Validação dos métodos cromatográfico e espectrofotométrico

Os métodos por CLAE e UV, após otimização, foram validados segundo os procedimentos recomendados pela Resolução RDC 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA e o Guia de Validação de Procedimentos Analíticos ICH (1996).

1.2.3.3.1 Linearidade

Foram preparadas, em triplicata, soluções padrão estoque de lumefantrina a 300 µg/ml, em metanol. A partir de cada solução estoque, foram feitas diluições para cinco diferentes concentrações, conforme Tabela 4.

Para as análises cromatográficas, empregou-se fase móvel como solvente nas diluições e, para as análises espectrofotométricas, metanol foi utilizado. A concentração de trabalho (100%) otimizada para ambos os métodos foi 24 µg/ml e o intervalo estabelecido para avaliação da linearidade foi 50 a 150%, que corresponde à faixa de concentração de 12 a 36 µg/ml.

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Tabela 4 – Soluções diluídas para construção de curva analítica e avaliação da linearidade dos métodos cromatográfico e espectrofotométrico para quantificação de lumefantrina.

Intervalo linear (%) Volume da solução estoque (ml) Fase móvel ou metanol q.s.p (ml) Concentração final (µg/ml) 50 2 50 12 75 3 50 18 100 4 50 24 125 5 50 30 150 6 50 36

Curvas analíticas foram plotadas para concentração de lumefantrina versus a área do pico ou absorvância, e os dados obtidos foram submetidos à análise de regressão linear.

1.2.3.3.2 Precisão

A precisão intra-corrida foi avaliada por meio de seis determinações a 100% da concentração de trabalho (24 µg/ml). As soluções de lumefantrina para a análise foram preparadas conforme descrito em 1.2.3.2. Para avaliação da precisão inter-corridas, o mesmo procedimento foi adotado, realizando-se análises em dois dias consecutivos. A precisão dos métodos foi avaliada para amostras de lumefantrina em matérias-primas e em comprimidos. Além dos métodos por CLAE e UV, a precisão do método por titulação em meio não aquoso também foi avaliada. Para cada método, o teor de lumefantrina e o desvio padrão relativo (DPR) foram determinados.

1.2.3.3.3 Exatidão

A exatidão dos métodos desenvolvidos foi avaliada pelo método do placebo contaminado, no qual quantidades conhecidas de lumefantrina SQR foram adicionadas a uma mistura dos excipientes do comprimido. Essa mistura foi preparada de acordo com os excipientes citados na bula do medicamento (Coartem®) e as proporções de cada um foram estimadas segundo referências da literatura (KIBBE, 2000). A relação dos excipientes empregados com suas respectivas proporções está demonstrada na Tabela 5.

Tabela 5 – Relação dos excipientes e suas respectivas proporções para preparo de formulação e avaliação da exatidão dos métodos cromatográfico e espectrofotométrico.

Excipiente Concentração na formulação (%)

Celulose microcristalina 81,5%

Hidroxipropilmetil celulose 5,0%

Croscarmelose sódica 5,0%

Estearato de magnésio 5,0%

Polisorbato 80 3,0%

Dióxido de sílica coloidal (aerosil) 0,5%

Foram preparadas, em triplicata, soluções padrão estoque de lumefantrina a 300 µg/ml, em metanol. Cada solução estoque foi diluída para três diferentes concentrações (18, 24 e 30 μg/ml), em balão volumétrico de 50 ml, contendo 50 mg da formulação dos excipientes. As soluções foram submetidas a banho de ultra-som por três minutos, o volume foi ajustado e as soluções filtradas. Para as análises cromatográficas, empregou- se fase móvel como solvente e, para as análises espectrofotométricas, metanol foi utilizado. A porcentagem de recuperação e o desvio padrão relativo (DPR) foram determinados para cada método.

1.2.3.3.4 Seletividade

A seletividade do método cromatográfico foi determinada pela avaliação da pureza espectral dos picos de lumefantrina obtidos em cromatogramas de soluções padrão e amostra, com auxílio do detector DAD. Além disso, foram injetadas soluções contendo apenas mistura de excipientes dos comprimidos, preparada pelo mesmo procedimento, com o objetivo de avaliar possíveis picos interferentes no cromatograma, com o mesmo tempo de retenção do pico de interesse. Para as análises espectrofotométricas, foi obtido o espectro de uma solução contendo apenas a formulação dos excipientes do comprimido em metanol, na faixa de 200 a 400 nm, para avaliar a presença de bandas de absorção interferentes em 335 nm.

