PRODUÇÃO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL POR

4.1.1. Micro-organismos e reagentes

A cepa microbiana utilizada neste estudo foi o Pseudomonas fluorescens NCIMB 11671, reclassificado como Sphingobium sp. (BICAS et al., 2010b), que foi reativada e mantida em meio YM (em g.L-1: Agar = 20; glicose = 10; peptona = 5; extrato de levedura = 3; extrato de malte = 3, pH ~ 6,7) em estufa a 30°C de temperatura. R-(+)-limoneno (Sigma- Aldrich, 96% de pureza) e S-(-)-limoneno (Sigma-Aldrich, 96% de pureza), em óleo de soja (grau comercial) como fase orgânica, foram utilizados como substrato na biotransformação. Hexano (Dinâmica, 99% de pureza) e acetato de etila (Synth, 100% de pureza) foram utilizados na etapa de purificação dos enantiômeros R-(+)- e (-)-α-terpineol produzidos na biotransformação. Etanol (Synth, 95% de pureza), e n-decano foram utilizados na extração e análise de identificação em cromatógrafo a gás.

4.1.2. Preparo da pré-cultura

Três alçadas da cultura de células previamente cultivadas por 48 horas em placa de Petri foram transferidas para um Erlenmeyer de 500 mL contendo 1,0 g de glicose, 0,25 g de (NH4)2SO4, 5,0 mL da solução de Hutner, 10 mL de solução A, e 235 mL de água

destilada. A solução de Hutner foi preparada, inicialmente, pela dissolução do 2,5 g de ácido nitrilotriacético em água destilada (cerca de 200 mL) e o pH da solução foi ajustado para um valor maior ou igual a 8,0 por adição de grânulos de hidróxido de potássio. Após a dissolução completa, os outros sais foram adicionados (8,2 g de MgSO4. 7 H2O; 3,9 mg de (Na)2MoO4.

2H2O ; 19,6 mg de FeSO4. 1,5H2O), além de 13,9 mL de meio mineral (em g. L-1:

MgSO4.7H2O = 0,5; NaNO3 = 3,0; K2HPO4 = 1,0; KCl = 0,5 e Fe2SO4 = 0,001). O pH foi

reajustado para 7,2 e o volume total foi completado para a 250 mL com água destilada. Já a solução A consistiu de 6,5 g de K2HPO4 e 8,28 g de KH2PO4, em 200 mL de água destilada.

A pré-cultura foi incubada em shaker a 30°C e 200 rpm por 24 horas (BRUNIERE et al., 1987; FONTANILLE, 2002; FONTANILLE; LE FLÈCHE; LARROCHE, 2002; BICAS et

4.1.3. Produção do biocatalisador

Uma alíquota de 20 mL de pré-cultura foi transferida assepticamente para outro Erlenmeyer de 500 mL contendo o mesmo meio descrito em 4.1.2., exceto a glicose, que foi substituída pela solução contendo 500 μg de R-(+)-Limoneno ou S-(-)-Limoneno em 12,5 mL de óleo de soja (concentração de 40 g. L-1). Os frascos foram mantidos em incubadora a 30 ºC e 200 rpm por 48 horas. Em seguida, o meio de cultura foi centrifugado a 2600g por 10 minutos, resultando na biomassa produzida, a qual foi ressuspendida em tampão fosfato 20 mM e pH 7,0, até alcançar a densidade ótica igual a 10 a 600 ηm (DO600), a qual foi

congelada (-18°C) para os futuros ensaios.

4.1.4. Procedimentos de biotransformação em sistema bifásico

Para a produção dos enantiômeros R-(+)- e (-)-α-terpineol, a partir de R-(+)- limoneno e S-(-)-limoneno, respectivamente, foram utilizadas as melhores condições de processo estudadas por Molina (2014). A biomassa congelada (37,5 mL) e 12,5 mL de fase oleosa (350 g. L-1 de R-(+)-limoneno ou S-(‒)-limoneno em óleo de soja) foram transferidos para um Erlenmeyer de 250 mL. Os frascos foram incubados a 28°C e 200 rpm por 72 horas, para produção de R-(+)-α-terpineol, ou 120 horas, no caso da produção de (-)-α-terpineol (BICAS et al., 2010c). Após a biotransformação, as amostras foram centrifugadas a 2600g por 5 minutos a 5 °C, sendo descartada a fase aquosa, e os produtos da biotransformação foram extraídos da fase oleosa por agitação manual como o mesmo volume de etanol, até separação em duas fases. A fração etanólica foi analisada, por cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama, e utilizada para obtenção do α-terpineol (item 4.1.5).

