras de infusões de 5, 15 e 30 minutos analisa
Para as infusões de 30 minutos, os chás verdes apresent significativamente superiores aos dos chás pretos
tempos de 5 e 15 min. Esta observação está de acordo com o
observaram um maior teor de compostos fenólicos em chás verdes do que nos correspondentes chás pretos devido à transformação e degradação das catequinas monoméricas durante o processo de fermentação do chá (Kim et al., 2
Analisando a influência do tempo de infusão nos teores de fenólicos totais para cada grupo de chás (Tabela 3.11), verifica-se que o aumento do tempo de infusão se traduziu num aumento proporcional dos teores de fenólicos totais dos chás verdes dos A
nos chás verdes comerciais; em particular, nos chás verdes dos Açores a infusão de 5 minutos tem um teor de compostos fenólicos significativamente inferior aos das infusões de 15 e 30 minutos. Este diferente comportamento parece ser uma consequência da diferente granulometria destas amostras uma vez que as amostras de chá verde dos Açores são como já foi referido constituídas por folhas não trituradas. No entanto quando o tempo de extracção aumentou de 5 min
diferenças entre os chás verdes dos Açores e os chás verdes comerciais atenuaram fenólicos totais foram idênticos para chás destes dois grupos.
Verde Açores
A infusão que apresentou menor teor de fenólicos totais foi a de chá preto orreana Broken Leaf, com um valor de 187,20±1,92 mg GAE/L de infusão
Teor de fenólicos totais das amostras de infusões de 5, 15 e 30 minutos analisa
Para as infusões de 30 minutos, os chás verdes apresentaram teores médios de fenólicos totais significativamente superiores aos dos chás pretos, tal como aconteceu com as mesmas infusões com Esta observação está de acordo com o referido por diferentes autores que observaram um maior teor de compostos fenólicos em chás verdes do que nos correspondentes chás pretos devido à transformação e degradação das catequinas monoméricas durante o processo de
, 2011).
Analisando a influência do tempo de infusão nos teores de fenólicos totais para cada grupo de chás se que o aumento do tempo de infusão se traduziu num aumento proporcional dos teores de fenólicos totais dos chás verdes dos Açores não se observando um efeito tão pronunciado nos chás verdes comerciais; em particular, nos chás verdes dos Açores a infusão de 5 minutos tem um teor de compostos fenólicos significativamente inferior aos das infusões de 15 e 30 minutos. Este e comportamento parece ser uma consequência da diferente granulometria destas amostras uma vez que as amostras de chá verde dos Açores são como já foi referido constituídas por folhas não trituradas. No entanto quando o tempo de extracção aumentou de 5 min para 15 min e 30 min as diferenças entre os chás verdes dos Açores e os chás verdes comerciais atenuaram
fenólicos totais foram idênticos para chás destes dois grupos.
Verde Comercial Preto Açores Preto *adicionados * *
A infusão que apresentou menor teor de fenólicos totais foi a de chá preto mg GAE/L de infusão, significativamente
Teor de fenólicos totais das amostras de infusões de 5, 15 e 30 minutos analisadas.
am teores médios de fenólicos totais , tal como aconteceu com as mesmas infusões com referido por diferentes autores que observaram um maior teor de compostos fenólicos em chás verdes do que nos correspondentes chás pretos devido à transformação e degradação das catequinas monoméricas durante o processo de
Analisando a influência do tempo de infusão nos teores de fenólicos totais para cada grupo de chás se que o aumento do tempo de infusão se traduziu num aumento proporcional çores não se observando um efeito tão pronunciado nos chás verdes comerciais; em particular, nos chás verdes dos Açores a infusão de 5 minutos tem um teor de compostos fenólicos significativamente inferior aos das infusões de 15 e 30 minutos. Este e comportamento parece ser uma consequência da diferente granulometria destas amostras uma vez que as amostras de chá verde dos Açores são como já foi referido constituídas por folhas não para 15 min e 30 min as diferenças entre os chás verdes dos Açores e os chás verdes comerciais atenuaram-se e os valores de
Preto Comercial
adicionados
* *
Os chás pretos comerciais avaliados neste trabalho apresentaram teores de compostos fenólicos totais bastante diversos entre si, em qualquer dos três tempos de infusão considerados e tal como no caso dos chás verdes dos Açores também os chás pretos dos Açores apresentaram teores de compostos fenólicos geralmente inferiores aos seus congéneres comerciais, o que indica que também no caso dos chás pretos, a granulometria afecta a cinética de dissolução dos compostos fenólicos da folha do chá. Esta hipótese é consistente com o facto de o chá preto Gorreana – Moinha (PA4), que apresenta a menor granulometria de entre os chás pretos dos Açores uma vez que é constítuido pelas folhas trituradas que ficam nos recipientes onde se efectuou a fermentação após a recolha das folhas de chá fermentado que constituem as restantes variedades de chá preto.
De uma forma geral os chás pretos (quer os dos Açores quer os comerciais) apresentaram uma menor variação do teor de compostos fenólicos totais em função do tempo de infusão do que a observada para os chás verdes, excepto no caso do chá preto comercial Earl Grey que apresentou um aumento muito importante do teor de fenólicos entre o tempo de infusão de 5 min e os tempos de 15 min e 30 min. Esta observação sugere que a cinética de extracção dos compostos fenólicos do chá preto é diferente da do chá verde, o que pode dever-se às diferenças na natureza química dos compostos extraídos. Por outro lado, as alterações sofridas pelas folhas de chá durante o processo de fermentação podem permitir uma maior facilidade de penetração da água na matriz e uma mais fácil transferência dos compostos fenólicos para a solução.
