AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA EM CULTURA DE

A fim de agregar informações sobre outras possíveis atividades biológicas dos enantiômeros R-(+)- e S-(–)-limoneno e R-(+)- e (–)-α-terpineol, realizou-se o teste de atividade antiproliferativa em linhagens tumorais humanas. Os gráficos gerados relacionam o crescimento celular em função da concentração das amostras testadas (Figura 22 E 23). Os valores entre 100% e 0% representam proliferação celular, sendo a linha 0% o marco para a inibição total de crescimento, ou seja, a quantidade de células ao final do experimento era a mesma do momento de adição das amostras (placa T0). Já os valores negativos representam

morte celular, pois a quantidade de células era menor do que aquela do momento de adição das amostras (placa T0) (MONKS et al., 1991).

Para análise da proliferação celular utilizou-se a sulforrodamina B (SRB), um corante protéico que se liga aos resíduos de aminoácidos básicos das proteínas de células que estavam viáveis no momento da fixação. Assim, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao compartimento, menor a atividade citotóxica da amostra em teste. O ácido tricloroacético (TCA) atua na fixação de células viáveis, pela precipitação de proteínas. Desta forma, as células viáveis se mantêm fixas na placa, enquanto células não viáveis são lavadas, o que favorece a estabilidade da placa para leitura, pois as células são primeiramente fixadas, coradas e a medida da absorbância pode ser realizada várias semanas após o término do experimento (MONKS et al., 1991; VICHAI; KIRTIKARA, 2006; HOUGHTON et al., 2007).

Os enantiômeros R-(+) e S-(–)-limoneno e R-(+)- e (–)-α-terpineol foram avaliados quanto ao potencial antiproliferativo em culturas de células tumorais humanas, nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 μg. mL-1. A doxorrubicina, utilizada como controle positivo, inibiu a proliferação de praticamente todas as linhagens de células tumorais humanas testadas (Figura 21) de forma concentração-dependente.

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 C re sc im en to C el u la r (% ) Concentração (g/mL) U251 UACC-62 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT 0,025 0,25 2,5 25 Doxorrubicina

Figura 21. Efeito antiproliferativo da Doxorrubina frente um painel de células humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT).

Para uma melhor visualização das atividades dos compostos, pode-se utilizar a curva concentração versus crescimento celular que fornece informações importantes da atividade antiproliferativa das substâncias estudadas. Com esse tipo de gráfico é possível verificar se a substância possui efeito citostático, ou seja, qual a concentração necessária da mesma para que ocorra 50% de crescimento celular (GI50), que corresponde aos pontos da

curva acima do ponto zero; ou efeito citocida (pontos da curva abaixo do ponto zero) ou inibição total do crescimento quando T=T0, ou seja, a concentração que promove 100% de

inibição celular (TGI - Total Growth Inhibition) é o valor no eixo da abscissa onde a curva corta o eixo das ordenadas.

A Figura 22 e Tabela 9 apresentam os resultados de atividade antiproliferativa do

R-(+)- e S-(–)-limoneno. Como pode ser observado, o perfil de ambos enantiômeros do

limoneno é muito semelhante, sugerindo não haver alterações na atividade em decorrência de pequenas alterações na estrutura espacial desta molécula. Na maior concentração testada (250 μg. mL-1

), ambos os enantiômeros apresentaram atividade antiproliferativa em todas as linhagens de células tumorais testadas. A linhagem de células não tumoral HaCat (Queratinócitos humano) também se mostrou sensível a ação do R-(+)- e S-(–)-limoneno (TGI: 81,0 e 71,5 μg. mL-1, respectivamente). Estes resultados sugerem um efeito proliferativo inespecífico do limoneno (efeito semelhante em todas as linhagens e na maior

TGI GI50

concentração). Neste estudo, o limoneno apresentou perfil antiproliferativo semelhante ao de Bicas et al. (2011). 10-3 10-2 10-1 100 101 102 -100 -75 -50 -25 0 25 50 75 100 C re sc im en to C el u la r (% ) Concentração (g/mL) U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT UACC-62 OVCAR-3 0,25 2,5 25 250 10-3 10-2 10-1 100 101 102 -100 -75 -50 -25 0 25 50 75 100 C re sc im en to C el u la r (% ) Concentração (g/mL) U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT UACC-62 OVCAR-3 0,25 2,5 25 250