Os enantiômeros produzidos foram analisados em cromatógrafo a gás HP-7890A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) equipado com detector de ionização de chama (GC-FID). Uma coluna capilar HP-5 (30 m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 μm de espessura) foi utilizada e hélio foi o gás de arraste percorrendo a coluna a uma taxa constante de 1,0 mL min-1. A temperatura do forno foi mantida a 80 °C durante 3 minutos, elevada à taxa de 20 °C. min-1 até 200 °C e mantido por 4 minutos. As temperaturas do injetor e do detector foram mantidas em 250 °C.. R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol (frações etanólicas) foram identificados após adição de 1,0% (v/v) de n-decano como padrão interno e acrescentando sulfato de sódio para remoção de água, e injetando-se 1 μL no cromatógrafo a gás (razão de Split de 1:10). Análises quirais foram feitas no mesmo cromatógrafo gasoso, equipado com coluna quiral β-DEX 120 (60 m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 μm de espessura), seguindo a mesma programação já descrita.

4.1.5. Purificação dos produtos da biotransformação

Os extratos etanólicos (item 4.1.4) foram rotaevaporados a 40°C sob vácuo. Limoneno e α-terpineol, contidos no óleo resultante, foram separados por meio da técnica de cromatografia em coluna aberta, conforme método descrito por Madyastha e Renganathan (1984), com adaptações. Para a separação cromatográfica foi utilizada, como fase estacionária, sílica gel 60 (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha) previamente ativada em estufa a 105°C por 3 horas. A fase móvel consistiu da mistura composta de hexano: acetato de etila na proporção de 9:1. Para o preenchimento da coluna de vidro (coluna de 15 cm de altura) foi utilizado o mesmo volume das fases móvel e estacionária, e agitando a coluna para retirada das bolhas de ar, de forma a compactá-la o máximo possível.

Uma vez que as amostras não apresentam coloração, testes preliminares foram feitos em colunas de 20 mm de diâmetro (47 mL de fase estacionária), adicionando 0,7 mL de amostra (mistura de padrões de limoneno e α-terpineol na proporção de 1:1) na coluna, recolhendo-se frações de 2,0 mL de eluente, e analisando-as em cromatógrafo gasoso (item 4.1.4), a fim de determinar o intervalo de separação dos enantiômeros de limoneno e α- terpineol, por meio do volume de fase móvel utilizado.

Estabelecidos os intervalos de eluição dos enantiômeros de α-terpineol, o mesmo procedimento foi realizando, transpondo o experimento para uma coluna de 37 mm de diâmetro, mantendo os 15 cm de altura da coluna (160 mL de fase estacionária). Alíquotas de 5 mL de amostra (mistura de padrões de limoneno e α-terpineol na proporção de 1:1) foram adicionadas à coluna a cada corrida e, imediatamente, as frações de 5,0 mL de eluente foram recolhidas e monitoradas por cromatografia a gás (item 4.1.4). Definidas as frações que continham apenas o α-terpineol, o procedimento foi repetido com todo o volume de amostra (5 mL por coluna), recuperando apenas as frações de interesse. As frações que ainda continham mistura de limoneno e α-terpineol foram novamente adicionadas à coluna em uma nova corrida, até que o α-terpineol presente na mistura fosse totalmente extraído. Por fim, as frações contendo um mesmo enantiômero do α-terpineol foram reunidas e o solvente foi removido por evaporação à temperatura ambiente, em capela de fluxo laminar. Os produtos obtidos foram analisados por cromatografia gasosa (item 4.1.4) e armazenados a -18°C até o momento do uso. O excesso enantiomérico dos enantiômeros do α-terpineol foi definido como a razão (R - S)/(R + S) x 100, onde R e S são as concentrações dos enantiômeros de α- terpineol (ELIEL; WILEN; MANDER, 1994; TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI; 2003).

4.2. ENSAIO BIOLÓGICO