Ativação de Micróglia, MAGs e seu papel em gliomas

Correspondendo à até 40% dos componentes do microambiente do glioma, a micróglia residente e os MAGs respondem prontamente aos estímulos provenientes das células tumorais. Historicamente, classifica-se a resposta (ativação) sofrida por essas células em clássica e alternativa (69–71). A ativação clássica corresponde ao fenótipo pró-inflamatório (M1), caracterizada pela liberação de iNOS (inducible nitric oxide synthase), citocinas inflamatórias como TNF-α (tumor necrosis fator alpha) e IL1- (interleukin 1 beta) e radicais livres. Já o fenótipo anti-inflamatório, característico da reparação tecidual, é representado pela ativação alternativa (M2), na qual há aumento de expressão de ARG-1 (arginase 1), de marcadores de superfície como CD163 e a liberação de fatores de transcrição como TGF- (transforming growth factor beta) e HGF (hepatocyte growth factor). A citocina interferon (IFN)- , bem como produtos microbianos induzem a ativação clássica, enquanto que a ativação tipo M2 pode ser induzida por IL-4 (interleukin 4) ou pelo próprio TGF- . Devido ao dinamismo com o qual micróglia e MAGs respondem a estímulos, existe muita controvérsia na polarização M1 e M2. No entanto, essa subdivisão é ainda amplamente usada e corresponde a alterações clínicas (72–75). A Figura 6 ilustra as ativações clássica e alternativa usando a micróglia como exemplo.

Estudos demonstram que os macrófagos associados a tumores favorecem o crescimento tumoral tanto por mecanismos unicamente imunológicos como não-imunológicos; e que a maioria deles assume um fenótipo do tipo M2 (76_{–78). O mesmo é verdade para a micróglia e os MAGs (79). Os} fatores secretados nesse tipo de ativação promovem, por exemplo, o aumento da angiogênese tumoral (80,81), da motilidade das células do glioma e da invasão (82) e também interagem com as células-tronco tumorais aumentando sua capacidade proliferativa e resistência terapêutica (83–85).

Como exposto acima, existe vasta literatura e diversas evidências do papel exercido pela micróglia em gliomas. Porém, a grande maioria dos estudos é feita em camundongos, sendo que a existência de marcadores específicos para diferenciar a micróglia dos MAGs facilita os estudos específicos de cada população, algo que não ocorre em humanos (Figura 7). Outro aspecto que prejudica a extrapolação dos resultados de estudos murinos para os humanos é o fato de que os gliomas murinos pouco se assemelham aos gliomas humanos no que diz respeito a sua origem histológica (se astrocítica ou oligodendrocítica)

Figura 6: Ativação da micróglia. Ao ser confrontada por estímulos, sejam eles

patológicos ou fisiológicos, a micróglia ativada responde com mudanças morfológicas, retraindo suas ramificações, e com a produção de uma série de fatores que são estímulo-dependentes. A polarização M1 e M2 é usada para caracterizar respostas pró- e anti-inflamatórias, respectivamente, cada qual com um efeito diferente no organismo. Adaptado de Nakagawa & Chiba, 2014 (75). Em gliomas, acredita-se que a micróglia e os MAGs apresentem um fenótipo M2. LPS, lipopolissacarídeo; CCL2/22, C-C motif chemokine ligand 2; TREM2,

e alterações moleculares (86). Os diferentes subtipos moleculares de glioblastoma, por exemplo, comportam-se clinicamente de maneira variada (87_– 89), podendo interagir de forma diversa com o microambiente . Além disso, avaliar a expressão dos marcadores de ativação da micróglia necessita de comparação com a população controle. No caso dos humanos, as amostras disponíveis para obter-se uma população pura de micróglia provêm, na grande maioria das vezes, de cirurgias de epilepsia. A micróglia associada à epilepsia possui um status inflamatório intrínseco que a distancia do fenótipo quiescente da micróglia normal (90,91). A utilização de amostras de tecido cerebral post-

mortem é prejudicada pela falta de protocolos específicos e eficientes para o

isolamento de uma população pura para a micróglia.

Figura 7: Diferenças entre a micróglia e MAGs em gliomas. Estudos murinos

revelaram diferença na ontogenia desses grupos de células. Porém, no microambiente tumoral e em razão dos estímulos advindos das células tumorais, micróglia e MAGs compartilham muitas das proteínas de superfície, dificultando a obtenção de populações puras. Em humanos, essa diferenciação é ainda mais difícil. Adaptado de Hambardzumyan & Berger, 2015 (31).

Tendo em vista esses aspectos ainda não explorados do campo das associações entre a micróglia e os gliomas, e nossa recente colaboração com o laboratório do Dr Bart J. L. Eggen, nós nos propusemos a estudar a ativação da micróglia em gliomas de diferentes graus, origens e subtipos (GBMs). Iremos também propor um perfil de expressão gênica da micróglia humana adulta, levando em conta diferenças de idade e de gênero, que servirá para a identificação e diferenciação dessas células em estudos futuros.

2. OBJETIVOS

O principal objetivo deste estudo colaborativo entre a Universidade de Groningen e a Faculdade de Medicina da USP consiste em estudar o papel da ativação da micróglia em gliomas humanos e delinear o perfil da expressão genica da micróglia humana.

Os objetivos específicos são:

I. Analisar o fenótipo de ativação da micróglia (M1/M2) em gliomas de diferentes graus e origens histológicas (astrocitomas e oligodendrogliomas);

II. Análise da associação dos fenótipos de ativação da micróglia com os subtipos moleculares de glioblastomas humanos (Proneural, Clássico e Mesenquimal);

III. Geração do perfil de expressão gênica da micróglia humana proveniente de tecido post-mortem por meio de comparação com o tecido cerebral total;

IV. Comparação dos achados dessa assinatura microglial humana com a assinatura encontrada em dados prévios da literatura referentes à micróglia murina;

V. Associação dos dados de expressão da micróglia com variáveis como tempo post-mortem, idade e gênero;

VI. Comparar o perfil de expressão gênica da micróglia com o perfil de monócitos e macrófagos previamente estabelecido na literatura e com amostras de micróglia isolada de tumores;

VII. Implementação das tecnologias transferidas por ambos os centros envolvidos nesse estudo

Em suma, os experimentos visaram estabelecer o fenótipo da micróglia associado ao tumor em gliomas de alto e baixo grau, dessa forma permitindo correlações com suas características patológicas e moleculares, e aprofundar o conhecimento do perfil de expressão da micróglia humana normal, ainda deficiente na literatura atual, por meio de metodologias de sequenciamento de alta performance.

3. METODOLOGIA