Figura 22. Efeito antiproliferativo de S-(-)-limoneno (A) e R-(+)-limoneno (B) frente um painel de células humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT). R-(+)-limoneno S-(-)-limoneno A B Concentração (µg. mL-1) Concentração (µg. mL-1)

Por sua vez, ambos enantiômeros de α-terpineol (Figura 23) apresentaram efeito citostático promissor (GI50 < 30,0 μg. mL-1, FOUCHE et al., 2008) frente às linhagens glioma

(U251), mama (MCF7) e leucemia (K562) (Tabela 8). Das linhagens avaliadas, duas linhagens tumorais apresentaram sensibilidade diferente aos dois enantiômeros, sugerindo uma relação entre o efeito antiproliferativo e a estereoquímica das substâncias. Assim, o R- (+)-α-terpineol foi cerca de 10 vezes mais ativo (GI50 = 2,5 μg. mL-1) do que o (-)-α-terpineol

(GI50 = 26,2 μg. mL-1) frente à linhagem tumoral de próstata (PC-3), enquanto o (-)-α-

terpineol foi cerca de duas vezes mais ativo (GI50 = 21,5 μg. mL-1) do que o isômero R-(+)

(GI50 = 42,7 μg. mL-1) na inibição de células tumorais de ovário (OVCAR-03) (Tabela 8).

Adicionalmente, a linhagem HT-29 foi a mais resistente (Figura 23). Assim, de forma geral, não se observou diferenças importantes entre os produtos testados, indicando que os efeitos evidenciados não são seletivos para alguma forma enantiomérica do α-terpineol. Contrariamente, outros estudos relataram diferenças nas atividades biológicas entre os enantiômeros do monoterpenoide carvona (BUCHBAUER et al., 2005; SOUSA; NÓBREGA; ALMEIDA, 2007).

10-3 10-2 10-1 100 101 102 -100 -75 -50 -25 0 25 50 75 100 C re sc im en to C el u la r (% ) Concentração (g/mL) U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT UACC-62 OVCAR-3 0,25 2,5 25 250 10-3 10-2 10-1 100 101 102 -100 -75 -50 -25 0 25 50 75 100 C re sc im e n to C e lu la r (% ) Concentração (g/mL) U251 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 NCI-H460 PC-3 HT29 K-562 HaCaT UACC-62 OVCAR-3 0,25 2,5 25 250

Figura 23. Efeito antiproliferativo de (-)-α-terpineol (A) e R-(+)-α-terpineol (B) frente um painel de células humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT). (-)-α-terpineol R-(+)-α-terpineol A B Concentração (µg. mL-1) Concentração (µg. mL-1)

Tabela 8. Valores de GI50 (μg. mL-1) após o tratamento com R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol frente às linhagens tumorais e não

tumorais no ensaio antiproliferativo.

2 u m a 7 4 p o h k q

R-(+)-α-terpineol 28,0 75,0 27,7 46,3 41,8 76,3 2,5 42,7 >250 26,1 41,8

(-)-α-terpineol 28,0 143,2 26,7 62,4 50,6 68,6 26,2 21,5 >250 28,3 56,6 Doxorrubicina <0,025 <0,025 0,025 0,10 21,8 <0,025 <0,025 0,053 0,19 0,16 0,034

Linhagens tumorais humanas= 2 (U251, glioma); u (UACC62, melanoma); m (MCF7, mama); a (NCI-ADR/RES, ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 7 (786-0, rim); 4 (NCI-H460, pulmão tipo não pequenas células); p (PC-3, próstata); o (OVCAR-03, ovário); h (HT29, cólon); k (K562, leucemia).

Linhagem não tumoral humana = q (HaCaT, queratinócitos imortalizados).

GI50 (g. mL-1) = concentração, expressa em microgramas por mililitros, de substância necessária para reduzir em 50% a proliferação celular.

Tabela 9. Valores de TGI (μg. mL-1) após o tratamento com R-(+)-limoneno, S-(-)-limoneno, R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol frente às linhagens tumorais e não tumorais no ensaio antiproliferativo.

