3.2.1 - Amostragem
Os chás verdes, pretos e vermelhos, bem como as tisanas de ervas, utilizados neste trabalho foram adquiridos no comércio local de Portugal (território continental) ou foram fornecidos pelas fábricas de chás Gorreana e Porto Formoso, situadas na ilha de S. Miguel, arquipélago dos Açores.
Para mais fácil referenciação das amostras, apresenta-se na tabela seguinte (Tabela 3.8) os chás verdes e pretos, já apresentados no ponto 2.2.1 (Tabela 2.5), e as amostras de chás e tisanas incluídas neste trabalho.
Tabela 3. 8 – Identificação dos chás verdes, pretos e vermelhos e tisanas estudados sob a forma de infusões.
Tipo de
Infusão Marca Variedade Apresentação Composição Código
Chá Verde
Gorreana
Tradicional Folha enrolada 100% chá verde VA1
Encosta de Bruma Folhas 100% chá VA2
Hysson Folhas 100% chá VA3
Tetley --- Triturado, saquetas 100% chá verde VC1
Tley --- Triturado, saquetas 100% chá verde VC2
Salutem
--- Triturado, saquetas 100% chá verde VC3
--- Triturado, saquetas 95% chá verde + 5% raízes
de ginseng VC4
Lipton --- Triturado, saquetas
88.7% Chá verde + 7.2% folhas de menta + 4.1% aroma de menta VC5 Chá preto Gorreana
Orange Pekoe Folhas 100% chá PA1
Pekoe Folhas 100% chá PA2
Broken Leaf Folhas 100% chá PA3
Moinha Folhas 100% chá PA4
Porto
Formoso Pekoe Folhas 100% chá PA5
Li Cungo --- Triturado 100% chá preto
(Moçambique) PC1
Whiteeard
of Chelsea English Breakfast Triturado 100% chá ceilão (Sri Lanka) PC2
Lipton Earl Grey Triturado, saquetas
89.3% Chá preto + 10.2% Aroma natural de bergamota + 0.5% pétalas (bluef e jasmim)
PC3
Tetley --- Triturado, saquetas 100% chá preto PC4
Lipton --- Triturado, saquetas
86.6% chá preto + 10.7% aromas + 2.7% casca de limão
PC5
Tley --- Triturado, saquetas
50% canela + 40% chá preto + 8% aroma de canela + 2% aroma de laranja
Tabela 3.8 (Continuação)
Tipo de
Infusão Marca Variedade Apresentação Composição Código
Chás vermelho
Lipton Red Tea Triturado, saquetas
53.8% chá preto + 35.3% Rooibos + 6.4% hibísco + 4.3% aromatizantes
V1
Diese --- Triturado, saquetas 100% Rooibos V2
Tetley Rooibos Orange Triturado, saquetas
90% Rooibos + 9% aroma natural de laranja + 1% pedaços de laranja
V3
Erva Pura Vermelho Folhas 100% chá vermelho (yunnan
pu erh tea) V4
Tisanas
Tetley Tilia Triturado, saquetas 100% Tília T1
Tetley Melissa – Cidreira Triturado, saquetas 100% Cidreira T2
Tetley Menta Triturado, saquetas 100% menta T3
Lipton Morroco - Menta Triturado, saquetas
27.1% canela + 2.5% chicória, roseira brava, alcaçuz, casca de laranja, aroma natural, menta
T4
Tley Camomila Triturado, saquetas 100% Camomila T5
Lipton Verbena -
Lúcia-Lima Triturado, saquetas 100% Lúcia-Lima T6
As amostras adquiridas foram armazenadas à temperatura ambiente e ao abrigo da luz e da humidade.
3.2.2 – Preparação das infusões (0, 5, 15, 30 e 60 min)
Os chás foram preparados colocando 0,5 g de chá ou tisana em 50,0 mL de água destilada fervente. Os tempos de infusão foram de 0, 5, 15, 30 e 60 min, sem agitação. Após este tempo filtraram-se as infusões através de papel de filtro e armazenaram-se em recipientes de plástico estéreis, a -20ºC, num congelador horizontal (Eurofront, Uruguai, Teixeira e Ramalho, SA) até posterior análise.
3.2.3 – Preparação do extracto aquoso (60 min) Ver procedimento descrito no ponto 2.2.3
3.2.4 – Determinação do teor de fenólicos totais
A determinação dos compostos fenólicos totais foi feita pelo método Folin-Ciocalteu. Ver procedimento descrito no ponto 2.2.7.
3.2.5 - Determinação da actividade antioxidante das infusões 3.2.5.1 - Inibição do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH)
As infusões foram analisadas por adaptação do método descrito por Brand-Williams e colaboradores (Brand-Williams et al., 1995) e revisto por Sharma e Bhat (2009). Este método baseia-se na redução
do radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) por antioxidantes, produzindo um decréscimo da absorvância a 517 nm. Assim, preparou-se uma solução-mãe de 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) (Fluka, Steinheim, Germany) em metanol (grau puro, José Manuel Gomes dos Santos, Lda), com a
concentração de 2g/L. Efectuou-se a diluição de 3,3 mL da solução-mãe para um volume final de 100mL de forma a obter a solução de trabalho com a concentração aproximada de 66 mg/L. Estas soluções foram mantidas a 5ºC e ao abrigo da luz durante a sua utilização. A estabilidade das soluções foi periodicamente testada com padrões de ácido gálico. As amostras de infusões e chás foram diluídas usando factores de diluição entre de 1:1 e 1:60.