Nos chás pretos adicionados, as infusões de 5 minutos são significativamente diferentes das infusões de 15 minutos, mas aos 30 minutos as diferenças deixam de ser significativas em relação às infusões de 5 e 15 minutos. Neste grupo de chás o teor médio de fenólicos totais aumenta dos 5 para os 15 minutos, para reduz-se aos 30 minutos de infusão, ao contrário do que se verifica para os outros grupos que aumentam os teores médios de fenólicos totais dos 5 para os 15 minutos e dos 15 para os 30 minutos aumentam os estabilizam.
Tabela 3. 11 – Médias, desvios-padrão e coeficientes de variação dos teores de fenólicos totais dos diferentes tipos de infusões, de 5, 15 e 30 minutos, agrupadas de acordo com a origem geográfica das folhas de chá, constituição e processo de produção.
Chá verde de Açores (n=3) Chá verde Comercial (n=3) Chá verde Comercial adicionado (n=2) Chá preto de Açores (n=5) Chá preto Comercial (n=4) Chá preto Comercial adicionado (n=2) Total
Teor de fenólicos (mg/L) – Infusões 5 minutos
Média 484,18cde 782,32hi 761,97ghi 220,77a 419,70bcde 294,46abc 457,63
Desvio Padrão 64,73 29,06 13,75 75,06 152,25 40,57 228,39
Coeficiente de
Variação (%) 13,37 3,72 1,80 34,00 36,28 13,78 49,91
Teor de fenólicos (mg/L) – Infusões 15 minutos
Média 695,16fgh 864,17hi 884,21hi 253,19ab 586,67efg 525,30def 584,72
Desvio Padrão 131,24 29,28 67,32 72,22 58,20 165,86 247,75
Coeficiente de
Variação (%) 18,88 3,39 7,61 28,53 9,92 31,57 42,37
Tabela 3.11 (Continuação) Chá verde de Açores (n=3) Chá verde Comercial (n=3) Chá verde Comercial adicionado (n=2) Chá preto de Açores (n=5) Chá preto Comercial (n=4) Chá preto Comercial adicionado (n=2) Total
Teor de fenólicos (mg/L) – Infusões 30 minutos
Média 867,36hi 898,01i 886,79hi 312,37abc 585,77efg 374,48abcd 617,03
Desvio Padrão 106,64 75,81 121,30 78,71 105,10 89,67 265,03
Coeficiente de
Variação (%) 12,30 8,44 13,68 25,20 17,94 23,94 42,95
Letras diferentes em expoente indicam diferenças significativas (p<0.05) entre médias, de acordo com o teste de Tukey.
Considerando agora a evolução da média dos teores de fenólicos totais para cada grupo de chás em função do tempo de infusão (Tabela 3.11), verifica-se que este parâmetro afectou de forma significativa a média dos teores de fenólicos totais no caso dos chás verdes dos Açores e os chás pretos comerciais adicionados. Nos chás verdes dos Açores a infusão de 5 minutos é significativamente diferente das infusões de 15 e 30 minutos. Nos chás pretos adicionados, as infusões de 5 minutos são significativamente diferentes das infusões de 15 minutos, mas aos 15 minutos as diferenças deixam de ser significativas em relação às infusões de 5 e 15 minutos. Nos restantes grupos a heterogeneidade entre as amostras consideradas contribui certamente para que em termos médios não se observem diferenças significativas entre os teores de fenólicos destes grupos de chás.
Para alguns chás pretos (PC4, PC5 e PC6), o teor de fenólicos totais aumenta dos 5 para os 15 minutos, mas reduz-se aos 30 minutos de infusão, ao contrário do que se verifica para os outros chás para os quais os teores de fenólicos totais aumentam ou estabilizam quando o tempo de infusão aumenta.
Um comportamento análogo foi observado por Ramalho e colaboradores (Ramalho et al., 2013) que estudaram a influência do tempo e temperatura de infusão na extracção de compostos fenólicos a partir de chá preto. Estes autores verificaram queo teor de fenólicos totais nas infusões aumentou entre os 5 e 15 minutos, para a maior parte dos chás analisados mas diminuiu para várias amostras quando o tempo de infusão aumentou de 15 min para 30 min.
Esta variação do teor de fenólicos de chás pretos em função do tempo de extracção pode resultar de reacções de polimerização ou degradação que podem ocorrer entre os componentes fenólicos destes chás, após a sua extracção e que os convertem em formas com menor resposta específica no teste de Folin-Ciocalteu. Por outro lado, estes autores referem que, ao longo do tempo de infusão ocorre certamente a dissolução de diferentes classes de compostos pois a temperatura da infusão vai descendo gradualmente a partir dos 100 ºC; a natureza e concentração dos compostos fenólicos extraídos ao longo do tempo, às diferentes temperaturas, são também influenciadas pela origem dos chás e nomeadamente pelas condições de cultivo, sol, clima, práticas de colheita e processamento, o que explica as diferenças observadas entre as diferentes infusões preparadas em condições idênticas (Ramalho et al., 2013).
A temperatura de infusão, a razão chá:água e a velocidade de arrefecimento do chá foram parâmetros abordados por Nishiyama e colaboradores (Nishiyama et al., 2010), que avaliaram a influência destes parâmetros no teor fenólico das infusões. Estes autores utilizaram volumes diferentes de água para
preparar infusões com a mesma razão chá:água e o mesmo tempo de infusão e verificaram que para volumes maiores de infusão preparada, a velocidade de arrefecimento é menor
final é mais elevada e o mesmo se verifica com o teor de fenólicos totais.
O teor de fenólicos totais dos chás verdes e pretos preparados com 5 min de tempo de infusão foi também comparado com o mesmo teor de chás vermelhos e tisana
(figura 3.10). Verificou-se que as tisanas apresentam teores de compostos fenólicos bastante variáveis