Produção e avaliação do potencial biológico dos enantiômeros de alfa-terpineol

GARDENIA MARTINS DE SOUSA

PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DOS ENANTIÔMEROS DE α-TERPINEOL

CAMPINAS 2018

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

GARDENIA MARTINS DE SOUSA

PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOLÓGICO DOS ENANTIÔMEROS DE α-TERPINEOL

Orientador: Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas

CAMPINAS 2018

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA GARDENIA MARTINS DE SOUSA E ORIENTADA PELO PROF. DR. JULIANO LEMOS BICAS

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________ Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas

Orientador – FEA/UNICAMP

______________________________________________________ Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz

Membro Titular – FCF/UNICAMP

______________________________________________________ Profa. Dra. Elisa de Almeida Jackix

Membro Titular – PUC-Campinas

______________________________________________________ Dra. Jane Cristina de Souza

Membro Titular – IB/UNICAMP

______________________________________________________ Profa. Dra. Semíramis Martins Álvares Domene

Membro Titular – UNIFESP

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedico esse trabalho aos meus pais, Maurílio e Aldina, e minhas irmãs, Kamila e Letícia, que sempre me envolveram de amor e coragem, e que mesmo longe sempre me incentivaram com sua torcida e confiança...

AGRADECIMENTOS

A Deus e a Nossa Senhora Aparecida, por estarem sempre comigo, abrindo portas e dando-me força, saúde, fé e inspiração para seguir em busca de meus sonhos, e também pelos obstáculos que me fizeram crescer. Porque concluo esta etapa importante da minha vida e por me amar.

Aos meus maravilhosos pais, Maurílio e Aldina, pelo amor, apoio, incentivo e orações. Por aceitarem que eu escolhesse meu caminho, me apoiando e acreditando na minha capacidade. Amo vocês!

Às minhas queridas irmãs, Kamila e Letícia, pelo carinho, amizade e todo o apoio dispensado, principalmente nos momentos mais difíceis;

Ao Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas pela oportunidade e orientação deste trabalho, sua enorme paciência, competência, dedicação e ensinamentos a mim e aos demais colegas;

Aos colegas e funcionários dos laboratórios de Bioaromas e de Biotecnologia, Nadir, Angélica, Dora, Tatiana, Adones, Leonardo, Gustavo, Henrique, Ana Paula e Bruno, pelo companheirismo, amizade e auxílio na condução dos experimentos.

Ao Departamento de Alimentação e Nutrição (DEPAN/UNICAMP), pela parceria e realização dos ensaios biológicos. Agradeço especialmente ao Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Junior e à Profa. Dra. Cinthia Baú Betim Cazarin pela acolhida, apoio e ensinamentos que tanto contribuíram para a realização deste trabalho.

À Maria Susana Corrêa Cunha, do Laboratório de Ensaios Biológicos (LEB/FEA/UNICAMP), na execução dos ensaios biológicos, pela amizade e momentos de alegria proporcionados.

À Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz (CPQBA/UNICAMP), pelo auxílio nos ensaios antiproliferativos.

À Universidade Estadual de Campinas, à Faculdade de Engenharia de Alimentos e, em especial, ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, pela acolhida e oportunidade de realizar meu doutorado e poder concluir mais uma meta.

A todos os professores do Departamento de Ciência de Alimentos (DCA/UNICAMP) pela dedicação, empenho e conhecimentos transmitidos.

Aos funcionários do Departamento de Ciência de Alimentos pela convivência e prestabilidade.

Aos amigos e familiares, ainda que longe, sempre tão perto e unidos, nunca deixaram de me apoiar e confiar em mim;

À Comunidade Santa Teresinha do Menino Jesus (OCDS) e às monjas do Carmelo de Campinas pela acolhida, amizade e orações. Uma bela família que ganhei! Em especial, agradeço à Lygia Therezinha de Araújo Linardi pela acolhida em sua casa, em minha mudança para Campinas, e pela amizade.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro, e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de pós-graduação.

Aos membros da banca examinadora por, gentilmente, aceitarem o convite, cedendo tempo e conhecimento em favor deste trabalho;

A todos que colaboraram direta ou indiretamente para que essa tese acontecesse, desde o início, e que torceram por mim. Muito obrigada!

“Sei que sou sustentada e aqui está a minha tranquilidade e segurança; não a segurança sábia do homem que está num terreno seguro com as próprias forças, mas a doce e feliz segurança da criança sustentada por um braço forte...”

