Avaliação citotóxica e imunomodulatória

A partir das análises de citotoxicidade e capacidade imunomodulatória dos peptídeos e do Ca(OH)2, foi eleita a concentração de 128 µg.mL-1 para o

teste de todas as amostras em cultura de células RAW 264.7. Tal concentração foi baseada em um valor que favoreça o investimento biotecnológico do uso dos PAMs na terapia endodôntica. Em adição, diversos estudos utilizam da concentração máxima de 128 µg.mL-1 _{para a execução de testes de peptídeos}

antimicrobianos com potencial biotecnológico (SAIMAN et al., 2001; STRANDBERG, 2007; LIU et al., 2012; FENG et al., 2013).

Os experimentos com cultura de monócitos (precursores de osteoclastos), linhagem celular RAW 264.7, foram conduzidos a partir de grupos que se assemelham a um modelo de infecção experimental in vitro. Os monócitos estão presentes nas infecções pulpo perirradiculares, participando principalmente da resposta imune inata (TEIXEIRA-SALUM et al., 2010). A

presença da citocina pró inflamatória, IFN-γ, e dos antígenos microbianos mortos pelo calor aproximam os resultados de uma realidade. Semelhante ao processo infeccioso e inflamatório em ambiente intra e perirradicular, estes estímulos potencializam a resposta celular de acordo com os tratamentos.

Nestas condições, a avaliação da citotoxicidade dos PAMs e do Ca(OH)2

constituiu da análise a partir dos ensaios de viabilidade celular conduzidos pelo ensaio colorimétrico MTT (Sigma Chemicals Co., St. Louis, EUA). Tal método se baseia na capacidade das células vivas de reduzirem o sal 3-(4,5-di- metilazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium brometo no produto formazan (VAN DE LOOSDRECHT et al., 1991). Consistindo o MTT da avaliação da atividade da enzima desidrogenase mitocondrial, a quantidade de produto é detectado via leitura por absorbância, aumentando a precisão dos resultados.

A definição da citotoxicidade de um material constitui uma das avaliações quanto a sua biocompatibilidade. A biocompatibilidade de um material é refletida como o desempenho eficiente e não prejudicial ao hospedeiro, induzindo uma resposta vantajosa e apropriada durante o seu uso clínico. Portanto, a citotoxicidade é definida como a capacidade de afetar a viabilidade celular, determinada por lise celular ou inibição de seu crescimento, abordando somente este aspecto da biocompatibilidade (PETERS, 2013).

Durante o tratamento endodôntico, almeja-se também o reparo tecidual no ambiente perirradicular. Um efeito pouco citotóxico das amostras testadas, quando em ambiente infeccioso e inflamado, pode favorecer a reorganização celular e, consequentemente, um processo de reparo (SCHUURS et al., 2000). Portanto, materiais que apresentam pouca ou nenhuma citotoxicidade são favoráveis quanto ao reparo, nestas situações. Nesta análise, foi considerada citotóxica a amostra capaz de reduzir a viabilidade celular em relação ao controle positivo (células RAW na ausência dos peptídeos e do Ca(OH)2).

Devido à resposta imuno inflamatória pulpar e perirradicular ter a participação de diversas proteínas que respondem à infecção e corroboram para o desenvolvimento da lesão perirradicular, foram eleitas algumas citocinas para a análise da atuação dos peptídeos e do Ca(OH)2 neste modelo de

infecção in vitro. As citocinas MCP-1, TNF-α, IL-12, IL-6, IL-1α e IL-10, além do NO foram analisados por participarem ativamente na resposta do hospedeiro

frente a infecção, atuando nas respostas antimicrobiana, inflamatória e no processo de reabsorção óssea perirradicular.

