Desenvolvimento e validação de métodos analíticos para quantificação de artemeter e lumefantrina em
ARTEMETER LUMEFANTRINA Parâmetro Valor Teor
(%) tr (min) Fator T Teor (%) tr (min) Fator T Resolução 58 102,09 3,13 1,12 99,17 4,29 2,00 3,95 60 101,69 2,95 1,06 99,02 3,73 1,86 3,14 Proporção de ACN (%) 62 101,47 2,77 1,11 99,08 3,22 1,73 2,19 2,15 101,60 2,95 0,94 100,30 3,70 1,87 3,08 2,35 102,17 2,95 1,06 99,85 3,73 1,86 3,14 pH aparente 2,55 101,31 2,95 1,02 100,58 3,75 1,87 3,20 0,8 101,20 3,68 1,03 99,53 4,62 1,96 3,01 1,0 101,69 2,95 1,06 99,02 3,73 1,86 3,14 Fluxo (ml/min) 1,2 101,82 2,45 0,96 99,44 3,06 1,77 3,00 25 101,92 3,09 1,10 99,06 3,78 1,95 3,15 30 101,49 2,95 1,06 99,01 3,73 1,89 3,12 Temp. da coluna (° C) 35 102,26 2,93 1,12 98,64 3,24 1,90 2,99
Para cada parâmetro, os valores de teor obtidos para os fármacos foram estatisticamente comparados por meio de análise de variância (ANOVA). Em todas as
Resultados e discussão - 75 -
análises, os valores de F calculados foram inferiores aos valores de F crítico, com nível de confiança de 95% (α = 0,05), indicando que não houve diferença estatisticamente significativa entre os teores de artemeter e lumefantrina quando se induziu pequena variação na proporção de acetonitrila na fase móvel, no pH aparente da fase móvel, no fluxo e na temperatura da coluna. Desta forma, o método por CLAE pode ser considerado robusto para quantificação de artemeter e lumefantrina em comprimidos.
De acordo com os resultados, observa-se que a diminuição da proporção de acetonitrila na fase móvel promoveu aumento no tempo de retenção dos fármacos e consequentemente, aumento na resolução entre os picos. Entretanto, essa alteração apresentou efeito negativo sobre o fator de cauda de lumefantrina, que aumentou para 2,00. A alteração do fluxo da fase móvel promoveu alterações no tempo de retenção dos dois fármacos e no fator de cauda de lumefantrina, mas não foi observado efeito em relação à resolução entre os picos no cromatograma. O tempo de retenção dos fármacos variou ligeiramente com a alteração da temperatura da coluna, enquanto o pH aparente da fase móvel não demonstrou efeito significativo em nenhum dos parâmetros analíticos avaliados.
2.4.2.6 Limites de detecção e quantificação
Foram preparadas oito soluções diluídas contendo artemeter e lumefantrina, nas mesmas proporções da concentração de trabalho. Os limites de detecção e quantificação foram determinados por meio da equação que leva em consideração parâmetros da curva analítica e pela razão sinal/ruído obtida em cromatogramas de soluções diluídas. Além disso, para definir o limite de quantificação, avaliou-se o desvio padrão relativo das áreas obtidas em replicatas de injeções das soluções diluídas, considerando-se satisfatórios valores inferiores a 2,0%. Os valores obtidos estão representados na Tabela 30.
Tabela 30 – Limites de detecção e quantificação de artemeter e lumefantrina determinados pela curva analítica e pela razão sinal/ruído.
Limite de detecção (µg/ml) Limite de quantificação (µg/ml) Fármaco
Curva analítica Razão sinal/ruído Curva analítica Razão sinal/ruído
Artemeter 8,54 5,00 25,88 15,00
Os limites de detecção e quantificação encontrados pela razão sinal/ruído foram consideravelmente menores do que aqueles calculados pela equação e se aproximam mais dos valores reais, uma vez que foram obtidos pela avaliação da resposta de soluções diluídas dos fármacos.
Os limites de detecção e quantificação de artemeter foram significativamente maiores do que aqueles obtidos para lumefantrina, devido à sua baixa absortividade na região do ultravioleta. Entretanto, como o objetivo do método é a quantificação simultânea dos dois fármacos, deve-se manter a proporção da concentração de trabalho para definição dos limites de detecção e quantificação e posteriores análises. Assim, considerando-se que artemeter é o fármaco limitante em relação à sensibilidade do método, os limites de detecção foram 5,00 µg/ml de artemeter e 3,75 µg/ml de lumefantrina, e os limites de quantificação, 15 µg/ml de artemeter e 11,25 µg/ml de lumefantrina.