RESUMO

Aromas naturais que apresentam grande importância comercial e ampla gama de atividades biológicas têm despertado a atenção dos pesquisadores. O α-terpineol é um monoterpenóide encontrado em vários óleos essenciais, sendo um dos mais utilizados na indústria de alimentos, cosméticos e em produtos de limpeza, e apresenta propriedades biológicas bastante promissoras. Este trabalho de doutorado teve como objetivos produzir, por biotransformação, os enantiômeros R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, a partir do limoneno, utilizando a linhagem Sphingobium sp., e avaliar as diferenças em termos de efeitos biológicos destes enantiômeros. Para a biotransformação foram utilizadas, na proporção de 3:1, biomassa congelada e óleo de soja contendo R-(+)-limoneno ou S-(‒)-limoneno (350 g.L-1). Os frascos foram incubados a 28°C e 200 rpm por 72 horas, para produção de R-(+)-α-terpineol, ou 120 horas, para produção de (-)-α-terpineol. A produção de R-(+)-α-terpineol chegou a 151,0 g.L-1 e a de S-(-)-α-terpineol chegou a 91,0 g.L-1, e com pureza enantiomérica superior ao dos padrões comerciais. O α-terpineol foi isolado do óleo resultante da biotransformação por cromatografia em coluna de vidro, contendo sílica gel como fase estacionária e mistura de hexano: acetato de etila (9:1) como fase móvel. Na sequência, o seu potencial biológico foi testado em 48 ratos Sprague-Dawley, durante 12 semanas experimentais. Nas cinco semanas iniciais, os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais: controle magro (AIN; n=6), que recebeu dieta padrão, e grupo hiperlipídico (n=42), que recebeu dieta hiperlipídica para o desenvolvimento da obesidade e indução da inflamação. Após este período, o grupo hiperlipídico foi subdividido em sete grupos (n=6): controle hiperlipídico (HF), e grupos hiperlipídicos suplementados de 25, 50 e 100 mg.kg-1 de R-(+)-α-terpineol ou (-)-α-terpineol, e mantidos por mais 6 semanas. Durante este período foram avaliados o peso corporal, consumo alimentar, testes de tolerância à glicose e resistência à insulina. Após a exsanguinação dos animais, sob anestesia, amostras de sangue foram coletadas para análises bioquímicas e alíquotas de tecido hepático foram encaminhadas para análise histológica. Os animais do grupo HF apresentaram maior consumo de dieta e ganho de massa corporal, associados à maior resistência à insulina, elevação dos níveis séricos das aminotransferases AST e ALT e maior acúmulo de gordura hepática. TBARS, ALT e citocinas TNF-α e IL-1β foram positivamente modulados pela suplementação com os enantiômeros de α-terpineol. Os melhores resultados de TBARS no soro e sensibilidade à insulina foram observados nos animais que consumiram α-terpineol em concentrações superiores a 50 mg.kg-1 de dieta. O tratamento com os enantiômeros de α-terpineol reduziu o acúmulo de gordura hepática. A

propriedade antiproliferativa in vitro dos enantiômeros de α-terpineol foi avaliada em células tumorais. Os resultados foram semelhantes para ambos os enantiômeros, destacando o efeito citostático para as linhagens U251 (glioma), K562 (leucemia), PC-3 (próstata) e MCF7 (mama). Os resultados deste estudo indicam que a ingestão dos enantiômeros de α-terpineol pode influenciar, de maneira positiva, na inibição do crescimento das células tumorais, e em parâmetros como dano oxidativo, resistência à insulina, citocinas pró-inflamatórias e esteatose hepática, relacionados com a obesidade induzida por dieta hiperlipídica.

Palavras chave: α-terpineol, biotransformação, limoneno, Sphingobium sp., aromas naturais, atividade biológica, obesidade.

ABSTRACT

Natural flavors that present great commercial importance and wide range of biological activities have attracted attention of researchers. α-terpineol is a monoterpenoid found in many essential oils, being one the most used in food and cosmetic industries and cleaning products, and presents promising biological properties. This work aimed to produce, by biotransformation, R-(+)-α-terpineol and (-)-α-terpineol enantiomers from limonene using the strain Sphingobium sp. and to evaluate the differences in biological effects of these enantiomers. For biotransformation, frozen biomass and soybean oil containing R-(+)-limonene or S-(-)-R-(+)-limonene (350 g.L-1), in the proportion of 3:1, were used. Flasks were incubated at 28° C and 200 rpm for 72 hours for R-(+)-α-terpineol production, or 120 hours for (-)-α-terpineol production. R-(+)-α-terpineol production reached 151.0 g. L-1 and 91.0 g.L

-1

for S-(-)-terpineol and with higher enantiomeric excess than commercial standards. The α-terpineol was isolated from resulting oil of biotransformation by glass column chromatography containing silica gel as stationary phase and ethyl hexane: ethyl acetate (9:1) mixture as the mobile phase. Subsequently, its biological potential was tested in 48