2 u m a 7 4 p o h k q R-(+)-limoneno 49,7 67,0 79,8 86,7 88,4 76,6 68,2 64,5 99,6 69,1 81,0 S-(-)-limoneno 56,2 83,5 62,6 62,7 71,5 84,5 59,7 63,7 97,9 84,3 71,5 R-(+)-α-terpineol 75,4 >250 121,3 >250 >250 >250 90,6 >250 >250 91,3 >250 (-)-α-terpineol 78,0 >250 90,6 >250 >250 >250 101,0 >250 >250 105,8 >250 Doxorrubicina 0,94 0,15 >25 6,6 >25 >25 0,042 1,9 9,7 7,1 0,81

Linhagens tumorais humanas= 2 (U251, glioma); u (UACC62, melanoma); m (MCF7, mama); a (NCI-ADR/RES, ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 7 (786-0, rim); 4 (NCI-H460, pulmão tipo não pequenas células); p (PC-3, próstata); o (OVCAR-03, ovário); h (HT29, cólon); k (K562, leucemia).

Linhagem não tumoral humana = q (HaCaT, queratinócitos imortalizados).

TGI (g. mL-1) = concentração, expressa em microgramas por mililitros, de substância necessária para inibir totalmente a proliferação celular.

Bicas et al. (2011) verificaram a atividade antiproliferativa α-terpineol in vitro frente a linhagens tumorais humanas. O composto estudado apresentou bom efeito inibitório para maioria das linhagens, especialmente para MCF-7 (mama) e K-562 (leucemia), e baixa atividade citostática para HT-29 (cólon), resultados semelhantes ao deste estudo. Estudos de Hayes et al. (1997) e Lampronti, Saab e Gambari (2006) também apontam atividade citostática do α-terpineol contra células K-562.

Outros terpenos tem sua atividade antiproliferativa relatados em diversos estudos. Yuri et al. (2004) mostram que o álcool perílico inibiu a proliferação celular, de forma dose- dependente, em diferentes linhagens celulares de adenocarcinoma de mama humano (KPL-1, MCF-7, MKL-F e MDA-MB-231). O α-pineno, isolado de óleo de pinho, apresentou efeito inibitório no crescimento de células BEL-7402 (carcinoma hepatocelular) de 79,3%, quando aplicado na concentração de 8,0 mg. L-1 por 72 horas (CHEN et al., 2015).

A relação entre a estrutura dos compostos terpênicos e atividade antiproliferativa não está bem elucidada. Uma das hipóteses é que a hidroxilação do limoneno a um álcool terciário (α-terpineol) poderia manter a atividade inibitória contra as linhagens tumorais (Bicas et al., 2011). Hassan et al. (2010) sugerem que o α-terpineol inibe o crescimento de células tumorais por meio de um mecanismo que envolve a inibição da via fator nuclear κB (NF-κB). O NF-κB é um fator de transcrição envolvido no controle da expressão de diversos genes ligados à resposta inflamatória, também apresentando papel fundamental em muitas etapas de iniciação e progressão do câncer (HOESEL; SCHMID, 2013)

Estes resultados estimulam a continuidade dos estudos com os enantiômeros de α- terpineol, com o objetivo de identificar os mecanismos de ação anticâncer e comprovar sua atividade em modelos experimentais de câncer in vivo para validação.

CONCLUSÃO GERAL

Em conclusão, o presente estudo apresentou os resultados obtidos da produção biotecnológica de R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, a partir da biotransformação de R-(+)- limoneno e S-(-)-limoneno, utilizando o biocatalisador Sphingobium sp. Embora a conversão de substratos em produtos não tenha sido total, a biotransformação teve uma razoável enantioseletividade. Nas condições de produção (concentração de limoneno de 350 g. L-1, agitação de 200 rpm e 28 oC), a produção de R-(+)-α-terpineol chegou a 151,0 g.L-1, com excesso enantiomérico de 94,2% da forma R, e a de S-(-)-α-terpineol chegou a 91,0 g.L-1 com um excesso enantiomérico de 31,5% da forma S. O óleo resultante da biotransformação foi purificado utilizado cromatografia em coluna aberta, resultando no completo isolamento do α- terpineol.

A pureza enantiomérica dos enantiômeros de α-terpineol obtidos neste estudo foi superior ao encontrado nos padrões comerciais, o que torna bastante interessante tecnologicamente a produção destes compostos por biotransformação, pois está relacionada à obtenção de bioaromas com características sensoriais mais atrativas e com maior valor agregado, se comparado aos produzidos por via química, e atendendo à crescente demanda do consumidor por produtos com apelo de saudabilidade.

