Preparo das soluções padrão e amostra de artemeter e lumefantrina

Solução padrão de artemeter e lumefantrina: aproximadamente 40 mg de artemeter

SQR e 30 mg de lumefantrina SQR foram exatamente pesados e transferidos para balão volumétrico de 100 ml. Adicionaram-se 2 ml de clorofórmio para completa solubilização, seguidos da adição de 80 ml de acetonitrila. O volume foi ajustado com ácido trifluoroacético 0,05% (v/v), de modo a obter solução a 400 µg/ml de artemeter e 300 µg/ml de lumefantrina.

Solução padrão estoque de artemeter: aproximadamente 175 mg de artemeter

matéria-prima, previamente padronizada com padrão primário e dessecada a 60 °C em estufa a vácuo por 3 horas, foram exatamente pesados e transferidos para balão volumétrico de 100 ml. Adicionaram-se 2 ml de clorofórmio para completa solubilização e o volume foi ajustado com acetonitrila, de modo a obter solução a 1750 µg/ml.

Solução padrão diluída de artemeter: transferiram-se 10 ml da solução padrão

estoque de artemeter para balão volumétrico de 50 ml e o volume foi ajustado com fase

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Solução amostra: pesou-se, exatamente, quantidade do pó dos comprimidos

equivalente a 1,25 pesos médios (25 mg de artemeter e 150 mg de lumefantrina) e transferiu-se para balão volumétrico de 100 ml. Adicionaram-se 5 ml de clorofórmio e submeteu-se a banho de ultra-som por 3 minutos. O volume foi ajustado com acetonitrila, a solução foi homogeneizada e filtrada. Transferiram-se 10 ml do filtrado para balão volumétrico de 50 ml e adicionaram-se 10 ml da solução padrão estoque de artemeter. O volume foi ajustado com fase móvel, de modo a obter solução a 400 µg/ml de artemeter (50 µg/ml provenientes do medicamento e 350 µg/ml provenientes da solução padrão adicionada) e 300 µg/ml de lumefantrina.

1.2.4.3 Validação

Após avaliação dos parâmetros cromatográficos, o método otimizado foi obtido utilizando-se coluna Zorbax SB-Ciano (150 x 4,6 mm; 5 µm) e fase móvel composta por acetonitrila e ácido trifluoroacético 0,05% (60:40), pH 2,35. O método, então, foi validado segundo os procedimentos recomendados pela Resolução RDC n° 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA e o Guia de Validação de Procedimentos Analíticos ICH (1996).

1.2.4.3.1 Linearidade

Foram preparadas, em triplicata, soluções padrão estoque contendo 1000 µg/ml de artemeter e 750 µg/ml de lumefantrina. A partir de cada solução estoque, foram feitas diluições para cinco diferentes concentrações, conforme Tabela 8.

Tabela 8 – Soluções diluídas de artemeter e lumefantrina para construção das curvas analíticas e avaliação da linearidade do método analítico por CLAE.

Intervalo linear (%) Volume da sol. estoque (ml) Concentração de artemeter (µg/ml) Concentração de lumefantrina (µg/ml) Fase móvel q.s.p (ml) 50 5,0 200 150 25 75 7,5 300 225 25 100 10,0 400 300 25 125 12,5 500 375 25 150 15,0 600 450 25

As concentrações de trabalho (100%) otimizadas para as análises foram 400 µg/ml de artemeter e 300 µg/ml de lumefantrina e o intervalo estabelecido para avaliação da linearidade foi 50 a 150%.

Além disso, avaliou-se a linearidade para artemeter segundo o procedimento de adição de padrão adotado para a análise dos comprimidos. Foram preparadas soluções com os comprimidos contendo 250 µg/ml de artemeter, em triplicata. Alíquotas destas soluções foram diluídas em fase móvel e 10 ml da solução padrão estoque de artemeter contendo 1750 µg/ml foi adicionado. O volume foi ajustado para 50 ml. As diluições realizadas estão demonstradas na Tabela 9.

Tabela 9 – Diluições para avaliação da linearidade do método analítico por CLAE para quantificação de artemeter pelo método de adição de padrão.

Sol. amostra estoque Sol. padrão estoque %

Volume (ml) Conc (µg/ml) Volume (ml) Conc (µg/ml)

Conc final (µg/ml) Fase móvel q.s.p (ml) 50 5 25 10 350 375 50 75 7,5 37,5 10 350 387,5 50 100 10 50 10 350 400 50 125 12,5 62,5 10 350 412,5 50 150 15 75 10 350 425 50

Este procedimento foi realizado por se aproximar mais daquele empregado nas análises para determinação de teor de artemeter nos comprimidos, uma vez que, nestes casos, sempre será realizada adição de 350 µg/ml de artemeter padrão e consequentemente, nunca será injetada uma solução com concentração menor do que esta. Assim, a faixa linear avaliada foi de 50 a 150% em relação aos 50 µg/ml de artemeter provenientes do medicamento, que no total corresponde a 375 a 425 µg/ml de artemeter.

Nos dois procedimentos adotados, curvas analíticas foram plotadas para concentração versus a área do pico para cada fármaco, e os dados obtidos foram submetidos à análise de regressão linear.

1.2.4.3.2 Precisão

A precisão intra-corrida foi avaliada por meio de seis determinações a 100% da concentração de trabalho (400 µg/ml de artemeter e 300 µg/ml de lumefantrina). As soluções amostra para a análise foram preparadas conforme procedimento descrito no

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item 1.2.4.2. O lote 04137 de Coartem® foi empregado nas análises. Para avaliação da precisão inter-corridas, o mesmo procedimento foi adotado, realizando-se análises em dois dias consecutivos. Os teores de artemeter e lumefantrina e o desvio padrão relativo (DPR) dos valores foram determinados.

