As amostras de chás verdes e pretos, incluídas neste trabalho, são apresentadas na Tabela 2.5. Os dezanove tipos de chás verdes e pretos (3 variedades de chá verde e 5 variedades de chá preto) dos Açores e onze chás importados (5 chás verdes e 6 chás pretos) foram adquiridos nos Açores e em Portugal Continental.
Tabela 2. 5 – Identificação dos chás verdes e pretos estudados sob a forma de folhas secas ou infusões.
Tipo de
Infusão Marca Variedade Apresentação Composição Código
Chá Verde
“Gorreana”
“Tradicional” Folha enrolada 100% chá verde VA1
“Encosta de Bruma” Folhas 100% chá VA2
“Hysson” Folhas 100% chá VA3
“Tetley” --- Triturado, saquetas 100% chá verde VC1 “Tley” --- Triturado, saquetas 100% chá verde VC2 “Salutem” --- Triturado, saquetas 100% chá verde VC3 --- Triturado, saquetas 95% chá verde + 5% raízes de ginseng VC4 “Lipton” --- Triturado, saquetas 88.7% Chá verde + 7.2% folhas de menta + 4.1% aroma de menta VC5 Chá preto “Gorreana”
“Orange Pekoe” Folhas 100% chá PA1
“Pekoe” Folhas 100% chá PA2
“Broken Leaf” Folhas 100% chá PA3
“Moinha” Folhas 100% chá PA4
“Porto
Formoso” “Pekoe” Folhas 100% chá PA5
“Li Cungo” --- Triturado 100% chá preto (Moçambique) PC1
“Whiteeard
of Chelsea” “English Breakfast” Triturado 100% chá ceilão (Sri Lanka) PC2
“Lipton” “Earl Grey” Triturado,
saquetas
89.3% Chá preto + 10.2% Aroma natural de bergamota + 0.5% pétalas (bluef e jasmim)
PC3 “Tetley” --- Triturado, saquetas 100% chá preto PC4 “Lipton” --- Triturado, saquetas 86.6% chá preto + 10.7%
aromas + 2.7% casca de limão PC5
“Tley” --- Triturado, saquetas 50% canela + 40% chá preto + 8% aroma de canela + 2% aroma de laranja PC6
2.2.2 – Preparação das infusões (5 min, 15 min)
Os chás foram preparados colocando 0,5 g de chá ou tisana em 50,0 mL de água destilada fervente (100 ºC). O tempo de infusão foi de 5 e 15 min, sem agitação. Após este tempo filtrou-se a infusão obtida com papel de filtro.
Os extractos obtidos foram armazenados num congelador (Eurofront, Uruguai, Teixeira e Ramalho, SA) a -20ºC, para posterior análise.
2.2.3 – Preparação do extracto aquoso (60 min)
Os extractos aquosos foram preparados de acordo com o método oficial 920.104 do AOAC (1990) colocando 2,0 g de chá em 200,0 mL de água destilada. Esta solução foi colocada a ferver durante 1 hora com refluxo. Após este tempo filtrou-se a infusão obtida com papel de filtro.
Os extractos obtidos foram armazenados num congelador (Eurofront, Uruguai, Teixeira e Ramalho, SA) a -20ºC, para posterior análise.
2.2.4 – Determinação do teor de humidade nas folhas
O teor de humidade foi determinado de acordo com o método oficial 930.15 do AOAC (1990). Assim, uma amostra de 2,0 gramas de folhas de chá foi colocada num pesa-filtros previamente tarado. Esta foi seca em estufa a 135 ºC (WTC binder (0-250ºC), Tuttlingen, Germany) durante duas horas. Arrefeceram-se as amostras num excicador. Quando fria, a amostra foi pesada novamente.
2.2.5 - Determinação do extracto seco das infusões
No caso das infusões, os 250 mL obtidos da infusão foram evaporados até à secura. O resíduo obtido foi colocado em estufa a 135 ºC (WTC binder (0-250ºC), Tuttlingen, Germany) durante duas horas. Arrefeceram-se as amostras num excicador. Quando fria, a amostra foi pesada (Método 930.15 do AOAC (1990)).
2.2.6 - Determinação de cinzas
O teor de cinzas foi determinado de acordo com o método oficial 942.05 do AOAC (1990). Foram determinadas as cinzas quer das folhas de chá, quer das suas infusões.
A primeira fase desta determinação é a incineração das amostras em mufla (Heraus-electronic, Germany) durante 2 horas, a 550ºC. No caso das folhas de chá foram utilizadas 1,00 g de folha de chá e no caso das infusões, o resíduo obtido (extracto seco) foi incinerada.
