Correlações do tipo pairwise dos dados de expressão do RNA-seq de micróglia pura e de córtex foram calculados e hierarquicamente clusterizados, com as variáveis tipo de tecido (micróglia ou córtex), idade, gênero, PMD e origem das amostras (Brasil ou Holanda), como mostra a Figura 15. A micróglia humana e o córtex clusterizaram de forma claramente distinta, com altos níveis de correlação entre as amostras de cada grupo.
Análises de expressão gênica diferencial mostraram grande diversidade entre a micróglia e o córtex total (Figura 15). Baseando-se em critérios altamente
Figura 14: Sequenciamento do mRNA da micróglia isolada e do córtex
correspondente. Genes previamente identificados como específicos da micróglia
encontram-se altamente expressos na população purificada (roxo). Genes característicos de neurônios, astrócitos e oligodendrócitos apresentaram alta expressão nas amostras de córtex (preto). O marcador de células imunes da periferia, CCR2, apresentou baixa expressão em micróglia.
rigorosos, dois perfis de expressão de micróglia foram definidos: uma assinatura estendida da micróglia, contendo 1765 genes contidos nos critérios de logFC >3 e q< 1E-4; e assinatura restrita de expressão gênica da micróglia, contendo 328 genes com logFC >5 e q < 1E-25, sendo que apenas os transcritos com mais de 50% de abundância foram incluídos.
Detalhamentos sobre os dados de expressão gênica, como símbolo do gene e descrição, logFC e valores de FDR encontram-se na tabela intitulada Tabela
Figura 15: Análise de clustering da correlação dos valores de RNA-seq entre
amostras. Pode-se observar que as amostras isoladas de micróglia são muito
parecidas entre si, e muito diferentes do tecido cerebral total (córtex). Variáveis como idade, gênero e intervalo post-mortem (PMD) não mostraram um clustering claro, enquanto que o país de origem das amostras dividiu as amostras (Brasil e Holanda).
Suplementar 2, que pode ser acessada através do link: http://tinyurl.com/tabelas- suplementares
Genes da assinatura restrita de expressão da micróglia foram classificados como “vermelhos” no heat map da Figura 16, genes da assinatura estendida da micróglia como “azuis”, genes menos expressos em micróglia e cuja diferença entre micróglia e córtex foi menos significante foram classificados como “azul escuro”; quando não houve diferença tanto na abundância de expressão ou na comparação entre os dois grupos, o grupo de genes foi classificado como “preto”.
Para determinar a sobreposição de expressão gênica da micróglia entre aqueles genes expressos em humanos e em camundongos, o transcriptoma da micróglia foi comparado a dados de expressão de micróglia murina (102–104). Os genes expressos pela micróglia de camundongo foram pareados com os dados da expressão diferencial da micróglia humana no heat map da Figura 16, indicados por barras pretas.
Figura 16: Heat map de expressão de genes microgliais, do córtex e da micróglia
murina. Análise do transcriptoma da micrógli e sua comparação com o córtex
mostrou diferenças marcantes. A assinatura restrita da micróglia (vermelho), compreende aqueles genes com maior expressão nessa comparação. Genes altamente expressos também se encontram na assinatura estendida da micróglia (azul). Em preto, os genes que não apresentaram diferença nessa comparação. Abaixo, os genes correspondentes da micróglia de camundongos (dos trabalhos de Butovsky (2013), Zhang (2014) e Hickman (2013) são indicados por barras pretas.
Muitos dos genes previamente identificados por esses estudos murinos encaixaram-se no nosso grupo da assinatura estendida da micróglia, indicando que existe sim uma sobreposição entre os genes de micróglia expressos tanto por humanos quanto por camundongos. É interessante notar que diversos dos genes previamente identificados como específicos da micróglia murina apresentaram baixa ou não significante expressão quando comparamos aos expressos em micróglia humana e no córtex, sugerindo diferenças espécie- específicas na expressão gênica da micróglia.