Estudo avaliou a expressão de citocinas envolvidas no desenvolvimento de lesões perirradiculares inoculadas com Fusobacterium nucleatum e

Peptostreptococcus prevotii. Com 7 dias de infecção por F. nucleatum, modelo

de resposta aguda, a expressão de IFN-γ foi aumentada em relação aos demais grupos (infecção por P. prevotii e dupla-infecção). Com 14 dias da mesma infecção, modelo de resposta crônica, a expressão de IFN-γ foi diminuída e a expressão de TNF-α, IL-10 e TGF-β foi aumentada. No modelo de dupla infecção, a expressão de TGF-β foi aumentada com 7 e 14 dias. Também com 14 dias, ocorreu a diminuição da expressão de RANKL e IL-10. A expressão de IL-4 não apresentou diferenças entre os tempos e grupos. Tais resultados demonstraram a resposta imune distinta de acordo com infecções mono e polimicrobianas. Em adição, a expressão das citocinas IFN-γ e IL-10 foi inversamente proporcional. Assim, IFN-γ e TNF-α apresentaram expressões aumentadas em diferentes períodos de análise e diminuídas ao tempo que TGF-β demonstrou expressão aumentada. Observou-se também a diminuição na expressão de IL-10 e TGF-β em dupla-infecção (MACIEL et al., 2012).

A partir do infiltrado inflamatório, tem-se que o IFN-γ aumenta a produção de IL-1 e TNF-α. Em consequência, a IL-1 possui um feedback que estimula maior produção de IL-1. Dessa forma, a diminuição de IL-1β pode se dar pela redução de IFN-γ, além da redução do seu feedback, independente da produção de TNF-α. A redução de IFN-γ, IL-1β e RANKL ocorre a partir da redução da carga bacteriana. Em seguida, o aumento de IL-10 condiz com a diminuição de citocinas pró inflamatórias, no qual seu papel supressor nesse processo é evidente em lesões peirradiculares (BRITO et al., 2012).

Em outro estudo, foi demonstrado que a máxima inibição de TNF-α com anticorpos bloqueou em até 60% a atividade osteoclastogênica via indução bacteriana. No entanto, a inibição de RANKL bloqueou esta mesma atividade em até 70%. Isto sugere a participação de outros mediadores no processo de reabsorção óssea ainda na ausência de RANKL (JIANG et al., 2002).

A resposta a uma infecção pode ser caracterizada pelo recrutamento de células inflamatórias com liberação de citocinas pró e anti-inflamatórias. A resposta inflamatória de sítios perirradiculares pode ser caracterizada pela

presença das citocinas IL-2, IL-12, TNF-α e IFN-γ (perfil Th1) ou IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 (perfil Th2). Existem evidências que a resposta tipo Th1 pode ser predominante em granulomas e Th2 em lesões crônicas (JANKOVIC et al., 2001; SILVA et al., 2005). As citocinas TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-17, produzidas por macrófagos e células T induziram a produção de RANKL por osteoblastos em modelo de artrite reumatoide. Nesta ocasião, as citocinas IL-1, IL-6, IL-17 e TGF-β induzem a osteoclastogênse, enquanto IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18 e IFN-γ inibem a osteoclastogênse (SCHETT, 2008; KITAURA et al., 2013).

Ressalta-se ainda que, em patologias pulpo perirradiculares, as células apresentadoras de antígeno ativam as respostas de células Th1, Th2, Th17 ou Treg (KAWASHIMA et al., 1999; FUKADA et al., 2009). A resposta Th1 está envolvida na progressão da lesão perirradicular, enquanto a resposta Th2 está envolvida no processo de cura. Ambas as respostas são moduladas por células Treg, pela IL-10 e pelo TGF-β (KAWASHIMA et al., 1999; FUKADA et al., 2009). Em suma, IL-1, TNF-α, IFN-γ, IL-6 e IL-11 induzem óxido nítrico sintase de macrófagos e RANKL, que ativa o processo de reabsorção óssea (FUKADA

et al., 2009). A citocina MCP-1 atua na diferenciação de células T efetoras,

podendo atuar na redução da produção de IL-12 por macrófagos, com consequente diminuição das respostas tipo Th1 (CHENSUE et al., 1996).

