Assinalamento das cadeias laterais

Os núcleos das cadeias laterais alifáticas da proteína ClpS foram assinalados através da coleta e análise de quatro experimentos: 3D de 1H-15N HSQC-TOCSY, 3D HCCH-COSY, 3D HCCH-TOCSY e 2D 1H-13C-HSQC. Os espectros foram adquiridos de acordo com os métodos descritos em 3.3.3.4 usando uma amostra da proteína ClpS duplamente marcada.

Inicialmente foi analisado o espectro 3D de 1H-15N HSQC-TOCSY que fornece conectividades via ligação química entre o grupo amídico (i.e. núcleos 1HN e 15N), o hidrogênio alfa (1Hα) da cadeia principal e os restantes núcleos de hidrogênio da cadeia lateral de um dado amino ácido possibilitando assim o assinalamento de todos os prótons alifáticos do amino ácido em estudo. A Figura 34 mostra fatias selecionadas do espectro 1H-15N TOCSY-HSQC de ClpS ilustrando o assinalamento dos núcleos de hidrogênio dos resíduos 68 a 77.

Apesar de na teoria ser possível assinalar todos os núcleos de hidrogênio alifáticos das cadeias laterais analisando apenas espectro 1H-15N HSQC-TOCSY, em proteínas maiores nem sempre isso é possível. Assim, o assinalamento das ressonâncias de hidrogênio das cadeias laterais alifáticas da proteína ClpS foi complementado pela análise dos espectros 3D HCCH-COSY e 3D HCCH-TOCSY. Estes experimentos possibilitam a dispersão dos espectros 2D 1H-1H COSY ou TOCSY em uma terceira dimensão correspondente à freqüência do 13C facilitando a atribuição das ressonâncias dos núcleos de carbono e de hidrogênio das cadeias laterais alifáticas.

A Figura 35 mostra regiões selecionadas do espectro de HCCH-TOCSY da proteína ClpS, mostrando o assinalamento das ressonâncias da cadeia lateral do resíduo V75.

Figura 34. Fatias selecionadas do espectro 1

H-15N TOCSY-HSQC de ClpS ilustrando o assinalamento dos prótons alifáticos dos resíduos 68 a 77.

Figura 35. Regiões selecionadas de fatias de 13

C do espectro de HCCH-TOCSY da proteína ClpS. Em cada fatia são mostrados os deslocamentos químicos de 13C correspondentes. As linhas vermelhas indicam as correlações existentes entre os prótons da cadeia lateral do resíduo V75. O assinalamento de cada ressonância está indicado no próprio espectro.

Figura 36. Espectro de 1

H-13C HSQC da proteína ClpS da região dos núcleos alifáticos.

As regiões dos diferentes deslocamentos químicos dos picos de correlação dos núcleos Cα, Cβ, C e Cδ estão indicadas no espectro.

Uma vez assinaladas as ressonâncias dos núcleos de 1H e 13C, os sistemas de spins das cadeias laterais alifaláticas foram conectados com as ressonâncias de

1

HN e 15N da cadeia principal da proteína via a correlação 1HN-15N-1Hα observada no espectro 3D 1H-15N HSQC-TOCSY. Usando esta metodologia, aproximadamente 90% das cadeias laterais alifáticas de ClpS foram atribuídas com sucesso (vide Apêndice I para maiores detalhes).

O assinalamento não-ambíguo das ressonâncias das cadeias laterais alifáticas de ClpS foi confirmado através do assinalamento de cada um dos picos

observados no espectro H- C HSQC, que ilustra as correlações entre todos os núcleos de hidrogênio e de carbono da proteína. A Figura 36 mostra o espectro 1H-

13

C HSQC da proteína ClpS das regiões dos núcleos alifáticos. É interessante notar que os deslocamentos químicos observados para cada par de núcleos CH depende estão relacionados com a posição em que estes núcleos se encontram nas cadeias laterais. Assim, picos cruzados de C -H e Cδ-Hδ geralmente apresentam deslocamentos químicos deslocados para regiões de campo baixo tanto na dimensão 1H como de 13C. Já picos cruzados de Cα-Hα e Cβ-Hβ aparecem no espectro em regiões de campo mais alto.

O assinalamento das ressonâncias de hidrogênio das cadeias laterais aromáticas de ClpS seria realizado através da análise dos espectros 3D 1H-13C NOESY-CHSQC e 2D 1H-13C HSQC. No entanto, conforme descrito anteriormente, durante o assinalamento desta proteína, dois grupos independentes determinaram a estrutura cristalográfica da proteína ClpS de E. coli (GUO et al., 2002a; ZETH et al., 2002), cuja seqüência é muito semelhante à seqüência da proteína ClpS de Xac.

Assim, estas publicações redirecionaram os objetivos deste trabalho, que originalmente visavam a determinação da estrutura tridimensional da proteína ClpS de Xac por RMN, para a obtenção de informações que complementassem os dos dados obtidos por GUO e colaboradores (2002a) e ZETH e colaboradores (2002) em seus estudos por cristalografia. Nestes novos estudos, o assinalamento das cadeias laterais aromáticas de ClpS de Xac não seria fundamental. Assim, foi decidido abandonar o assinalamento das cadeias laterais aromáticas de ClpS de Xac e focalizar em outros estudos por RMN desta proteína.

O assinalamento das ressonâncias dos núcleos da cadeia principal e das cadeias foi depositado no Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) sob o número de acesso BMRB ID 15448 (Fonte: www.bmrb.wisc.edu/, 2007).