1.2.3.3.5 Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção e quantificação foram inicialmente estimados a partir da equação que leva em consideração parâmetros da curva analítica:

Materiais e métodos - 39 - LD = 3 x DPa LQ = 3 x DPa b b onde: LD = limite de detecção LQ = limite de quantificação

Dpa = desvio padrão do intercepto da curva de regressão b = inclinação da curva analítica

A partir dos valores encontrados, foram preparadas soluções diluídas de lumefantrina, em concentrações decrescentes, na faixa de 0,40 a 0,01 μg/ml. Para o método cromatográfico, a avaliação dos limites de detecção e quantificação foi realizada por meio da determinação da razão entre a altura do sinal e a altura do ruído da linha de base. Os limites de detecção e quantificação foram definidos como as concentrações para as quais se obteve relação sinal/ruído de 3 e 10, respectivamente.

Para a determinação dos limites do método espectrofotométrico, foi realizada a avaliação dos valores de absorvância e dos espectros no ultravioleta de soluções de lumefantrina diluídas. Além disso, o desvio padrão relativo de leituras de absorvância das soluções diluídas foram calculados.

1.2.3.3.6 Robustez

Para determinar a robustez de métodos analíticos, pode-se recorrer ao teste de Youden. Trata-se de um teste que permite não apenas avaliar a robustez do método, como também ordenar a influência de cada um dos parâmetros analíticos nos resultados finais. A idéia principal do teste não é avaliar a alteração de um parâmetro individualmente, mas introduzir várias alterações nas condições analíticas ao mesmo tempo, de maneira que o efeito de cada alteração individual possa ser avaliado no final (YOUDEN & STEINER, 1975; INMETRO, 2003).

No teste de Youden, sete parâmetros analíticos são selecionados para avaliação e oito ensaios são realizados para determinar a influência dos mesmos no resultado final. Os ensaios são realizados com as condições analíticas em seu valor nominal (representado por letras maiúsculas) e com uma pequena variação (letras minúsculas). Os sete parâmetros analíticos estabelecidos para avaliação da robustez do método

cromatográfico para quantificação de lumefantrina, assim como as variações introduzidas nestes parâmetros, estão representados na Tabela 6.

Tabela 6 – Parâmetros analíticos e variações para avaliação da robustez do método cromatográfico para quantificação de lumefantrina.

Parâmetro Nominal Variação

A/a Proporção de metanol na fase móvel 80% - A 77% - a

B/b pH aparente da fase móvel 2,8 - B 3,1 - b

C/c Temperatura da coluna 30 °C - C 35 °C - c

D/d Fluxo da fase móvel 1,0 - D 1,2 - d

E/e Marca da coluna Symmetry - E Ace - e

F/f Marca do metanol Tedia - F J.T. Baker - f

G/g Modelo do cromatógrafo Agilent 1200 - G HP 1100 - g

Os sete parâmetros e suas respectivas variações foram combinados em oito ensaios ou corridas cromatográficas, realizados em ordem aleatória. Dos oito ensaios realizados, quatro deles foram realizados com cada parâmetro em seu valor nominal e quatro deles com o parâmetro com variação. A Tabela 7 demonstra a série de combinações fatoriais dos parâmetros para execução do teste de Youden. Os resultados das análises são representados por letras de s a z.

Tabela 7 – Matriz de combinação fatorial dos parâmetros analíticos para avaliação da robustez pelo teste de Youden. Combinação fatorial Parâmetro analítico 1 2 3 4 5 6 7 8 Proporção de metanol A A A A a a a a pH aparente B B b b B B b b Temperatura da coluna C c C c C c C c

Fluxo da fase móvel D D d d d d D D

Marca da coluna E e E e e E e E

Marca do metanol F f f F F f f F

Modelo do cromatógrafo G g g G g G G g

Resultado s t u v w x y z

Em cada combinação, foram realizadas três injeções da solução amostra da matéria-prima e três da solução padrão de lumefantrina, na concentração de trabalho (24

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µg/ml). Após troca da coluna cromatográfica ou alteração dos solventes da fase móvel, foram aguardados 30 minutos para estabilização do sistema.

Para determinar a influência da variação de cada parâmetro no resultado final, deve-se comparar a média dos quatro valores correspondentes às letras maiúsculas com a média dos quatro valores correspondentes às letras minúsculas. Por exemplo, para avaliar o efeito da temperatura da coluna no resultado final da análise, pode-se utilizar a equação:

Efeito C/c = s + u + w + y - t + v + x + z

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Assim, a influência dos sete parâmetros analíticos em relação à área, tempo de retenção (tr), fator de cauda (T), número de pratos teóricos (N) e teor de lumefantrina foram avaliados. Por meio do teste de Youden, pode-se estabelecer com clareza quais parâmetros apresentam maior influência nos resultados finais da análise e fazer um controle mais rigoroso das eventuais variações destes parâmetros que podem ocorrer durante uma análise de rotina.