O trabalho ainda visou à avaliação do potencial biológico dos enantiômeros R- (+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, produzidos por biotransformação. Tanto o R-(+)- como o (-)- α-terpineol apresentaram ação antiproliferativa equivalente contra três linhagens tumorais humanas (leucemia, mama, glioma), sendo o R-(+)-α-terpineol ativo para PC-3 (próstata) e o (-)-α-terpineol para OVCAR-3 (ovário).

De forma geral, não foram evidenciadas diferenças significativas nas atividades biológicas entre os enantiômeros de α-terpineol, o que pode ser inferida pela presença de R- (+)-α-terpineol (33,9%) no (-)-α-terpineol. Porém, alguns resultados merecem destaque: diminuição dos níveis de TNF-α nos animais dos grupos suplementados com (-)-α-terpineol e de IL-1β em ambos os enantiômeros, impacto positivo sobre a peroxidação lipídica e nos níveis séricos de ALT, além de efeito protetor sobre a resistência à insulina e contra o acúmulo de gordura no tecido hepático, induzida por dieta hiperlipídica em ratos em ambos os enantiomêros.

Entretanto, é importante enfatizar que possíveis efeitos adversos também foram evidenciados. Em particular, o aumento do peso relativo dos rins e nos níveis séricos de colesterol (total e LDL) nos grupos tratados com (-)-α-terpineol, tendência à piora na

tolerância à glicose nos grupos tratados com α-terpineol e o aumento na enzima AST para o grupo S100 despertaram atenção. Sendo assim, é preciso que a indicação de administração de α-terpineol para a melhora dos fatores associados à obesidade seja vista com cautela.

Este estudo apresentou algumas limitações quanto ao protocolo experimental dos ensaios in vivo em modelos de obesidade induzidos por dieta hiperlipídica, destacando o elevado teor de gordura das dietas hiperlipídicas (60% do valor calórico total), a falta de avaliação da glicemia dos animais fora do jejum e na escolha do tempo de indução da obesidade, pois uma indução eficiente da obesidade pode necessitar de períodos de tempo maiores. Reajustes nestes procedimentos seriam recomendados em trabalhos futuros envolvendo em modelos de obesidade com utilização dos enantiômeros de α-terpineol.

Esta tese abre caminhos para que outros estudos sejam desenvolvidos sobre o potencial funcional dos enantiômeros de α-terpineol, ratificando a sua utilização como estratégia nutricional na prevenção e combate ao desenvolvimento de células tumorais, dano oxidativo, obesidade, resistência à insulina e esteatose hepática. Sendo assim, novas pesquisas com o α-terpineol devem ser encorajadas; por exemplo, a avaliação in vivo em outros modelos experimentais, o estudo do impacto perceptivo/sensorial destes enantiômeros em humanos e animais e na sua aplicação em produtos alimentícios.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABRAHÃO, M. R. E.; MOLINA, G.; PASTORE, G. M. Endophytes: Recent developments in biotechnology and the potential for flavor production. Food Research International, v. 52, p.367-372, 2013.

ADAMS, A. S.; BOONE C. K.; BOHLMANN, J.; RAFFA, K. F. Responses of bark beetle- associated bacteria to host monoterpenes and their relation-ship to insect life histories. Journal of Chemical Ecology, v. 37, p. 808–817, 2011.

ADAMS, A.; DEMYTTENAERE, J.C.R.; DE KIMPE, N. Biotransformation of (R)-(+)- and (S)-(-)-limonene to α-terpineol by Penicillium digitatum- investigation of the culture conditions. Food Chemistry, v. 80, p. 525-534, 2003.

AKACHA, B. N.; GARGOURI, M. Microbial and enzymatic technologies used for the production of natural aroma compounds: Synthesis, recovery modeling, and bioprocesses. Food and Bioproducts Processing, v. 94, p. 675-706, 2015.

ALEXANDER, E.; SELWYN, A.; CALITZ, C.; YACH, D.; WANG, Y. C. Obesity: Causes and Prevalence. Encyclopedia of Food and Health, p. 132-136, 2016.

ALICEWEB. Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio. Secretaria de Comércio Exterior. Sistema Aliceweb. Exportações e importações. Disponível em: http:// aliceweb.mdic.gov.br. Acesso em: 05 outubro 2017.

