Métodos analíticos e bioanalíticos para quantificação de artemeter e lumefantrina

Até o início do presente trabalho, não foram encontrados artigos publicados ou monografias oficiais que apresentassem métodos para quantificação simultânea de artemeter e lumefantrina em produtos farmacêuticos, como comprimidos de dose fixa combinada. Na literatura científica, não há estudos para quantificação de lumefantrina em produtos farmacêuticos e apenas poucos artigos estão disponíveis para quantificação de artemeter em matéria-prima ou produto acabado.

A Farmacopéia Internacional 4ª edição (THE INTERNATIONAL, 2006) apresenta monografias de artemeter matéria-prima, comprimidos e solução injetável. Os métodos de doseamento para estes produtos são cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção na região do ultravioleta (216 nm), e um método alternativo, em que artemeter é submetido à hidrólise ácida, seguida da leitura em espectrofotômetro, em 254 nm. O método cromatográfico descrito é relativamente simples, entretanto, devido à baixa absortividade de artemeter na região do

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ultravioleta, a concentração de trabalho é consideravelmente alta (10 mg/ml), o que implica em elevado gasto de substância química de referência e amostras para realização do doseamento. O método alternativo por espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta após hidrólise ácida, apesar de ser mais barato, é demorado, laborioso e nem sempre reprodutível.

GREEN et al. (2001) realizaram a identificação de artemeter, artesunato e diidroartemisinina em comprimidos utilizando reações colorimétricas. O método descrito é simples, podendo ser aplicado em laboratórios com poucos recursos financeiros, porém, é limitado a análises qualitativas ou semi-quantitativas dos fármacos. DEBNATH et al. (2006) quantificaram artemeter em formulações farmacêuticas por meio de polarografia de pulso diferencial, devido à capacidade de artemeter de sofrer reação de redução. O método foi devidamente validado e aplicado com sucesso à quantificação de artemeter em comprimidos e cápsulas. Entretanto, a técnica utilizada é pouco comum e poucos laboratórios dispõem de polarógrafos para realização destas análises.

Em dois trabalhos recentes, a quantificação de artemeter em produtos farmacêuticos foi realizada por CLAE com detecção UV, a 215 nm. ATEMNKENG et al. (2007a) realizaram a determinação de antimaláricos derivados da artemisinina em medicamentos utilizados no Quênia e Congo. Dos 24 medicamentos analisados, apenas 15 (62,5%) cumpriram com as especificações de teor preconizadas pela Farmacopéia Européia (95 a 105% do valor rotulado), além de terem sido verificados problemas relativos à falsificação e qualidade inadequada dos medicamentos. ATEMNKENG et al. (2007b) quantificaram artemeter, metilparabeno e propilparabeno em pó para suspensão oral pediátrica. Devido à grande diferença nas concentrações de trabalho dos três analitos, artemeter não foi quantificado simultaneamente com os parabenos.

Alguns métodos bioanalíticos para quantificação de artemeter ou lumefantrina isoladamente, no plasma, são descritos na literatura. Os métodos de extração e as condições cromatográficas destes métodos, obtidos em diferentes referências da literatura, estão demonstrados na Tabela 2.

Todos os métodos de extração disponíveis para análise de artemeter se baseiam em extração líquido-líquido. Os solventes extratores mais utilizados foram, geralmente, misturas de dois ou três solventes orgânicos, contendo isooctano, 1- clorobutano, diclorometano, metil-t-butil éter, cloreto de n-butila ou acetato de etila. Alguns autores (NAVARATNAM et al.,1995; SANDRENAN et al., 1997; SOUPPART

et al., 2002) utilizaram solução saturada de cloreto de sódio para evitar a formação de emulsão durante a extração. Em todos os estudos, após agitação com o solvente extrator, a amostra foi centrifugada para separação das fases, a fase orgânica foi evaporada e o resíduo suspenso em solventes adequados para injeção no cromatógrafo. Para a lumefantrina, foram citadas extrações líquido-líquido e em fase sólida no preparo da amostra. Os solventes extratores para extração líquido-líquido utilizados foram mistura de ácido acético glacial e acetato de etila (1:100) (ZENG et al., 1996), hexano e dietil éter (70:30) (MANSOR et al., 1996) e ácido acético glacial e hexano (WAHAJUDDIN et al., 2009). LINDEGARDH et al. (2005) avaliaram várias condições para extração em fase sólida de lumefantrina e otimizaram um método para extração e quantificação deste fármaco. ANNERBERG et al. (2005), do mesmo grupo de pesquisa de LINDEGARDH, utilizaram o método de extração em fase sólida otimizado para determinação de lumefantrina em plasma.