3.4.3.4. Identificação dos elementos de estrutura secundária

Uma vez obtido o assinalamento seqüencial de todos os amino ácidos presentes na molécula tem-se acesso imediato a informação estrutural que possibilita a identificação dos elementos de estrutura secundária presentes na proteína em estudo antes mesmo da determinação da estrutura tridimensional da mesma.

Inicialmente, o conteúdo de estrutura secundária da proteína ClpS foi predito usando o método de cálculo de “Chemical Shift Index (CSI)” descrito por WISHART, e colaboradores (1992) que faz uso dos valores de deslocamento químico obtidos experimentalmente para cada um dos núcleos da cadeia principal.

Conforme descrito anteriormente, o CSI ou índice de deslocamento químico, é a diferença entre os valores de deslocamento químico obtidos experimentalmente a partir do assinalamento seqüencial da proteína e os valores de deslocamento químico médios para uma conformação randômica. As regiões da proteína que apresentam diferenças negativas para 1Hα e 13Cβ e, positivas para 13Cα, indicam a presença de uma conformação em α-hélice. Já as regiões da proteína que apresentam diferenças negativas para 1Hα e 13Cβ e, positivas para 13Cα indicam a presença de uma conformação de fita β. Nas regiões em que o índice de deslocamento químico está próximo de zero provavelmente não existe estrutura secundária regular.

Figura 37. “Chemical Shift Index” calculado para a proteína ClpS de Xac.

A seqüência primária da proteína está representada no topo da figura. Abaixo estão indicadas as diferenças de deslocamento químico dos núcleos 1Hα, 13Cα, 13Cβ, respectivamente, para cada aminoácido de ClpS. Vermelho indica diferença positiva e azul, negativa. Em cinza encontram-se as diferenças não sigificativas (traço com bola) ou ressonâncias não assinaladas (traço sem bola) Os elementos de estrutura secundária estão representados por setas (fita-β) e hélices (α-hélices).

Figura 38. Comparação da estrutura secundária da proteína ClpS de E.coli com a estrutura secundária predita para a proteína ClpS de Xac. Os elementos de estrutura secundária estão

A Figura 37 apresenta o “Chemical Shift Index” (CSI) calculado e a estrutura secundária estimada para a seqüência da proteína ClpS de Xac. De acordo com os resultados obtidos, a proteína ClpS de Xac apresenta os seguintes elementos de estrutura secundária: 2 fitas β (resíduos 27 a 34 e 101 a 104) e 3 α-hélices (resíduos 41 a 53, 55 a 67 e 78 a 97).

É interessante notar que a região que compreende os resíduos 70 a 77 da proteína ClpS de Xac parece apresentar o que seria uma região de fita β apenas interrompida pelos valores discrepantes obtidos para o resíduo C73. De fato, analisando a estrutura secundária da proteína ClpS de E.coli (DOUGAN et al., 2002a) observa-se a presença de uma fita β na região compreendida entre os resíduos 70 a 77 (Figura 38). Especificamente esta fita apresenta um “kink” ou pequena dobradura na posição do resíduo C73. Assim, dado o elevado grau de similaridade entre as seqüências das duas proteínas, é de esperar que a proteína ClpS de Xac também apresente estrutura secundária semelhante nesta região.

As estruturas secundárias regulares presentes na proteína ClpS de Xac foram também identificadas através das constantes de acoplamento de escalar 3JHNHα

obtidas experimentalmente e dos respectivos ângulos diedros. As constantes de acoplamento escalar 3JHNHα foram obtidas através da análise do experimento 3D de

dupla ressonância HNHA (VUISTER e BAX, 1993). Neste espectro, observam-se dois picos para cada resíduo de amino ácido. Na diagonal do espectro observa-se o pico de correlação dos núcleos HN e N equivalente ao pico de correlação observado no experimento 2D 1H-15N-HSQC. Observa-se ainda um pico cruzado que corresponde à correlação dos núcleos Hα, HN e N. Uma vez assinalados todos os picos do espectro, a constante 3JHNHαpara cada resíduo de amino ácido foi calculada

usando a equação abaixo que relaciona esta constante às intensidades do pico cruzado (IX) e do pico da diagonal (ID) (KUBONIWA e col, 1994).

IX/ID = -tan2 (2πξ JHNHα) [Equação 8]

em que ξ se refere à soma dos dois períodos t1 e t2 em que 3JHNHα evolui, que

neste caso foram t1 = 0.0075 e t2 = 0.0125 s respectivamente.

Desta forma, o valor da constante de acoplamento 3JHNHαfoi calculado para 82

dos 106 resíduos de amino ácidos da proteína ClpS. Como seria de esperar, não foi possível obter valores de 3JHNHα para a metionina N-terminal, para os sete resíduos

de prolina, nem para os resíduos T38 e L100 cujas ressonâncias dos núcleos HN não foram assinaladas. Além disso, também não foi possível quantificar esta constante para os resíduos N4,T5, H9, H11, D35, Y37, M40, V44, M62, S77, R78, S92 e L99 uma vez que os respectivos picos não puderam ser identificados no espectro HNHA devido à ocorrência de sobreposição espectral ou baixa intensidade do sinal.

Conforme descrito anteriormente, segmentos de três ou mais resíduos de amino ácidos consecutivos que apresentam valores de 3JHNHα < 6,0 Hz indicam um

região de α-hélice. Os mesmos segmentos com valores de 3JHNHα > 8,0 Hz indicam

conformação em fita-β (WÜTHRICH, 1986). Assim, como pode ser visto na Figura 39, os elementos de estrutura secundária da proteína ClpS identificados por este método correspondem essencialmente aqueles anteriormente preditos pelo método de CSI.