ALTUNKAYNAK M. E.; OZBEK E.; ALTUNKAYNAK B. Z.; CAN I.; UNAL D.; UNAL B. The effects of high-fat diet on the renal structure and morphometric parametric of kidneys in rats. Journal of Anatomy, v. 212, p. 845-852, 2008.

ANDO, K,; FUJITA, T. Metabolic syndrome and oxidative stress. Free Radical Biology & Medicine; v. 47, n. 3, p. 213-218, 2009.

ANDRADE, J. C.; DELIZA, R.; YAMADA, E. A.; FREWER, L. J.; BERAQUET, N. J.; Percepção do consumidor frente aos riscos associados aos alimentos, sua segurança e rastreabilidade. Brazilian Journal of Food Technology, v. 16, n. 3, p. 184-191, 2013.

ANDRADE, V. L. A.; REGAZZONI, L. A. A.; MOURA, M. T. R. M.; ANJOS, E. M. S.; OLIVEIRA, K. A.; PEREIRA, M. V. R.; PEREIRA, M. R. A.; AMORIM, N. R.; ISKANDA, S. M. Obesidade e microbiota intestinal. Revista de Medicina de Minas Gerais, v. 15, p. 583-589, 2015.

AOAC. Official Methods of Analysis of AOAC International. 18.ed. Gaithersburg, 2006. API, A. M.; BELSITO, D.; BHATIA, S.; BOTELHO, D.; BROWNE, D.; BRUZE, M.; BURTON JR, A.; BUSCHMANN, J.; CALOW, P.; DAGLI, M.L.; DATE, M.; DEKANT, W.; DEODHAR, C.; FRYER, A.D.; JOSHI, K.; KROMIDAS, L.; LA CAVA, S.; LALKO, J. F.; WILCOX, D. K. RIFM fragrance ingredient safety assessment, terpineol, CAS Registry Number 8000-41-7. Food and Chemical Toxicology, v. 110(1S), p. S392-S402, 2017.

ASZTEMBORSKA, M.; OCHOCKA, J. R. Chiral monoterpenoids in plants – enantioselective chromatographic analysis, and their bioactivity. Studies in Natural Products Chemistry, v. 27, p. 361-391, 2002.

BADEE, A. Z. M.; HELMY, A. S.; MORSY, N. F. S. Utilization of orange peel in the production of -terpineol by Penicillium digitatum (NRRL 1202). Food Chemistry, v. 126, p. 849–854, 2010.

BALSAN, G. A.; VIEIRA, J. L. C; OLIVEIRA, A. M.; PORTAL; V. L. Relationship between adiponectin, obesity and insulin resistance. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 61, n.1, p. 72-80, 2015.

BAOTHMAN, O. A.; ZAMZAMI, M. A.; TAHER, I.; ABUBAKER, J.; ABU-FARHA, M. The role of Gut Microbiota in the development of obesity and Diabetes. Lipids in Health and Disease; v. 15, n. 108, 2016.

BAPTISTELLA, L. H. B.; IMAMURA, P. M.; MELO, L.V.; CASTELLO,C. Preparação do (+)-α-terpineol a partir do (+)-limoneno: monoterpeno de odor agradável em um projeto para química orgânica experimental. Química Nova, v. 32, p. 1069-1071, 2009.

BARREIRO, E. J.; FERREIRA, V. F.; COSTA, P. R. R.. Substâncias enantiomericamente puras (sep): a questão dos fármacos quirais. Química nova, v. 20, p. 647-656, 1997.

BAŞER, K.H.C.; DEMIRCI, F. Chemistry of Essential Oils. In: BERGER, R.G. (ed.). Flavours and Fragrances: Chemistry, Bioprocessing and Sustainability. Springer Science & Business Media, Ch. 4, p. 75-76, 2007.

BASTIEN, M.,; POIRIER, P.; LEMIEUX, I. DESPRES, J. P. Overview of Epidemiology and Contribution of Obesity to Cardiovascular Disease. Progress in Cardiovascular Diseases, v. 4, p. 369-381, 2014.

BATHIA, S. P., LETIZIA, C. S.; API, A. M. Fragrance material review on alpha-terpineol. Food and Chemical Toxicology, v. 46 n. 11, S280-S285, 2008.

BATISTA, A. G.; SOARES, E. S.; MENDONÇA, M. C. P.; SILVA, J. K.; DIONÍSIO, A. P.; SARTORI, C. R., CRUZ-HÖFLING, M. A., MARÓSTICA JÚNIOR, M. R. Jaboticaba berry peel intake prevents insulin-resistance-induced tau phosphorylation in mice. Molecular Nutrition Food Research, v. 61, n. 10, 2017.

