No tecido cerebral de indivíduos com esclerose múltipla, o local onde se encontram as lesões demielinizantes está repleto de micróglia e macrófagos (119). Reações de imunofluorescência foram feitas em tecido de pacientes com esclerose múltipla contendo essas lesões para validar os marcadores específicos de micróglia e MO/MA. Utilizamos um anticorpo específico para IBA1 para identificar micróglia e houve sobreposição parcial com os marcadores CD16 e CD32 (Figura 28). O infiltrado mielóide foi identificado com anticorpo específico para CD36 (C) e não houve co-marcação com células marcados com IBA1.
Figura 28: Marcadores específicos da micróglia humana e macrófagos
infiltrados. Criocortes de tecido de esclerose múltipla. Setas indicam a micróglia
que expressa IBA1 e CD32 (A) ou CD16 (B), e triângulos indicam macrófagos que expressam CD36 (C), mas não IBA1. Barra de escala de 25µm, 40x.
Em amostras seriais de GBM, a presença de infiltrado mielóide foi verificada por imunohistoquímica. Foi escolhida uma região rica em necroses e formação vascular, como mostra a coloração com hematoxilina e eosina na Figura 29 (A). Utilizamos um anticorpo para CD68 (Figura 29 (B)), normalmente usado para identificar macrófagos, como controle. Tanto CD36 quanto CD143 (ACE) tiveram uma marcação parecida à marcação de CD68, ainda que não em todas as células, reforçando a ideia de marcadores diferenciais.
Foi efetuado o RNA-seq de 6 amostras de micróglia proveniente de gliomas (n=2 AGII, n=1 AGIII e n=3 GBM). Os dados resultantes dessa análise foram compilados e analisados comparativamente à micróglia de autópsia. Os resultados dessa análise são por demais extensos e complexos, e requerem
Figura 29: Cortes seriais de uma amostra representativa de GBM. Foi escolhida
uma região com formação angiogênica e necrose (A). B) Células positivas para CD68, usado como marcador de macrófagos. Ambos os novos marcadores encontrados nesse estudo, CD36 (C) e CD143 (D) mostraram uma marcação similar, porém não igual, à de CD68. Barra de escala de 10 µm. Imagens em aumento de 40x e detalhes em aumento de 20x.
ainda uma série de validações experimentais. No entanto, pudemos observar que os marcadores escolhidos como específicos da micróglia (CD16 e CD32) mantiveram expressão constante nas amostras tumorais, independente do grau do tumor, e sem diferença estatística quando comparada a micróglia NN, como mostra a Figura 29.
Foi possível obter amostra de infiltrado inflamatório mielóide de apenas uma amostra tumoral (MTU-1, um GBM). Por essa razão, não foi possível realizar análises estatísticas na comparação com a micróglia normal ou tumoral. Porém, a fim de complementar as análises feitas anteriormente sobre os marcadores específicos do infiltrado, plotamos os dados em um gráfico para comparação (Figura 30). Ainda que a micróglia tumoral apresente uma pequena elevação na expressão tanto de CD36 quando de CD143 (ACE), esse aumento não é significativo estatisticamente. Fica claro, no entanto, que os macrófagos apresentam uma expressão muito mais elevada do que a micróglia. Uma casuística maior de macrófagos/monócitos provenientes de gliomas ou de outro tecido contendo infiltrado inflamatório mielóide se faz necessária para a confirmação desses dados. Entretanto, podemos inferir que os marcadores escolhidos são eficientes na diferenciação da micróglia de outros leucócitos infiltrados.
Figura 30: Análise preliminar da comparação do transcriptoma da micróglia
humana de glioma e de autópsia. Os marcadores identificados como específicos
da micróglia normal (CD32 e CD16) foram verificados na micróglia tumoral e foi observado que estes mantêm-se estáveis. Já os marcadores específicos de macrófagos infiltrados (CD36 e CD143 – ACE) encontram-se muito elevados na amostra de macrófagos de glioma que obtivemos, enquanto que na micróglia tumoral eles se mantiveram baixos. Tu uglia, micróglia tumoral.
Em suma, essas análises reforçam a ideia de que a micróglia é unicamente adaptada ao SNC, e novos marcadores que diferenciam a micróglia do infiltrado mielóide são apresentados.
5. DISCUSSÃO
Nosso estudo apresenta o perfil de ativação da micróglia em gliomas humanos de diferentes graus e em GBMs de diferentes subtipos, ao mesmo tempo que explora os marcadores específicos da micróglia humana, ainda inédito na literatura atual e crucial para o estudo do microambiente de tumores cerebrais.
O estudo da micróglia em gliomas esbarra em dois pontos cruciais. O primeiro, a falta de uma população controle adequada como forma de comparação, levando em consideração possíveis diferenças de idade e gênero dos indivíduos, além do fato de que a maioria dos estudos utiliza amostras provenientes de cirurgia de epilepsia, com alterações inflamatórias inerentes à doença (90,91). O segundo ponto seria a falta de marcadores específicos que diferenciem a micróglia humana residente e as células mielóides infiltradas. Este estudo apresentou uma extensa coleção de amostras para identificar o perfil do transcriptoma da micróglia humana, tanto em indivíduos cognitivamente normais como em tumores. Ao mesmo tempo, foi feita a comparação dessa micróglia normal com dados previamente publicados da micróglia de camundongo. Camundongos são frequentemente usados para estudar micróglia, inclusive em gliomas; no entanto, existe grande debate sobre a validade desse modelo animal e de sua correspondência com a condição humana.
Os pontos abordados nesse estudo foram: 1) qual o perfil de ativação da micróglia em gliomas humanos? 2) qual o perfil de ativação da micróglia em glioblastomas de acordo com sua subclasse molecular? 3) qual o perfil de expressão da micróglia normal e como ele se compara ao perfil da micróglia murina? 4) quais alterações ocorrem na micróglia ao longo do envelhecimento? 5) existe diferença na micróglia de homens e mulheres? 6) é possível identificar marcadores que diferenciem a micróglia humana residente de células mielóides infiltradas?
5.1. O perfil de ativação da micróglia/macrófagos em