Os 328 genes da assinatura restrita de expressão gênica da micróglia humana encontram-se ilustrados no heat map da Figura 17. Estão incluídos nessa assinatura diversos genes previamente identificados, como CX3CR1,
TYROBP, TREM2, P2RY12, CSF1R, e CD33. Os dados da micróglia murina
também encontram-se ilustrados nesse heat map e pode-se observar grande sobreposição entre os dois conjuntos de dados. No entanto, a assinatura de expressão gênica da micróglia humana também continha genes não identificados nos estudos murinos. Estão incluídos nessa categoria: genes da família Toll Like Receptors, TLR5 e TLR10; o fator de transcrição IRF7; as imunoglobulinas do tipo lectina SIGLEC7, SIGLEC8, SIGLEC9, SIGLEC10; as metaloproteinases MMP14, ADAM28; os receptores do tipo Fc FCGR1A/1B,
FCGR2A (CD32), FCGR2C, FCGR3A (CD16); e os reguladores de
As vias associadas aos 2093 genes do da assinatura estendida da micróglia, juntamente com a assinatura restrita, foram determinadas usando a análise de enriquecimento IPA (Ingenuity Pathway Analysis). Esse perfil da micróglia mostrou enriquecimento para vias de sinalização imune incluindo “sinalização da via TREM1”; “formação de fagossomo”; “vias de apresentação de antígeno”; “sinalização da via IL10”; “sinalização da via IL4”; “sinalização da via TLR”; “reconhecimento de padrões”; e “produção de espécies reativas de oxigênio em macrófagos” (Figura 18). Esses dados demonstram que as células microgliais são imunocompetentes e fagócitos especializados, que expressam uma gama diversa de receptores e ligantes imunes, equipadas para responder a uma grande variedade de patógenos e padrões moleculares associados a danos. O perfil de expressão diferencial entre genes expressos em micróglia e córtex de algumas famílias com função imune encontra-se na Figura 19.
Figura 17: Heat map de expressão comparando os genes da assinatura restrita
da micróglia humana com a assinatura murina. Os 328 genes da assinatura da
micróglia humna foram ordenados em ordem alfabética e, ao lado, estão os genes encontrados pelos estudos murinos de Zhang (verde), Butovsky (azul) e Hickman (rosa). O preto indica a falta de correspondência entre amostras humanas e de camundongos.
Figura 18: Análise de vias associadas aos genes da assinatura da expressão
gênica da micróglia humana. Gráfico gerado com a ferramenta de análise Ingenuity Pathway Analysis, Qiagen.
Um mapa de interação de proteínas de alta confiabilidade, ordenado de acordo com a localização intracelular dessas proteínas (espaço extracelular, membrana plasmática, citoplasma e núcleo) foi gerado utilizando os genes da assinatura restrita de expressão da micróglia (Figura 20). A grande maioria das proteínas encontra-se associada à membrana plasmática, realçando o papel de reconhecimento de padrões (pattern recognition) da micróglia. Já no núcleo, encontram-se fatores de transcrição previamente identificados, essenciais para a ontogenia da micróglia, como SPI-1 e IRF8; mas também fatores ainda não descritos como parte do funcionamento dessas células, como IRF5, IRF7, CIITA,
Figura 19: Genes de diversas famílias imunes na comparação de expressão
NFKB2 e NFATC2. Esses achados demonstram que a assinatura da micróglia
humana contém diversos novos genes específicos que podem ser usados como marcadores da micróglia, bem como para apontar diferenças entre espécies.
Figura 20: Rede de interação proteica dos genes pertencentes à assinatura
restrita da micróglia humana. Mapa preditivo onde quatro compartimentos
celulares são mostrados (espaço extracelular, membrana plasmática, citoplasma e núcleo.
4.8. Efeito do tempo post-mortem (PMD), gênero e idade na