1.2.4.3.3 Exatidão

A exatidão do método desenvolvido foi avaliada pelo método do placebo contaminado, no qual quantidades conhecidas de artemeter SQR e lumefantrina SQR foram adicionadas a uma mistura dos excipientes do comprimido. A composição deste placebo está descrita no item 1.2.3.3.3.

O procedimento mais usual para realização do método do placebo contaminado é o preparo de soluções estoque concentradas dos fármacos, seguida da transferência de volumes determinados destas soluções para balões volumétricos contendo a mistura de excipientes, de forma a obter soluções de trabalho com excipientes, em três concentrações diferentes. Entretanto, no presente método analítico, o ponto crítico do preparo da amostra é a solubilização da lumefantrina no clorofórmio. Assim, o preparo de uma solução concentrada com diluições subseqüentes não seria adequado para avaliar o processo de solubilização na concentração determinada para a análise do medicamento. Desta forma, foi realizada uma pesagem de fármaco para o preparo de cada solução, em triplicata. As massas pesadas de placebo, artemeter e lumefantrina, assim como os três níveis de concentração avaliados na exatidão, estão descritos na Tabela 10.

Tabela 10 – Massas pesadas e concentrações das soluções para avaliação da exatidão do método por CLAE para quantificação simultânea de artemeter e lumefantrina.

% correspondente Massa do placebo (mg) Massa de artemeter (mg) Massa de lumefantrina (mg) Concentração teórica (µg/ml) 75 65 75 56,25 300 ATM + 225 LMF 100 65 100 75 400 ATM + 300 LMF 125 65 125 93,75 500 ATM + 375 LMF

ATM = artemeter, LMF = lumefantrina

A massa de placebo pesada (65 mg) foi determinada de acordo com a proporção de excipientes originalmente presente nos comprimidos. As massas estabelecidas na Tabela 10 foram exatamente pesadas e transferidas para balão volumétrico de 50 ml. Adicionaram-se 2,5 ml de clorofórmio e submeteu-se a banho de ultra-som por 3 minutos.

O volume foi ajustado com acetonitrila, a solução foi homogeneizada e filtrada. Em seguida, 10 ml do filtrado foram transferidos para balão volumétrico de 50 ml e o volume foi ajustado com fase móvel, de modo a obter as concentrações teóricas demonstradas na Tabela 10. Cada solução foi preparada em triplicata.

As porcentagens de recuperação e o desvio padrão relativo (DPR) foram determinados em cada nível.

1.2.4.3.4 Seletividade

A seletividade do método por CLAE foi determinada pela avaliação da pureza espectral dos picos de artemeter e lumefantrina obtidos em cromatogramas de soluções padrão e amostra, com auxílio do detector DAD. Além disso, foram injetadas soluções contendo apenas mistura de excipientes dos comprimidos, preparada pelo mesmo procedimento, com o objetivo de avaliar possíveis picos interferentes no cromatograma, com o mesmo tempo de retenção dos picos de interesse.

1.2.4.3.5 Robustez

Seis soluções amostras foram preparadas de acordo com o procedimento descrito em 1.2.4.2 e analisadas nas condições nominais e variando-se os parâmetros analíticos: proporção de acetonitrila na fase móvel, pH aparente, fluxo da fase móvel e temperatura da coluna. As variações estabelecidas para cada parâmetro estão demonstradas na Tabela 11.

Tabela 11 – Parâmetros analíticos e variações empregadas para avaliação da robustez do método analítico por CLAE para quantificação simultânea de artemeter e lumefantrina.

Parâmetro Variação Valor inferior Valor nominal Valor superior Proporção de acetonitrila na FM (%) ± 2,0 58 60 62 pH aparente da FM ± 0,2 2,15 2,35 2,55 Fluxo da FM (ml/min) ± 0,2 0,8 1,0 1,2 Temperatura da coluna (°C) ± 5 25 30 35 FM = fase móvel

Em cada condição, os teores de artemeter e lumefantrina foram determinados e os parâmetros cromatográficos tempo de retenção (tr), fator de cauda (T) e resolução (R)

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entre os picos de artemeter e lumefantrina foram avaliados. Os teores dos fármacos obtidos nas condições nominais e nas condições variadas foram estatisticamente comparados por meio de análise de variância (ANOVA).

1.2.4.3.6 Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação de artemeter e lumefantrina foram inicialmente estimados a partir da equação que leva em consideração parâmetros da curva analítica, apresentada no item 1.2.3.3.5.

A partir dos valores encontrados, foram preparadas oito soluções diluídas contendo artemeter e lumefantrina, na mesma proporção da concentração de trabalho. As concentrações das soluções variaram de 0,13 μg/ml de artemeter e 0,10 μg/ml de lumefantrina a 15,00 μg/ml de artemeter e 11,25 μg/ml de lumefantrina. Para determinação dos limites, a razão entre a altura do sinal e a altura do ruído da linha de base foi avaliada, considerando-se S/R = 3 para o limite de detecção e S/R = 10 para o limite de quantificação. Além disso, o desvio padrão relativo das áreas dos picos obtidos com replicatas de injeções de soluções diluídas também foi avaliado para determinação do limite de quantificação.

1.2.4.4 Quantificação de artemeter e lumefantrina em comprimidos de dose fixa