Após as 2 horas retiram-se as cápsulas da mufla e colocam-se num excicador, e depois de arrefecidas foram pesadas numa balança analítica (Mettler Toledo AB204, Suiça).
2.2.7 - Determinação do teor de fenóis totais
O teor de fenólicos totais das folhas e das infusões de chá foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteau (Singleton et al., 1999). Amostras de 500 µL do chá (filtrado) foram transferidas para tubos
de ensaio, seguidas da adição de 500 µL do reagente de Folin-Ciocalteau (Sigma–Aldrich (Steinheim,
Germany) para promoção da oxidação das infusões e, passados 2 minutos, o meio foi neutralizado pela adição de 9,0 mL de uma solução com carbonato de sódio (PA-ACS-ISO, Panreac Química SA (Barcelona, Spain)) a 2,0% (m/v). Após 30 minutos de reacção no escuro e à temperatura ambiente, foi realizada a leitura das absorvâncias a 765 nm, utilizando-se um espectrofotómetro UV-Vis (Pharmacia,
Novaspec® II, Biochrom, England). O branco foi preparado da mesma forma, substituindo-se a solução-amostra por água destilada. Os resultados foram expressos em mg de ácido gálico/g de chá seco para este teor nas folhas e chá e em mg de ácido gálico/L de infusão.
2.2.8 - Determinação dos teores de fósforo e azoto das folhas
Para se fazer a determinação do fósforo e do azoto foi necessário proceder à digestão das amostras. Este procedimento foi efectuado através de uma adaptação do método para determinação de azoto total em fertilizantes (método 955.04 do AOAC (1990).
Colocou-se cerca de 1,0 g de amostra, pesado rigorosamente, num tubo de digestão. Adicionaram-se 10,0 mL de ácido sulfúrico (97%, Merck, Darmstadt, Germany) e uma porção de mistura catalisadora (100 g de sulfato de potássio (Panreac) e 1g de selénio negro em pó (Riedel-de-Hien, Suiça)) e reguladores de ebulição. Levou-se a mistura a aquecer num digestor a 360ºC até a amostra ficar transparente. A solução assim obtida é transferida para um balão volumétrico de 100 mL, já com cerca de 50 mL de água destilada, que foi aferido. Filtrou-se a solução para um frasco e reservou-se até utilização.
2.2.8.1 - Determinação do teor de Ortofosfatos
O teor de ortofosfatos das folhas de chá foi determinado utilizando uma adaptação do método 931.01 do AOAC (1990).
Preparou-se uma solução redutora, juntando 250 mL de H2SO4 (35,0 mL H2SO4 (97%, Merck (Darmstadt, Germany)) em 250 mL de solução), a 75 mL de Molibdato de Amónio (10,0 g de (NH4)6Mo7O24. 4H2O - Puriss p.a. (Riedel-de-Hien, Suiça) - em 250 mL de água), a 2,6 g de ácido ascórbico (Anatical Reagent Grade (Fleber Chemical, UK)) e a 25 mL de tartarato de potássio e antimónio (0,75 g de K(SbO)C4H4O6. 0,5H2O em 250 mL).
Num balão volumétrico de 100 mL juntou-se uma determinada quantidade de amostra, 8,0 mL de solução redutora previamente preparada e perfez-se o balão com água ultrapura (miliQ) (Millipore, Molsheim, France). Esperou-se 30 minutos para o desenvolvimento de cor.
Traçou-se a recta de calibração deste método utilizando soluções padrão de fosfatos (dihidrogenofosfato de potássio).
Utilizando um espectrofotómetro (Pharmacia (Novaspec® II), Biochrom, England) fizeram-se as leituras de absorvância a 880 nm que foram comparadas com a recta de calibração.
2.2.8.2 - Determinação do teor de Azoto Amoniacal
A determinação do azoto amoniacal das folhas de chá foi efectuada utilizando uma adaptação do método Kjeldhal (método 955.04 do AOAC (1990).
A amostra a analisar (10 mL) foi diluída por adição de 90 mL de água destilada. O pH da solução foi ajustado a pH>8, utilizando hidróxido de sódio 6N, e fenolftaleína como indicador.
A solução indicadora do ião NH4 +
foi preparada por mistura de 100 mL de solução indicadora de vermelho de metilo (0,2 mL de vermelho de metilo (indicador) – Merck (Darmstadt, Germany) – em 100 mL de etanol - Puro, José Manuel Gomes dos Santos, Lda) e 50 mL de solução indicadora de azul de metilo (0,1 g de azul de metilo - Panreac Química SA (Barcelona, Spain) – em 50 mL de etanol - Puro, José Manuel Gomes dos Santos, Lda).