Sprague-Dawley rats for 12 experimental weeks. In the first five weeks, the animals were randomly

divided in two experimental groups: normolipidic control (AIN; n=6), who received a standard diet and the hyperlipidemic group (n=42) who received a high-fat diet for the obesity development and inflammation induction. After this period, the hyperlipidemic group was subdivided into seven groups (n=6): hyperlipidemic control (HF), and supplemented hyperlipidic groups of 25, 50 and 100 mg.kg-1 diet of R-(+)-α-terpineol or (-)-α-terpineol and maintained for another 6 weeks. During this period, the body weight and diet intake, glucose tolerance and insulin resistance tests were evaluated. After exsanguination of the animals, in anesthesia, blood samples were collected for biochemical analyzes and liver tissue aliquots were sent for histological analysis. Rats of HF group had higher dietary intake and body mass gain, associated with higher insulin resistance, elevated serum levels of AST and ALT aminotransferases, and greater accumulation of liver fat. TBARS, ALT, TNF-α and IL-1β cytokines were positively modulated by supplementation with α-terpineol enantiomers. The best results of serum TBARS and insulin sensitivity were observed in animals that consumed α-terpineol at concentrations higher than 50 mg.kg-1

diet. α-terpineol enantiomers treatments reduced the accumulation of hepatic fat. The in vitro antiproliferative property of α-terpineol enantiomers was evaluated in tumor cells. Results were similar in both enantiomers, highlighting cytostatic effect for the strains U251 (glioma), K562 (leukemia), PC-3 (prostate)

and MCF7 (breast). These results indicate that ingestion of α-terpineol enantiomers may positively influence tumor cell growth inhibition, and in parameters such as oxidative damage, insulin resistance, proinflammatory cytokines and hepatic steatosis, related diet-induced obesity.

Keywords: α-terpineol, biotransformation, limonene, Sphingobium sp., natural flavors, biological activity, obesity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação da formação estrutural do limoneno... 29

Figura 2. Subdivisão dos isômeros... 32

Figura 3. Diagrama esquemático da interação de moléculas quirais com enzimas receptoras. Teoria dos três pontos... 33

Figura 4. Estruturas enantioméricas do limoneno... 35

Figura 5. Estruturas enantioméricas do α-terpineol... 36

Figura 6. Principais rotas envolvidas na biotransformação do limoneno... 38

Figura 7. Ratos Sprague-Dawley mantidos em gaiolas individuais em sala, sob condições ambientais controladas... ₅₃

Figura 8. Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos utilizada no teste de atividade antiproliferativa in vitro... ₆₂

Figura 9. Curvas de separação de R-(+)-limoneno e R-(+)-α-terpineol (A), e S-(–)-limoneno (–)-α-terpineol (B) do óleo resultante da biotransformação do limoneno, obtidas por cromatografia em coluna de vidro contendo sílica gel e eluida com hexano e acetato de etila (9:1)... 66

Figura 10. Consumo alimentar (A) e ingestão calórica semanal dos animais (B)... ₆₈

Figura 11. Ingestão semanal de α-terpineol, em relação ao peso corporal dos animais... ₆₉

Figura 12. Evolução semanal do peso corporal de ratos Sprague Dawley submetidos a diferentes tratamentos durante 12 semanas experimentais (A) e ganho total de peso dos animais (B)... ₇₀

Figura 13. Peso relativo do coração (A), fígado (B), rins (C), baço (D), ceco intestinal (E), tecido adiposo marrom (F), tecido adiposo epididimal (G), corrigido em relação ao peso corporal total dos animais... ₇₂

Figura 14. Teste de tolerância à glicose. Curva de controle da glicemia durante 120 minutos (A), em µM de glicose, após injeção de solução de glicose e área sob a curva da glicemia durante o GTT (B)... ₇₄

Figura 15. Índice de decaimento da glicose, KITT, calculada a partir das glicemias coletadas no teste de tolerância à insulina... ₇₅

Figura 16. Níveis séricos de Colesterol total (A), Colesterol LDL (B) e Triglicerídeos (C) de ratos Sprague-Dawley... ₇₆

Figura 17. Níveis séricos da alanina aminotransferase (A) e aspartato aminotransferase (B), em ratos Sprague-Dawley que receberam dieta normolipídica, hiperlipídica e hiperlipídica suplementadas com enantiômeros de α-terpineol... ₇₈ Figura 18. Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em

receberam dietas normolipídica e hiperlipídica e dieta hiperlipídica suplementados com R-(+) e (–)-α-terpineol... 79 Figura 19. Efeitos dos enantiômeros de α-terpineol nos níveis das citocinas

pro-inflamatórias TNF-α (A) e IL-1β (B) dos diferentes grupos experimentais... ₈₁ Figura 20. Análise histológica do fígado: AIN (A); HF (B); S25 (C); S50 (D);

