Avaliação da pureza dos peptídeos e do Ca(OH) 2

Os PAMs foram analisados quanto a sua pureza e massa molecular utilizando MALDI-ToF, de acordo com a Tabela 4, confirmando o nível de pureza superior a 95% (Anexo 1). Os espectros de massa apresentados no anexo foram usados como referência para posteriores análises de outros lotes dos mesmos peptídeos.

Tabela 4. Sequência e massa molecular dos peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X) e LL-37, utilizados no presente estudo.

Peptídeo Sequência Massa molecular

(Da)

Cla A VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF-NH2 2667.10

Cla X FLPIIVFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF-NH2 3250.90

LL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-NH2 4493.33 A concentração de Ca(OH)2 foi analisado pela empresa Soloquímica –

Análises de Solo Ltda. que determinou solubilidade de 80% e pureza de 80%. Nesta situação, o Ca(OH)2 foi incluído ao estudo como um controle clínico,

sendo este medicamento disponibilizado comercialmente e usado na prática clínica odontológica.

6.2. Avaliação da atividade antimicrobiana dos peptídeos e Ca(OH)2

Anteriormente à avaliação da atividade antimicrobiana dos peptídeos e do Ca(OH)2, foram analisados os padrões de crescimento das cepas do fungo

C. albicans (ATCC 10231) e da bactéria E. faecalis (29212). As curvas de

crescimento de C. albicans e de E. faecalis que determinaram sua fase logarítmica estão representadas no Anexo 2. A partir da análise das curvas, o pré-inóculo do fungo foi incubado até alcançar a absorbância de 0,16 – 0,18, a 595 nm, correspondente ao meio de sua fase logarítmica. Nesta situação, as células foram usadas nos ensaios antimicrobianos, a partir do pré-inóculo. As curvas de crescimento de E. faecalis determinaram o meio de sua fase logarítmica representados pela absorbância de 0,5 – 0,65, a 595 nm. O pré-

inóculo incubado até alcançar a referida absorbância foi usado nos ensaios antimicrobianos.

A avaliação da atividade antimicrobiana dos peptídeos clavanina A, clavanina X e LL-37 e da medicação intracanal Ca(OH)2 foi realizado em

bioensaios de microrganismos altamente prevalentes em lesões endodônticas refratárias: a bactéria E. faecalis e o fungo C. albicans (SIQUEIRA et al., 2009). O ensaio modificado de inibição de crescimento por microdiluição em caldo determinou o percentual de inibição de diversas concentrações dos peptídeos e do Ca(OH)2, de acordo com o meio da fase logarítmica definida pelas curvas

de crescimento de cada microrganismo. A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada, a partir da fase log, mediante comparação da absorbância das amostras testadas em relação ao controle negativo (0% de crescimento microbiano). A ausência de diferença entre os grupos testados com o controle negativo determinou a CIM.

6.2.1. Bioensaios antifúngicos

Os bioensaios utilizando peptídeos contra C. albicans (ATCC 10231) foram incubados durante 48 h, tendo como ponto de análise a média dos ensaios que englobavam a absorbância de 0,16 – 0,18, a 595 nm, estabelecida como o meio da fase logarítmica a partir das curvas de crescimento. Tal ponto de análise culminou no tempo de 24 h da curva do bioensaio e determinou a comparação entre as absorbâncias de cada peptídeo (em suas diferentes concentrações testadas) versus os controles positivo (100% de crescimento) e negativo (0% de crescimento). As comparações permitiram estimar o percentual de inibição e avaliar diferença estatística entre as amostras testadas e os controles.

Foram consideradas CIM, as concentrações das amostras testadas que não apresentaram diferença estatística quando comparadas ao controle negativo (anfotericina B, 10 µg.mL-1_{). Desta maneira, foi observado CIM pelo}

Ca(OH)2 na concentração de 128 µg.mL-1 (1728 µM). Os peptídeos não

apresentaram CIM até a concentração de 1024 µg.mL-1 _{(<400 µM). A 128}

µg.mL-1 os peptídeos apresentaram inibição de 19% (clavanina A), 27% (clavanina X) e 0% (LL-37). Em adição, nenhuma das amostras nas

concentrações testadas apresentou atividade fungicida, comparadas ao controle positivo em inoculação em meio sólido após os bioensaios.