Em relação ao NO, este possui curta meia vida e não se difunde no sítio inflamatório, estando diretamente envolvido na patologia de lesões periarradiculares. Dessa forma, células mononucleares podem controlar processos imunes via produção de NO (TAKEICHI et al., 1998). O NO é produzido fisiologicamente, em baixos níveis, mediando o relaxamento dos vasos, neurotransmissão, adesão e agregação de neutrófilos. Em grandes quantidades, este é produzido frente a citocinas e produtos bacterianos, em uma função citotóxica. O NO atua na atividade pró inflamatória e na regulação do crescimento e diferenciação celular (TEIXEIRA et al., 2006). Em adição, o NO atua em funções de citotoxicidade e de regulação (MONCADA et al., 1991; BELLOWS et al., 2006).

Uma vez que as citocinas participam de processos como crescimento, diferenciação, ativação celular, bem como iniciação de inflamação, estas modulam a produção de iNOS. O NO regula a resposta imune, atua na

remodelação óssea e pode estar envolvido no dano tecidual em inflamações crônicas (TAKEICHI et al., 1998).

Relacionando os microrganismos incluídos no presente estudo, em resposta a C. albicans, os receptores toll like receptor (TLR)-2 e TLR4 reconhecem de maneira distinta as formas dessa espécie. A parede de C.

albicans é composta de quitina, glucano, manana, manoproteína, glicolipídeo.

Os receptores para C. albicans são receptor de mannose, molécula de adesão 3 intercelular célula dendrítica específica acoplada a não integrina homóloga relacionada (SIGNR1), dectina-1 e dectina-2. Foi relatado que o receptor dectina-1 reconhece β-glucanos, expresso em blastoporos de C. albicans, e este processo leva os macrófagos a expressarem intermediários reativos de oxigênio, TNF-α e COX2. O receptor dectina-1 está associado a fagocitose (GANTNER et al., 2005). Em adição, a morfologia de fungo é capaz de induzir a expressão de TLR2 e TLR4 em monócitos mononucleares. Dessa forma, TLR4 e CD4+ reconhecem manana, e TLR reconhece fosfolipomanana (JOUAULT et al., 2003; THEPYOU et al., 2013). No entanto, TLR4 não é capaz de reconhecer a hifa, devido a não expressão de β-glucanos (THEPYOU et al., 2013).

De acordo com a morfologia de fungo, estudo demonstrou que C.

albicans é capaz de induzir a expressão de TLR4 e a síntese de IL-1β e IL-6, a

partir da ligação a dectina-1. Tal resposta induziu reação inflamatória e ativação de macrófagos pela síntese de IFN-γ e aumento do NO. Nesta ocasião, blastóporos estimularam a produção de TNF-α e IFN-γ, enquanto hifas mortas são capazes de induzir menor produção de TNF-α e pouca secreção de IFN-γ (VAN DER GRAAF et al., 2005). Outro estudo reportou que camundongos knockout TLR2 tem menor susceptibilidade a doenças causadas por C. albicans devido a menor secreção de citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e redução do número de células Treg (BLASI et al., 2005).

Outro fator importante, a quitina pode ser expressa na parede externa de hifas de C. albicans após serem submetidas ao calor. Esta pode reduzir a resposta inflamatória, uma vez que a fagocitose foi reduzida. Em adição, estudo reportou a redução na produção de NO na diminuição da resposta a infecção por C. albicans. A partir da morfologia de hifa, o fungo C. albicans é capaz de se ligar à TLR2 e dectina-2, diminuindo expressão de IL-1β e IL-6.

Neste estudo, a produção de IL-10 foi aumentada (HAN et al., 2013). Em outro estudo, a expressão de IFN-γ foi reduzida, bem como as citocinas pró inflamatórias, enquanto a expressão de IL-10 foi aumentada na mudança morfogênica de C. albicans de bastóforo para hifa (FILLER, 2006).