A solução de recolha foi preparada por diluição de 0,5 mL de solução indicadora do ião NH4+, em 50 mL de solução aquosa de ácido bórico (20,0 g de ácido bórico - Analitical Reagent Grade, Fisher Scientific, Leicestershire, UK dissolvido a quente em 1000 mL água).
Para determinação do teor de azoto amoniacal, colocou-se no destilador (Kjeltec System 1002 Distilling Unit, Tecator, Hoganas, Sweden) a solução da amostra a analisar em tubo de vidro próprio e a solução de recolha no erlenmeyer em que foi preparada. Deixou-se destilar até que o volume de solução no erlenmeyer de recolha atinjir os 200 mL. A cor verde da solução de recolha indica a presença de azoto amoniacal.
Para determinação da concentração de NH3, titulou-se a solução de recolha com ácido sulfúrico, 0,02N (0,55 mL de H2SO4 (97%, Merck (Darmstadt, Germany)) aferido a 1000mL solução), até a solução apresentar cor roxa.
2.2.9 - Determinação da composição mineral das folhas de chá e das infusões
A cinza obtida anteriormente foi dissolvida, a quente, utilizando soluções de ácido nítrico - HNO3
(65%, PA-ISO, Panreac); adicionaram-se sucessivamente 2 x 10 ml HNO3 (1:1) e 10 mL de HNO3
(3,25 N), tendo-se evaporado até à secura as soluções resultantes das duas primeiras adições. Quando fria, filtrou-se a solução final e aferiu-se a um volume final de 100 mL com água miliQ (ultrapura) (Millipore, Molsheim, France).
O teor de metais foi determinado de acordo com o método oficial 975.03 do AOAC (1990).
Para cada amostra foram determinados os metais Na, Mg, Al, Ca, K, Zn e Cu, e por espectrofotometria de absorção atómica à chama (Analytik jena Zeenit 700, Jena, Germany). Foram utilizadas lâmpadas de Na, Mg, K, Al e Ca (Analytikjena, Jena, Germany) e Cu e Zn (UNICAM Thermo Scientific, Waltham, EUA).
Na determinação de Na, Mg, K, Cu e Zn foi utilizada chama ar/acetileno. Para Al e Ca foi usada chama acetileno/óxido nitroso.
Os parâmetros instrumentais estabelecidos para a determinação destes metais foram os seguintes:
Parâmetros Na Mg Al K Ca Cu Zn
λ (nm) 589.0 285.2 309.3 766.5 422.7 324.8 213.9
Corrente da
lâmpada (mA) 8 6 10 8 6 5 10
Para determinar a gama linear foram construídas curvas de calibração com concentrações crescentes das soluções de referência. As soluções padrão utilizadas foram obtidas através da diluição sucessiva de soluções de stock 1000 mg L-1 (Merck, Darmstadt, Germany). Analisaram-se os resultados pelo cálculo da linha de regressão pelo método dos mínimos quadrados.
Os dados referentes à recta de calibração para a determinação dos vários metais são os seguintes: Factores de calibração Na Mg Al K Ca Cu Zn Gama das soluções padrão (mg/L) 0,000-0,560 0,000-0,280 0,000-5,000 0,000-1,600 0,000-2,000 0,000-2,800 0,000-1,000
As amostras foram diluídas tendo em consideração a informação de composição mineral da literatura de forma a adequar a diluição à gama de trabalho.
Os resultados foram expressos em mg de metal /Kg de chá seco para o teor mineral nas folhas e em mg de metal/L de infusão para as infusões de 5 e 15 minutos.
2.2.10 – Tratamento estatístico
As análises foram efectuadas em duplicado e os resultados obtidos foram expressos como a média e o desvio padrão.
O desvio padrão relativo ou coeficiente de variação foi calculado como a razão entre o desvio padrão e a média e expresso em percentagem.
Os chás incluídos neste trabalho foram agrupados em função do tipo de chá, presença de aditivos e origem geográfica, e os diferentes grupos homogéneos foram comparados entre si quanto às variáveis em estudo.
A análise estatística foi realizada usando SPSS ® 19.0 e os módulos de tratamento estatístico do
software Excel. Foi efectuada uma análise de variância (ANOVA) para determinar se existem
diferenças significativas entre amostras (p <0,05). O teste de Tukey foi utilizado para efectuar comparações múltiplas entre pares de médias de forma a identificar quais as amostras que são significativamente diferentes.