BAUER, K., GARBE, D., SURBURG, H. Common Fragance and Flavor Materials Preparation, Properties and Uses. 4 ed. Wiley-VCH, 293p., 2001.

BENOIT, S. C.; KEMP, C. J.; ELIAS, C. F.; ABPLANALP, W.; HERMAN, J. P.; MIGRENNE, S.; LEFEVRE, A.; CRUCIANI-GUGLIELMACCI, C.; MAGNAN, C.; YU, F.; NISWENDER, K.; IRANI, B. G.; HOLLAND, W. L.; CLEGG, D. J. Palmitic acid mediates hypothalamic insuline resistance by altering PKC-θ subcelullar localization in rodents. The Journal of Clinical investigation, v. 119, p. 2755-2589, 2009.

BERGER, R. G. Aroma Biotechnology. Springer, Berlin Heidelger New York. 1995. BERGER, R. G. Biotechnology of flavours—the next generation. Biotechnol Lett. 2009. BERGER, R. G. Biotechnology as a source of natural volatile flavours. Current Opinion in Food Science, v. 1, p. 38-43, 2015.

BERTRAM, H. C.; LARSEN, L. B.; CHEN, X.; JEPPESEN, P. B. Impact of high-fat and high-carbohydrate diets on liver metabolism studied in a rat model with a systems biology approach. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 60, n. 2, p. 676-684, 2012. BICAS, J. L.; FONTANILLE, P.; PASTORE, G. M.; LARROCHE, C. Characterization of monoterpene biotransformation in two pseudomonads. Journal of Applied Microbiology, v. 105, p. 1991-2001, 2008.

BICAS, J. L., DIONISIO, A. P., PASTORE, G. M. Bio-oxidation of terpenes: an approach for the flavor industry. Chemical Reviews, v. 109, p. 4518–4531, 2009.

BICAS, J. L.; SILVA, J. C.; DIONÍSIO, A. P.; PASTORE, G. M. – Biotechnological Production of Bioflavors and Functional Sugars. Ciência e Tecnologia de Alimentos. V. 30, p. 7-18, 2010a.

BICAS, J. L., FONTANILLE, P., PASTORE, G. M., LARROCHE, C. A bioprocess for the production of high concentrations of R-(+)-α-terpineol from R-(+)-limonene. Process Biochemistry: v. 45, p. 481–486, 2010b.

BICAS, J. L., QUADROS, C. P., NERI-NUMA, I. A., PASTORE, G. M. Integrated process for coproduction of alkaline lipase and R-(+)-α-terpineol by Fusarium oxysporum. Food Chemistry, v. 120, p. 452–456, 2010c.

BICAS, J. L.; NERI-NUMA, I. A.; RUIZ, A. L. T. G.; CARVALHO, J. E.; PASTORE, G. M. Evaluation of the antioxidant and antiproliferative potential of bioflavors. Food and Chemical Toxicology, v. 49, p. 1610-1615, 2011.

BIER, M. C. J. Produção de compostos de aroma através da biotransformação do limoneno por fermentação em estado sólido utilizando resíduo natural de laranja como substrato. Dissertação (Mestrado em Processos Biotecnológicos). Programa de Pós- Graduação em Processos Biotecnológicos. Universidade Federal do Paraná. Curitiba, 2011. BLIGH, E. G.; DYER, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology: v. 37, n. 8, p. 911-917, 1959.

BLOCH, K. Sterol molecule: structure, biosynthesis and function. Steroids, v. 57, p. 378-383, 1992.

BOITARD, C.; CAVAROC, A.; SAUVANT, J.; AUBERT, A.; CASTANON, N.; LAYE, S., et al. Impairment of hippocampal-dependent memory induced by juvenile high-fat diet intake is associated with enhanced hippocampal inflammation in rats. Brain, Behavior and Immunity, v. 40, p. 9–17, 2014.

BONORA, E.; MOGHETTI P.; ZANCANARO, C.; CIGOLINI, M.; QUERENA, M.; CACCIATORI, V.; CORGNATI, A.; MUGGEO, M. Estimates of in vivo insulin action in man: comparison of insulin tolerance tests with euglycemic and hyperglycemic glucose clamp studies. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. v. 68. n. 2. p. 374-378. 1989.