É interessante observar que houve uma nítida evolução dos métodos de detecção utilizados para quantificação de artemeter em plasma ao longo dos anos. Nos artigos mais antigos (THOMAS & WARD, 1992; MUHIA et al., 1994), artemeter foi submetido a um processo de hidrólise ácida, formando um produto que apresenta absorção adequada na região do ultravioleta, permitindo a detecção a 254 nm. Este processo, no entanto, é relativamente trabalhoso, com muitas variáveis e pouco reprodutível, como testado em laboratório.

Todos os trabalhos consultados publicados entre 1995 e 1998 (NAVARATNAM et al.,1995; KARBWANG et al., 1997a; SANDRENAN et al., 1997; VAN AGTMAEL et al., 1998) para quantificação de artemeter em plasma empregaram detecção eletroquímica, utilizando a capacidade de artemeter de sofrer redução devido à presença de anel peróxido em sua estrutura. Como a maioria das reações de oxi-redução são pH específicas, todos os autores mencionados utilizaram fase móvel com pH 5,0.

Nos artigos mais recentes, o método de escolha para detecção de artemeter foi espectrometria de massas. Como a molécula de artemeter não possui funções ácidas ou básicas e apresenta baixa polaridade, SOUPPART et al. (2002) e SHI et al. (2006) utilizaram ionização química a pressão atmosférica (APCI) como fonte de ionização. XING et al. (2006) utilizaram fase móvel contendo tampão acetato de amônio 10 mM, levando à formação de um aduto entre artemeter e amônia e permitindo a quantificação do íon precursor de artemeter [M+NH4]+ com a fonte de

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artemeter no modo positivo, no qual a molécula do fármaco recebe um próton (ou NH4+), ficando carregada positivamente.

Pode-se observar, ainda, uma tendência em relação ao tipo de coluna das análises, de acordo com a detecção empregada. Os mesmos autores que utilizaram detecção na região do ultravioleta e por espectrometria de massas empregaram colunas C18, enquanto nos trabalhos com detecção eletroquímica, a coluna de

escolha foi ciano. Para utilização do detector eletroquímico, há uma clara limitação em relação à proporção de solvente orgânico na fase móvel, que deve ser constituída majoritariamente de eletrólitos, ou seja, elevada proporção de solvente aquoso acidificado ou tampões. Este fator aumenta de forma significativa o tempo de retenção e alargamento dos picos dos analitos. Tendo em vista que coluna ciano é menos retensiva para artemeter comparando-se com C18, uma provável explicação

para a tendência observada seria que a utilização de coluna ciano compensaria, em parte, o aumento no tempo de retenção dos analitos provocada pela alta proporção de solvente aquoso na fase móvel.

Nos trabalhos consultados para lumefantrina, colunas C18 e ciano foram

utilizadas com sucesso pelos autores. Para quantificação em plasma, a maioria dos autores utilizou detecção na região do ultravioleta como método de escolha. O comprimento de onda selecionado (335 nm) é bastante seletivo em relação a possíveis interferentes. Além disso, lumefantrina apresenta alta absortividade molar nesta região, permitindo, assim, uma detecção seletiva e sensível na região do ultravioleta. No trabalho de WAHAJUDDIN et al. (2009), os autores utilizaram espectrometria de massas como método de detecção, com fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo positivo. É interessante observar que este trabalho é recente e a coluna empregada apresenta comprimento (3 cm) e tamanho de partículas (3,5 µm) reduzidos. Este fato demonstra a clara tendência na área de cromatografia para análise de medicamentos em trabalhar-se com colunas pequenas e com menor tamanho de partículas, de forma a manter ou aumentar a eficiência e a resolução cromatográfica, consumindo menos solventes e com tempo de corrida menor.

HODEL et al. (2009) desenvolveram um método por LC-MS/MS para detecção simultânea de quatorze antimaláricos em plasma humano, entre eles artemeter e lumefantrina. Para extração, os autores utilizaram um procedimento de precipitação de proteínas, seguido de evaporação do sobrenadante e reconstituição

do resíduo em fase móvel. A detecção no espectrômetro de massas foi realizada com fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo positivo.