2.4.3 Quantificação de artemeter e lumefantrina em comprimidos de dose fixa combinada
Amostras de comprimidos de dose fixa combinada (Coartem® e Co-artesiane®) contendo 20 mg de artemeter e 120 mg de lumefantrina foram analisados, em sextuplicata, pelo método por CLAE desenvolvido e validado. Os resultados obtidos estão demonstrados na Tabela 31.
Tabela 31 – Teores de artemeter e lumefantrina em comprimidos de dose fixa combinada, determinados por CLAE (n = 6).
Teor (%) ± desvio padrão Amostra Lote Artemeter Lumefantrina 04137 101,69 ± 1,09 99,02 ± 0,63 Coartem® F0168 103,35 ± 1,25 97,92 ± 0,24 F0311 98,61 ± 0,59 98,89 ± 0,53 Co-artesiane® 5002 101,71 ± 1,00 100,48 ± 0,23
Todos os lotes analisados apresentaram teores de artemeter e lumefantrina próximos à quantidade declarada e dentro da faixa de 95% a 105% do valor rotulado. O teor de artemeter nos comprimidos variou de 98,61% a 103,35%, enquanto para
Resultados e discussão - 77 -
lumefantrina obteve-se variação de 97,92% a 100,48%. Desta forma, todos os comprimidos apresentaram qualidade adequada em relação aos teores de artemeter e lumefantrina.
A quantificação simultânea dos fármacos em associação, como em comprimidos de dose fixa combinada, apresenta vantagens como menor tempo de análise, menor gasto de solventes e de amostras. Entretanto, quando esses fármacos apresentam características estruturais e comportamentos químicos distintos, a otimização dos processos de separação e detecção se torna um desafio.
O desenvolvimento de métodos analíticos simples e confiáveis é essencial para identificação e determinação quantitativa dos fármacos, uma vez que o problema de medicamentos antimaláricos falsificados ou de qualidade inadequada é bem estabelecido em vários países, principalmente na África e sudeste da Ásia (GREEN et al., 2001; ATEMNKENG et al., 2007). A utilização de medicamentos com baixos teores pode contribuir para o desenvolvimento de resistência do plasmódio, devido à exposição a doses sub-terapêuticas do fármaco. Além disso, apesar da associação de artemeter e lumefantrina apresentar perfil adequado de segurança e tolerabilidade em humanos (BAKSHI et al., 2000), doses elevadas levaram à neurotoxicidade (NONTPRASERT et al., 2002) e hepatotoxicidade (ADARAMOYE et al., 2008) em animais, de forma que medicamentos com teores muito elevados dos fármacos podem não apresentar segurança terapêutica adequada.
Assim, é de extrema importância avaliar e controlar a qualidade dos medicamentos antimaláricos comercializados e distribuídos atualmente, por meio de métodos rápidos e simples, que podem ser executados em qualquer laboratório, incluindo aqueles que não dispõem de facilidades de recursos. Estas medidas podem ajudar a garantir a eficácia do tratamento e evitar o desenvolvimento de resistência aos antimaláricos, sendo importantes ferramentas para o controle efetivo da malária em áreas endêmicas.
3 CONCLUSÕES
• O método por CLAE com detecção UV descrito na Farmacopéia Internacional 4ª edição, após adaptações visando reduzir o tempo de análise e a concentração de trabalho, se mostrou seletivo, preciso e linear na faixa de 2,0 a 6,0 mg/ml, podendo ser aplicado para quantificação de artemeter em matéria-prima.
• CLAE, espectrofotometria na região do ultravioleta e volumetria em meio não- aquoso forneceram resultados entre 99,05% e 99,82% para quantificação de lumefantrina em matéria-prima. Como são métodos simples e relativamente rápidos, podem ser aplicados com sucesso a análises rotineiras em controle de qualidade.
• Para a quantificação de lumefantrina em comprimidos, resultados mais confiáveis foram obtidos por CLAE (97,94%) e espectrofotometria no UV (98,03%), uma vez que foram detectadas interferências no método por titulação em meio não aquoso (101, 41%).
• O teste de Youden se mostrou uma ferramenta confiável e prática para validação da robustez do método cromatográfico para quantificação de lumefantrina em matéria- prima, tornando possível a avaliação da influência de várias condições analíticas nos parâmetros cromatográficos do método.
• O método por CLAE com detecção UV (210 nm) desenvolvido se mostrou simples e adequado para quantificação simultânea de artemeter e lumefantrina em comprimidos de dose fixa combinada. O método demonstrou ser seletivo, linear na faixa de 150 a 450 μg/ml para artemeter e 200 a 600 μg/ml para lumefantrina, preciso (DPR < 2,0%), exato (taxas de recuperação próximas a 100%) e robusto, podendo ser empregado para quantificação dos fármacos e análise da qualidade dos comprimidos.