6.2.2. Bioensaios antibacterianos

Os bioensaios com E. faecalis (ATCC 29212) foram incubados durante 12 h, tendo como ponto de análise a média dos ensaios que englobavam a absorbância de 0,50 – 0,65, a 595 nm, estabelecida como o meio da fase logarítmica a partir das curvas de crescimento. Tal ponto de análise culminou no tempo de 10 h da curva do bioensaio e determinou a comparação entre as absorbâncias de cada peptídeo (em suas diferentes concentrações testadas)

versus os controles positivo (100% de crescimento) e negativo (0% de

crescimento). As comparações permitiram estimar o percentual de inibição e avaliar diferença estatística entre as amostras testadas e os controles.

Nestes bioensaios também foram consideradas CIM, as concentrações das amostras testadas que não apresentaram diferença estatística quando comparadas ao controle negativo (ampicilina 20 µg.mL-1). Resultados da avaliação antibacteriana determinaram as CIMs pelo Ca(OH)2 na concentração

de 1024 µg.mL-1 (13820 µM) e pelo peptídeo LL-37, na concentração de 256 µg.mL-1 (57 µM). Os peptídeos clavanina A e clavanina X não apresentaram CIM até a concentração de 1024 µg.mL-1 (>400 µM). A clavanina A foi capaz de inibir 64% com 1024 µg.mL-1 (384 µM) e a clavanina X inibiu até 21% com 1024 µg.mL-1 (315 µM). A 128 µg.mL-1 as amostras apresentaram inibição de 0% (clavanina A), 0% (clavanina X), 54% (LL-37) e 12% (Ca(OH)2). Nenhuma das

amostras nas concentrações testadas apresentou atividade fungicida, comparadas ao controle positivo em inoculação em meio sólido após os bioensaios.

6.3. Avaliação citotóxica e imunomodulatória dos peptídeos e do Ca(OH)2

Dentre as diversas concentrações testadas das amostras na avaliação antimicrobiana, a concentração de 128 µg.mL-1 foi eleita para análise de citotoxicidade e da capacidade imunomodulatória dos peptídeos e do Ca(OH)2

em cultura de células RAW 264.7. A concentração de 128 µg.mL-1 foi baseada em diversos estudos que usam esta como máxima concentração para a execução de testes de peptídeos antimicrobianos com potencial biotecnológico (SAIMAN et al., 2001; STRANDBERG, 2007; LIU et al., 2012; FENG et al., 2013).

6.3.1. Avaliação da citotoxicidade dos peptídeos e do Ca(OH)2

A avaliação da citotoxicidade das amostras em células RAW 264.7 foi dividida nos tempos inicial (6 h) e final (72 h) das análises de citotoxicidade e da capacidade imunomodulatória dos peptídeos e do Ca(OH)2. As amostras

testadas reproduziram um perfil de indução de proliferação ou citotoxicidade celular, na concentração de 128 µg.mL-1, nos diferentes períodos analisados. Em diversas condições de estímulo (rIFN-γ e antígenos mortos pelo calor), cada grupo sofreu comparações quando na presença de cada peptídeo e do Ca(OH)2. Desta forma, foi considerado um efeito citotóxico ou proliferativo, sob

as culturas, a viabilidade celular com diferença significativa em relação ao controle de cada grupo. A concentração considerada CIM de Ca(OH)2 no

bioensaio de E. faecalis, 1024 µg.mL-1, também foi testada em culturas de células RAW 264.7. No entanto, esta concentração causou a morte de todas as células nos ensaios de viabilidade (dado não apresentado). Por este motivo, este grupo foi descartado das análises subsequentes a serem descritas.