Com exceção de ZENG et al. (1996), todos os autores utilizaram acetonitrila como solvente orgânico da fase móvel. Eluição isocrática foi empregada em todos os estudos, com o fluxo da fase móvel de 0,5 a 2,0 ml/min e tempo total de eluição variando entre 5 e 20 minutos.

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Tabela 2 – Métodos de extração e condições cromatográficas para quantificação de artemeter e lumefantrina em plasma, isoladamente.

Referência Fármaco Método de extração Fase móvel Coluna Fluxo

(ml/min)

Tempo de

eluição (min) Detecção

THOMAS & WARD

(1992) Artemeter Extração líquido-líquido Acetonitrila:água (50:50) C18, 100 x 4,6 mm, 5 μm 0,7 20

Ultravioleta (254 nm), após

hidrólise ácida

MUHIA et al. (1994) Artemeter Extração líquido-líquido Acetonitrila:água (60:40) C18, 250 x 4,6 mm, 5 μm 2,0 6

Ultravioleta (254 nm), após

hidrólise ácida

NAVARATNAM et al.

(1995) Artemeter Extração líquido-líquido

Acetonitrila:ácido acético 0,05 mol/L (15:85), pH 5,0

Ciano, 250 x 4 mm, 5 μm,

a 30°C 1,5 20 Eletroquímica

KARBWANG et al.

(1997a) Artemeter Extração líquido-líquido

Acetonitrila:ácido acético 0,1 mol/L (20:80), pH 5,0

Ciano, 150 x 3,9 mm,

10 μm 1,2 15 Eletroquímica

SANDRENAN et al.

(1997) Artemeter Extração líquido-líquido

Acetonitrila:tampão acetato 0,1 M, pH 5,0 (15:85)

Ciano, 150 x 3,9 mm,

4 μm, 35 °C 1,0 15 Eletroquímica

VAN AGTMAEL et al.

(1998) Artemeter Extração líquido-líquido

Acetonitrila:tampão acetato 100 mM, pH 5,0 (40:60)

Ciano, 300 x 4,6 mm,

10 μm, 30 °C 1,0 20 Eletroquímica SOUPPART et al.

(2002) Artemeter Extração líquido-líquido

Acetonitrila:ácido acético 0,1% (66:34) C18, 150 x 4,6 mm, 5 μm, temp. amb. 1,0 14 Espectrometria de massas – APCI+

SHI et al. (2006) Artemeter Extração líquido-líquido Acetonitrila:ácido fórmico 0,1%

(80:20) C18, 150 x 4,6 mm, 5 μm, 25 °C 1,0 6 Espectrometria de massas – APCI+

Tabela 2 (Continuação)

Referência Fármaco Método de extração Fase móvel Coluna Fluxo

(ml/min)

Tempo de

eluição (min) Detecção

XING et al. (2006) Artemeter Extração líquido-líquido Acetonitrila:tampão acetato de amônio 10 mM (85:15) C18, 150 x 4,6 mm, 5 μm, 20 °C 0,8 6 Espectrometria de massas – ESI+

MANSOR et al. (1996) Lumefantrina Extração líquido-líquido Acetonitrila:acetato de amônio 0,1 M (90:10), pH 4,9

C18, 250 x 4,6 mm, 10 μm,

temp. amb. 1,5 20

Ultravioleta (335 nm)

ZENG et al. (1996) Lumefantrina Extração líquido-líquido Metanol:água:ác acético

:dietilamina (93:6:1:0,03) C18, 150 x 4,6 mm, 5 μm 1,0 15

Ultravioleta (335 nm)

LINDEGARDH et al.

(2005) Lumefantrina Extração em fase sólida

Acetonitrila:tampão fosfato 0,1M, pH 2,0 (55:45) Ciano, 250 x 4,6 mm, 25 °C 1,2 20 Ultravioleta (335 nm) ANNERBERG et al.

(2005) Lumefantrina Extração em fase sólida

Acetonitrila:tampão fosfato 0,1M, pH 2,0 (55:45) Ciano, 250 x 4,6 mm, 25 °C 1,2 12 Ultravioleta (335 nm) WAHAJUDDIN et al.

(2009) Lumefantrina Extração líquido-líquido

Acetonitrila:metanol:tampão acetato de amônio 0,01 M, pH 5,5 (45:45:10) C18, 30 x 2,1 mm, 3,5 μm 0,5 5 Espectrometria de massas – ESI+

Objetivos - 29 -

3 OBJETIVOS