BOUTENS, L.; STIENSTRA, R. Adipose tissue macrophages: going off track during obesity. Diabetologia, v. 59, 5. Ed, p. 879,894, 2016.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72: p. 248–254, 1976.

BRADDOCK, R. J.; CADWALLADER, K. R. Bioconversion of citrus d-Limonene. In: Rouseff, R. L.; Leahy, M. M. (Eds.), Fruit Flavors: Biogenesis, Characterization and Authentication. Washington, DC: ACS Symp. Series N596, pp. 142-148, 1995.

BRAHE, L. K.; ASTRUP, A.; LARSEN, L. H. Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases? Obesity Reviews, v. 14, p. 950–959, 2013.

BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução RDC nº 2, de 15 de janeiro de 2007. Aprova o Regulamento Técnico sobre Aditivos Aromatizantes e revoga a Resolução nº 104, de 14 de maio de 1999. Diário Oficial (da República Federativa do Brasil), Brasília, DF, 14 de janeiro de 2007.

BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico (Vigitel), 2017. Disponível em: <http://portalarquivos.saude.gov.br/images/pdf/2017/junho/07/vigitel_2016_jun17.pdf>. Acesso em: 14 de junho de 2017.

BROWN, M. A.; STORLIEN, L. H.; HUANG, X-F.; TAPSELL L. C.; ELSE, P. L.; HIGGINS, J. A., BROWN, I. L. Dietary fat and carbohydrate composition: Metabolic disease. In: MONTMAYEUR, J. P.; LE COUTRE, J. (Ed.). Fat Detection: Taste, Texture, and Post Ingestive Effects. Boca Raton: CRC Press/Taylor & Francis, chap. 21, 2010, 643p. BRUNIERE, P., BENDA, I., BOCK, G., SCHEREIER, P. Bioconversion of citronellol by

Botrytis cinerea. Applied Microbiology Biotechnology, v. 27, p. 6-10, 1987.

BUCHBAUER, G.; JÄGER, W.; GRUBER, A.; DIETRICH, H. R‐(+)‐ and S‐(−)‐carvone: influence of chirality on locomotion activity in mice. Flavour and Fragrance Journal, v. 20, p. 686-689, 2005.

BURDOCK, G.A., FENAROLI, G. Fenaroli’s handbook of flavor ingredients, 6. ed.. Boca Raton: CRC Press, 2010.

BURNEIKO, R. C.; DINIZ, Y. S.; GALHARDI, C. M.; RODRIGUES, H. G.; EBAID, G. M.; FAINE, L. A. PADOVANI, C. R.; CICOGNA, A. C.; NOVELLI, E. L. Interaction of hypercaloric diet and physical exercise on lipid profile, oxidative stress and antioxidant defenses. Food and Chemical Toxicology. v. 44, n. 7, p. 1167-1172, 2006.

CADWALLADER, K. R.; BRADDOCK, R. J.; PARISH, M. E. Isolation of α-terpineol dehydratase from Pseudomonas gladioli. Journal of Food Science, v.57, p. 241-244, 1992.

CADWALLADER, K. R.; BRADDOCK, R. J.; PARISH, M. E.; HIGGINS, D. P. Bioconversion of (+)-Limonene by Pseudomonas gladioli. Journal of Food Science, v. 54, p. 1241-1245, 1989.

CALAZANS, P. N. Produção de aroma de coco por Trichoderma harzianum a partir do bagaço de cana. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química). Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão. 2012.

CALDWELL, J. Stereochemical determinants of the nature and consequences of drugs metabolism. Journal of Chromatography, v. 694, p. 39-48, 1995.

CAO, H., CHEN, X., JASSBI, A. R., XIAO, J. Microbial biotransformation of bioactive flavonoids. Biotechnology Advances, v. 33, n° 1, p. 214–223, 2015.

CANI, P. D.; JORDAN, B. F. Gut microbiota-mediated inflammation in obesity: a link with gastrointestinal câncer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2018.

CARVALHO, C. C. R., FONSECA, M. M. R. Biotransformations of terpenes. Biotechnology Advances, v. 24, p. 134-142, 2006.

CASTRO, U. G. M.; SANTOS, R. A.; SILVA, M. E.; LIMA, W. G.; CAMPAGNOLE- SANTOS, M. J.; ALZAMORA, A. C. Age-dependent effect of high-fructose and high-fat diets on lipid metabolism and lipid accumulation in liver and kidney of rats. Lipids in Health and Disease, v. 12, n. 136, 2013.