O ensaio de viabilidade celular no período de 6 h (tempo inicial) demonstrou que as clavaninas A e X, isoladamente, diminuíram a viabilidade celular, em relação ao controle (p<0,05) (Figura 6A). Todavia, a presença do rIFN-γ com os peptídeos e Ca(OH)2 não diminuiu a viabilidade celular, em

relação ao controle (p>0,05) (Figura 6B). Os antígenos também não diminuíram a viabilidade celular em relação ao controle, na presença dos peptídeos (p<0,05) (Figura 6C e D). A adição do rIFN-γ com os antígenos, na presença dos peptídeos, novamente não reduziu a viabilidade celular em relação ao controle (p>0,05) (Figura 6E e F).

Figura 7. Avaliação da citotoxicidade dos peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e do Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, em células RAW 264.7, após 6 h de incubação, pelo teste de MTT. A viabilidade celular foi representada em média e desvio padrão da absorbância a 595 nm, a partir de triplicata biológica e técnica. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-

E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura.

(A) representa as culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa as culturas na presença dos peptídeos estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam as culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam as culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalado, em cada condição testada, pelo teste ANOVA One way e pós teste de Bonferroni.

O ensaio de viabilidade celular no período de 72 h (tempo final) demonstrou a redução da viabilidade celular no grupo estimulado com clavanina X, em relação aos outros peptídeos, ao Ca(OH)2 e ao controle

(p<0,05) (Figura 7A). A presença do rIFN-γ com a clavanina X também diminuiu a viabilidade celular em relação ao controle (p<0,05) (Figura 7B). A presença de HK-C. albicans diminuiu a viabilidade dos grupos com clavanina A e clavanina X, em relação ao controle (p<0,05) (Figura 7C). A adição do rIFN-γ com HK-C. albicans na presença da LL-37 elevou a proliferação celular em relação ao controle, a clavanina X e ao Ca(OH)2 (p<0,05) (Figura 7D). A

presença de HK-E. faecalis elevou a proliferação celular do grupo com LL-37 em relação ao controle e em relação aos grupos com clavanina A e X (p<0,05) (Figura 7E). No entanto, a adição de rIFN-γ com HK-E. faecalis reduziu a viabilidade do grupo com LL-37, em relação ao controle (p<0,05) (Figura 7F).

Figura 8. Avaliação da citotoxicidade dos peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e do Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, em células RAW 264.7, após 72 h de incubação, pelo teste de MTT. A viabilidade celular foi representada em média e desvio padrão da absorbância a 595 nm, a partir de triplicata biológica e técnica. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-

E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura.

(A) representa as culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa as culturas na presença dos peptídeos estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam as culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam as culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA One way e pós teste de Bonferroni.

6.3.2. Avaliação da atividade imunomodulatória dos peptídeos e do Ca(OH)2

Os resultados da avaliação da atividade imunomodulatória foram dispostos de acordo com o período em que foram analisados, de acordo com a ordem cronológica: (1) MCP-1, dosada após 6h de incubação; (2) TNF-α, IL-12, IL-6, IL-1α, após 24 h de incubação; e (3) IL-10 e NO, após 72 h de incubação.

6.3.2.1. Dosagem de citocinas por Enzyme-Liked

Immunoabsorbent Assay (ELISA)

6.3.2.1.1. MCP-1

Os níveis de MCP-1 foram avaliados após período de 6 h de incubação. Os níveis de MCP-1 não foram aumentados na presença dos peptídeos, isoladamente, em relação aos controles (p>0,05) (Figura 8A). O Ca(OH)2 foi

capaz de estimular a produção desta citocina na presença de rIFN-γ (Figura 8B), de HK-E. faecalis (Figura 8D) e de HK-C. albicans + rIFN-γ (Figura 8E), em relação aos controles (p<0,05). Os níveis de MCP-1 não foram alterados pelos peptídeos e Ca(OH)2 na presença de HK-C. albicans (Figura 8C) e HK-E.

Figura 9. Produção de MCP-1 em células RAW 264.7, na presença de peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, após 6 h de incubação. A produção de MCP-1 foi representada em média e desvio padrão, de três réplicas biológicas e técnicas. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura. (A) representa a produção de MCP-1 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa a produção de MCP-1 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2 estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam a produção de MCP-1 de culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam a produção de MCP-1 de culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA One way e pós teste de Bonferroni.