A 4,0 mL da solução de DPPH (66 mg/L) foi adicionado um volume de 0,5 mL de amostra diluída e a mistura foi incubada no escuro à temperatura de 22ºC, durante 15 min. Após esse período foi lida a absorvância da solução a 517 nm usando um espectrofotómetro UV-VIS (Novaspec®II Rapid, Pharmacia).
A inibição do radical DPPH pelas amostras diluídas foi calculada pela seguinte fórmula: % inibição = [(A(branco)-A(amostra))/A(Branco) *100]
onde A(branco) e A(amostra) são as absorvâncias de água e da amostra, respectivamente, nas condições de teste.
A inibição do radical DPPH pelos chás e infusões não diluídas foi avaliada em equivalentes de ácido gálico (mg/L), utilizando uma recta de calibração traçada com padrões de concentração na gama de 2,5 a 25 mg de ácido gálico/L.
As determinações foram realizadas em duplicado para cada amostra. 3.2.5.2 - Actividade antioxidante de redução férrica (FRAP)
O ensaio FRAP (poder antioxidante de redução férrica) mede seja capacidade de redução de iões férricos (Fe3+) a iões ferrosos (Fe2+), a valores de pH baixo; a detecção dos iões ferrosos é efectuada mediante a formação de um complexo corado azul (complexo ferroso 2,4,6 - tripiridil-s-triazina). Com este método é uma adaptação do procedimento descrito por Benzie e Strain (1996).
Preparou-se o reagente FRAP, juntando uma solução de tampão acetato 300 mM (pH=3.6) (1,5500 g CH3COONa.3H2O (Sigma–Aldrich, Steinheim, Germany) e 8,0 mL CH3COOH glacial (PA-ACS-ISO, Panreac, Barcelona, Spain) em 500mL), solução ácida do complexo de 2,4,6 - tripiridil-s-triazina e Ferro III (TPTZ) 10 mM (0,0310 g TPTZ (Sigma–Aldrich (Steinheim, Germany) em HCl 40 mM (HCl - 37%, Merck, Darmstadt, Germany) e solução de cloreto de ferro III hexahidratado 20 mM (0,0540 g FeCl3.6H2O (Himedia Laboratories, Bombaim, Índia) em 10 mL H2O). A mistura destas soluções faz-se numa razão de 10:1:1.
A 3,0 mL de solução foi adicionado um volume de 0,3 mL de infusão e a mistura incubada num banho a 37 ºC, durante 4 min.
Os valores de absorvância são lidos no espectrofotómetro UV-VIS (Novaspec®II Rapid, Pharmacia) a um comprimento de onda de 593 nm.
As determinações foram realizadas em duplicado para cada amostra e os valores expressos em mg/L infusão.
3.2.6 – Análise dos compostos fenólicos das infusões por HPLC
A determinação do perfil de compostos fenólicos foi efectuada num sistema de HPLC Spectrophysics (Spectrophysics, São José, USA) compreendendo um desgaseificador (Spectra system SCM1000), uma bomba binária (Spectra system P2000), um amostrador automático (Spectra system AS1000) e um detector de vector de diodos UV 6000LP (Spectra system SN4000) sendo o funcionamento deste sistema controlado pelo programa informático, Xcalibur Ink 2.0.6 (Thermo).
A separação foi realizada numa coluna C-18 de fase reversa (UP-5ODB-25K, Uptisphere 5µ ODB, Interchrom, Paris, França). As amostras foram filtradas através de um filtro de membrana de celulose de 22 µm (BGB Analytik, Alexandria, USA) após o que se efectuou a injecção de uma alíquota de 20 µL.. A fase móvel foi constituída por ácido fórmico a 0,5% (eluente A) e uma mistura de ácido fórmico (Panreac, Barcelona, Espanha), acetonitrilo (Baker HPLC analyzed, J.T.Baker, UK) e água desionizada (obtida através do sistema Milli-Q (Millipore, Molsheim, France) na razão de 5:400:595 (eluente B). Todos os solventes foram desgaseificados em banho de ultrassons (Selecta, Barcelona, Espanha) antes da sua utilização.
A eluição foi realizada a um um fluxo constante de 0,70 mL/min utilizando a seguinte programação da bomba: início da eluição com 100% de eluente A, seguindo-se um gradiente linear até 80% de A, durante 15 min e um período isocrático de 10 min; de seguida efectuou-se um gradiente até 30% de A num período de 35 min e um período isocrático de 5 min; finalmente programou-se um gradiente até 0% de A, em 10 min e um período isocrático de 5 min. Programou-se o retorno da coluna às condições iniciais (100% de A), num período de 20 min seguido de um período isocrático de 3 min (Bravo et al., 2006).