CERQUEIRA, N. M. F. S. A.; OLIVEIRA, E. F.; GESTO, D. S.; SANTOS-MARTINS, D.; MOREIRA, C.;. MOORTHY, H. N.; RAMOS, M. J.; FERNANDES, P. A. Cholesterol Biosynthesis: A Mechanistic Overview. Biochemistry, v. 55, p. 5483-5506, 2016.

CHABOT, D.; STEFFENSEN, J. F.; FARRELL, A. P. The Determination of Standard Metabolic Rate in Fishes. Journal of Fish Biology, v. 88, n. 1, p. 81-121, 2016.

CHAPPELL, J. The genetics and molecular genetics of terpene and sterol origami. Current opinion in plant biology, v. 5, p. 151-157, 2002.

CHEN, L.; ZHAO, L.; ZHANG, C.; LAN, Z. Protective effect of p-cymene on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Inflammation, v. 37, p. 358–364, 2014.

CHEN, W.; LIU, Y.; LI, M.; MAO, J.; ZHANG, L.; HUANG, R.; JIN, X.; YE, L. Anti-tumor effect of α-pinene on human hepatoma cell lines through inducing G2/M cell cycle arrest. Journal of Pharmacological Sciences, v. 127, p. 332-338, 2015.

CHURCH, T. S.; THOMAS, D. M.; TUDOR-LOCKE, C.; KATZMARZYK, P. T.; EARNEST, C. P.; RODARTE, R. Q.; MARTIN, C. K.; BLAIR, S. N.; BOUCHARD, C. Trends over 5 Decades in U.S. Occupation-Related Physical Activity and Their Associations with Obesity. PLoS One, v. 6, e19657, 2011.

CLARKE, G.; STILLING, R. M.; KENNEDY, P. J.; STANTON, C.; CRYAN, J. F.; DINAN, T. G. Minireview: Gut microbiota: the neglected endocrine organ. Molecular Endocrinology, v. 28, p.1221-1238, 2014.

CLAVEL T.; DESMARCHELIER C.; HALLER D.; GERARD P.; ROHN S.; LEPAGE P.; DANIEL, H. Intestinal microbiota in metabolic diseases: from bacterial community structure and functions to species of pathophysiological relevance. Gut Microbes, v. 5, p. 544-551, 2014.

CLEGG, R. J.; MIDDLETON, B.; BELL, G. D.; WHITE, D. A. The Mechanism of Cyclic Monoterpene Inhibition of Hepatic 3-Hydroxy3-methylglutaryl Coenzyme A Reductase in

Vivo in the Rat. The Journal of Biological Chemistry, v. 257, p. 2294-2299, 1982.

COELHO, E. M; VIANA, A. C; AZEVEDO, L. C. Prospecção tecnológica para o aproveitamento de resíduos industriais, com foco na indústria de processamento de manga. Congresso Brasileiro de Prospecção Tecnológica. ISSN 1983-1358. (print), 2317-0026 (online), vol.7, n.4, p.550-560, 2014.

COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de Cromatografia, 1ª ed.. Editora Unicamp: Campinas, 2006. 453p.

COUTO, J. L. A.; VIEIRA, R. C. S.; BARBOSA, J. M. Alterações da função hepática de camundongos desnutridos e infectados pelo Schistosoma mansoni. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. V. 41, n. 4, p. 390-393, 2008.

D’ACAMPORA ZELLNER, B.; DUGO, P.; DUGO, G.; MONDELLO, L. Gas chromatography-olfactometry in food flavour analysis. Journal of chromatography, v. 1186, n. 1-2, p. 123-43, 2008.

DEJI, N.; KUME, S.; ARAKI, S. I. SOUMURA, M.; SUGIMOTO, T.; ISSHIKI, K.; CHIN- KANASAKI, M.; SAKAGUCHI, M.; KOYA, D.; HANEDA, M.; KASHIWAGI, A.; UZU,

T.. Structural and functional changes in the kidneys of high-fat diet-induced obese mice. American Journal of Renal Physiology, vol. 296, n. 1, p. F118–F126, 2009.

DEMYTTENAERE, J.; DE KIMPE, N. Biotransformation of terpenes by fungi- study of the