6.3.2.1.2. TNF-α

Os níveis de TNF-α foram avaliados após período de 24 h de incubação. O Ca(OH)2 induziu a produção de TNF-α, em relação ao controle, na ausência

de estímulo (p<0,05) (Figura 9A). O rIFN-γ isoladamente não foi capaz de induzir a produção de TNF-α (p>0,05) (Figura 9B). O peptídeo LL-37 reduziu a produção de TNF-α, na presença de HK-C. albicans, em relação ao controle e a clavanina A (p<0,05) (Figura 9C). Adicionando HK-C. albicans + rIFN-γ, todos os peptídeos aumentaram a produção de TNF-α, em relação ao controle (p<0,05) (Figura 9E). O Ca(OH)2 estimulou uma maior produção e TNF-α, na

presença de HK-E. faecalis, em relação ao controle (p<0,05) (Figura 9D). Adicionando HK-E. faecalis + rIFN-γ, clavanina X e Ca(OH)2 aumentaram os

Figura 10. Produção de TNF-α em células RAW 264.7, na presença de peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, após 24 h de incubação. A produção de TNF-α foi representada em média e desvio padrão, de três réplicas biológicas e técnicas. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura. (A) representa a produção de TNF-α de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa a produção de TNF-α de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2 estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam a produção de TNF-α de culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E.

faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam a produção de TNF-α de

culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA One way e pós teste de Bonferroni.

6.3.2.1.3. IL-12

Os níveis de IL-12 foram avaliados após o período de 24 h de incubação. Os peptídeos e o Ca(OH)2 não estimularam a produção desta

citocina, isoladamente (Figura 10A), ou na presença dos antígenos, em relação aos controles (p>0,05) (Figura 10C e D). Em adição, as amostras não reduziram a produção de IL-12 na presença de rIFN-γ, em relação ao controle (p>0,05) (Figura 10B). O Ca(OH)2 aumentou a produção de IL-12 a presença

de ambos os antígenos combinados com rIFN-γ, em relação aos controles (p<0,05) (Figura 10E e F).

Figura 11. Produção de IL-12 em células RAW 264.7, na presença de peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, após 24 h de incubação. A produção de IL-12 foi representada em média e desvio padrão, de três réplicas biológicas e técnicas. De acordo com as amostras testadas, as –culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura. (A) representa a produção de IL- 12 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa a produção de IL-12 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2 estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam a produção de IL-12 de culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam a produção de IL-12 de culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA

6.3.2.1.4. IL-6

Os níveis de IL-6 também foram avaliados após o período de 24 h de incubação. O Ca(OH)2 isoladamente ou combinado com HK-C. albicans (Figura

11A e C), HK-C. albicans + rIFN-γ (Figura 11E) e HK-E. faecalis + rIFN-γ (Figura 11F) estimulou a produção de IL-6 em relação aos controles e aos peptídeos (p<0,05). O rIFN-γ estimulou a produção de IL-6 na presença de LL- 37 e Ca(OH)2, em relação ao controle e as clavaninas (p<0,05) (Figura 11B). O

antígeno HK-E. faecalis não estimulou a produção desta citocina isoladamente, em relação ao controle (p>0,05) (Figura 11D).

Figura 12. Produção de IL-6 em células RAW 264.7, na presença de peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, após 24 h de incubação. A produção de IL-6 foi representada em média e desvio padrão, de três réplicas biológicas e técnicas. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura. (A) representa a produção de IL- 6 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa a produção de IL-6 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2 estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam a produção de IL-6 de culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam a produção de IL-6 de culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA One way e pós teste de Bonferroni.

6.3.2.1.5. IL-1α

Os níveis de IL-1α foram avaliados após o período de 24 h de incubação. Os peptídeos e o Ca(OH)2 isoladamente ou combinados com HK-C.

albicans não foram capazes de estimular a produção de IL-1α, em relação ao

controle (Figura 12A e B) (p>0,05). O Ca(OH)2 estimulou a produção de IL-1α

nos grupos estimulados com rIFN-γ, HK-E. faecalis com e sem rIFN-γ e HK-C.