Os cromatogramas foram adquiridos na gama de comprimentos de onda entre 200 e 600 nm e aos comprimentos de onda selectivos de 280 nm, 320 nm e 360 nm. Os compostos fenólicos foram identificados por comparação dos respectivos tempos de retenção e dados espectrais com dados análogos de padrões autênticos e resultados publicados na literatura. Todas as análises foram efectuadas em duplicado e sempre que o desvio padrão relativo da área cromatográfica absoluta excedeu 10 % repetiu-se a análise.
A concentração dos compostos foi avaliada em termos absolutos utilizando rectas de calibração construídas com padrões cromatográficos na gama de concentrações típicas dos chás e, em termos relativos, como percentagem da área cromatográfica total.
3.2.6.1 – Preparação e análise das soluções padrão
Os padrões utilizados neste trabalho, nomeadamente, os ácidos hidroxibenzóicos (ácido gálico (G7384 Sigma), ácido 3,4-dihidroxibenzóico (08992 Fluka), ácido clorogénico (C3878 Aldrich), ácido cafeico (C0625 Sigma), ácido coumárico (C9008 Sigma ) e ácido ferúlico (128708 Aldrich)), os flavonoides (procianidina B2 (42157 Fluka), isoquercitrina (00140585 Fluka), hidrato de quercitrina (Q3001 Sigma), dihidrato de floridzina (P3449 Sigma), quercitina (Q4951 Sigma) e floretina (P7912 Sigma)) e as catequinas (cafeina, Catequina 3-galato, Epicatequina, Epicatequina-3-galato, (−)-Epigalocatequina 3-galato, (−)-Galocatequina e (−)-Galocatequina 3-galato) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Química, S.L., Portugal.
As catequinas apresentavam-se em solução, numa mistura de catequinas do chá verde (G-016 Cerilliant) em que cada um dos componentes tem a concentração de 100 µg/mL em acetonitrilo: água
(8:2) com 5% HCl (1M), numa ampola com o volume de 1,0 mL. Todos os outros padrões se apresentavam em pó.
As soluções concentradas de ácidos benzoicos (9000 mg/L) e de flavonoides (1000 mg/L), com excepção da procianidina B2 (180 mg/L) foram individualmente preparadas dissolvendo o peso apropriado de cada composto em metanol. As soluções mais diluídas de cada ácido benzoico (90 mg/L) e de cada flavonoide (100 mg/L), com excepção da procianidina B2 (90 mg/L) também foram preparadas individualmente em metanol. Várias misturas contendo todos os ácidos benzoicos, nas concentrações de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 mg/L de cada composto foram preparadas em metanol e
utilizadas como misturas padrão para as curvas de calibração. Várias misturas contendo todos os flavonóides, em concentrações de 12.5, 25, 50, 100 e 200 mg/L de cada composto foram preparadas em metanol e utilizadas como misturas padrão para as curvas de calibração. Foram ainda preparadas soluções diluidas, a partir da solução de catequinas, com concentrações de 12, 25, 50 e 100 mg/L de cada uma das catequinas, que foram utilizadas no traçado das curvas de calibração.
As soluções padrão foram injectadas em HPLC e as áreas dos picos correspondentes foram registadas. Traçaram-se curvas de calibração para cada padrão representando graficamente a concentração (eixo X) versus a área de pico cromatográfico correspondente. Estas curvas foram utilizadas para determinar as concentrações destes padrões nas amostras analisadas. Quando não foi possível obter o padrão correspondente utilizou-se a curva de calibração de um composto da mesma família, por exemplo ácido gálico para quantificar ácidos hidroxibenzóicos ou quercetina para quantificar flavonoides expressando-se a concentração em equivalentes do padrão utilizado.
3.2.7 – Tratamento estatístico
As análises foram efectuadas em duplicado e os resultados obtidos foram expressos como a média e o desvio padrão.
O desvio padrão relativo ou coeficiente de variação foi calculado como a razão entre o desvio padrão e a média e expresso em percentagem.
Os chás incluídos neste trabalho foram agrupados em função do tipo de chá, presença de aditivos e origem geográfica, e os diferentes grupos homogéneos foram calculadas as médias e desvios padrão das variáveis em estudo, para os grupos considerados.
A análise estatística foi realizada usando SPSS ® 19.0 e os módulos de tratamento estatístico do
software Excel. Foi efectuada uma análise de variância (ANOVA) para determinar se existem diferenças significativas entre médias (p <0,05) e utilizou-se o teste de Tukey para efectuar comparações múltiplas entre médias de forma agrupá-las em conjuntos homogéneos.
Para as diferentes variáveis determinadas neste trabalho avaliou-se a existência de correlações lineares significativas através do cálculo do coeficiente de correlação de Pearson. Os critérios de interpretação
deste coeficiente foram os seguintes (Callegari-Jacques, 2003): Se 0,00<│r│<0,30, existe uma
correlação fraca; Se 0,03≤│r│<0,60, existe uma correlação moderada; Se 0,60≤│r│<0,90, existe uma
correlação forte; Se 0,90≤│r│< 1,00, existe correlação muito forte.