Figura 13. Produção de IL-1α em células RAW 264.7, na presença de peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, após 24 h de incubação. A produção de IL-1α foi representada em média e desvio padrão, de três réplicas biológicas e técnicas. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura. (A) representa a produção de IL- 1α de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa a produção de IL-1α de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2 estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam a produção de IL-1α de culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam a produção de IL-1α de culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA

6.3.2.1.6. IL-10

Os níveis de IL-10 foram avaliados após o período de 72 h de incubação. Os peptídeos e o Ca(OH)2 não estimularam a produção de IL-10

(Figura 13A), bem como o rIFN-γ combinado aos antígenos, na presença das amostras (p>0,05) (Figura 13E e F). Os peptídeos e o Ca(OH)2 não foram

diferenciais na produção de IL-10 na presença de rIFN-γ, em relação ao controle (p>0,05) (Figura 13B). No entanto, na presença de HK-C. albicans, os peptídeos e o Ca(OH)2 foram capazes de reduzir tal produção, em relação ao

controle (p<0,05) (Figura 13C). O Ca(OH)2 reduziu a produção de IL-10 na

Figura 14. Produção de IL-10 em células RAW 264.7, na presença de peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, após 72 h de incubação. A produção de IL-10 foi representada em média e desvio padrão, de três réplicas biológicas e técnicas. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células por poço em meio de cultura. (A) representa a produção de IL- 10 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (B) representa a produção de IL-10 de culturas na presença dos peptídeos e Ca(OH)2 estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam a produção de IL-10 de culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam a produção de IL-10 de culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA

6.3.2.2. Dosagem de óxido nítrico (NO)

A produção de nitrito foi avaliada após o período de 72 h de incubação, a partir do sobrenadante dos grupos mencionados na análise citotóxica. Isoladamente ou na presença do rIFN-γ, os peptídeos e o Ca(OH)2 não

induziram a produção de nitrito (p>0,05) (Figura 14A e B). Os peptídeos clavanina A e X induziram a produção de nitrito na presença de HK-C. albicans, em relação ao controle, a LL-37 e ao Ca(OH)2 (p<0,05) (Figura 14C). A adição

de HK-C. albicans e rIFN-γ causou diminuição na produção de nitrito no grupo com Ca(OH)2, em relação ao controle (p<0,05) (Figura 14E). Os peptídeos e o

Ca(OH)2 não induziram produção de nitrito na presença de HK-E. faecalis

(p>0,05) (Figura 14D). Os peptídeos e o Ca(OH)2 diminuíram a produção de

nitrito em grupos estimulados com HK-E. faecalis e rIFN-γ (p<0,05) (Figura 14F).

Figura 15. Produção de óxido nítrico em células RAW 264.7, na presença de peptídeos clavanina A (Cla A), clavanina X (Cla X), LL-37 e do Ca(OH)2 a 128 µg.mL-1, após 72 h de incubação. A produção de nitrito foi representada em média e desvio padrão, de três réplicas biológicas e técnicas. De acordo com as amostras testadas, as culturas foram estimuladas com 10U por poço de rIFN-γ e 107 UFC por poço de HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, combinados ou não, tendo como controle, 105 células.mL-1 em meio de cultura. (A) representa a produção de nitrito de culturas na presença dos peptídeos. (B) representa a produção de nitrito de culturas na presença dos peptídeos estimuladas com rIFN-γ. (C) e (D) representam a produção de nitrito de culturas estimuladas com HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. (E) e (F) representam a produção de nitrito de culturas estimuladas com rIFN-γ e HK-C. albicans ou HK-E. faecalis, na presença dos peptídeos e Ca(OH)2. *p<0,05 entre os grupos assinalados, em cada condição testada, pelo teste ANOVA One way e pós teste de Bonferroni.

6.4. Avaliação da capacidade inibitória dos peptídeos e do Ca(OH)2 na osteoclastogênese in vitro

A avaliação da capacidade inibitória dos peptídeos e do Ca(OH)2 na