S100 (E); R25 (F); R50 (G); R100 (H). Setas pretas: sinusóides; setas amarelas: gotículas lipídicas. As seções histológicas foram coradas com hematoxilina e eosina. Aumento de 40X... ₈₃ Figura 21. Efeito antiproliferativo da Doxorrubina frente um painel de células

humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-(PC-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT)... ₈₅ Figura 22. Efeito antiproliferativo de S-(-)-limoneno (A) e R-(+)-limoneno (B)

frente um painel de células humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT)... 86 Figura 23. Efeito antiproliferativo de (-)-α-terpineol (A) e R-(+)-α-terpineol (B)

frente um painel de células humanas, após 48 horas de exposição. Linhagens tumorais: Glioma (U251), Mama (MCF-7), Ovário com fenótipo resistência multidroga (NCI-ADR/RES), Rim (786-0), Pulmão (NCI-H460), Próstata (PC-3), Ovário (OVCAR-3), Cólon (HT-29), Melanoma (UACC-62) e Leucemia (K562). Linhagem não tumoral: Queratinócitos imortalizados (HaCaT)... ₈₈

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação dos terpenos, com base no número de subunidades de

isopreno... ₃₀

Tabela 2. Principais constituintes de alguns óleos vegetais... 31

Tabela 3. Composição das dietas (g. kg-1 _{de dieta)... 55}

Tabela 4. Composição centesimal das dietas (g. 100g-1)... ₅₆

Tabela 5. Descrição dos grupos experimentais... 57

Tabela 6. Linhagens celulares utilizadas nos estudos in vitro... 61

Tabela 7. Tempo de retenção e concentrações de produtos após 72 horas (no caso do R-(+)-limoneno) e 120 horas (no caso do S-(–)-limoneno) de biotransformação dos enantiômeros do limoneno... 64

Tabela 8. Valores de GI50 (μg. mL-1) após o tratamento com R-(+)-α-terpineol e S-(-)-α-terpineol frente às linhagens tumorais e não tumorais no ensaio antiproliferativo ... ₈₉

Tabela 9. Valores de TGI (μg. mL-1) após o tratamento com R-(+)-limoneno, S-(-)-limoneno, R-(+)-α-terpineol e S-(-)-α-terpineol frente às linhagens tumorais e não tumorais no ensaio antiproliferativo... ₈₉

Tabela 10. Resultados de consumo alimentar (g. dia-1) dos ratos Sprague-Dawley alimentados com diferentes dietas... ₁₂₁

Tabela 11. Ingestão calórica (kcal. dia-1) dos ratos Sprague Dawley alimentados com diferentes dietas... ₁₂₂

Tabela 12. Ingestão semanal (mg. kgpc-1) dos enantiômeros de -terpineol, em relação ao peso corporal dos animais... ₁₂₃

Tabela 13. Peso corporal médio (g) de ratos Sprague Dawley para os diferentes tratamentos, durante 12 semanas experimentais... ₁₂₄

Tabela 14. Peso bruto (g) dos orgãos extraídos dos ratos Sprague-Dawley... ₁₂₅

Tabela 15. Peso relativo dos órgãos (g. 100 g-1), corrigido em relação ao peso corporal total... ₁₂₆

Tabela 16. Resultados dos testes de tolerância à glicose e insulina (GTT e KITT) dos animais dos diferentes grupos estudados... ₁₂₇

Tabela 17. Efeito das diferentes concentrações dos enantiômeros de -terpineol (25, 50 e 100 mg. kg-1) nas dietas sobre os parâmetros bioquímicos e níveis de citocinas TNF-α e IL-1β nos diferentes grupos de ratos Sprague Dawley estudados... ₁₂₈

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

AIN _{American Institute of Nutrition}

AOAC _{Association of Official Analytical Chemists} ALT Alanina aminotransferase

AST Aspartato aminotransferase DMSO Dimetilsulfóxido

ERO Espécies reativas de oxigênio

GC-FID Gas Chromatography - Flame Ionization Detector (Cromatógrafo a gás com

detector de ionização de chama)

GTT Glucose tolerance test (Teste de tolerância à glicose)

HF High-fat

IL-1β Interleucina 1β IL-6 Interleucina 6

IMC Índice de massa corporal

ITT Insuline tolerance test (Teste de tolerância à insulina)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

MBC Minimum bactericidal concentration (Mínima concentração bactericida)

MDA Malonaldeído

MIC Minimum inhibitory concentration (Mínima concentração inibitória)

NOAEL No Observed Adverse Effect Level

NF-κB Nuclear Factor-Kappa B

PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 (Fator ativador de plasminogênio-1)

PPARs Peroxisome proliferator-activated receptor (Receptores ativados por

proliferadores de peroxissoma) RI Resistência à insulina

SFB Soro fetal bovino SRB Sulforrodamina B

TBARS Thiobarbituric acid reactive substances (substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico)

TGI Total Growth Inhibition

TNF-α Tumor necrosis factor-alpha (Fator de necrose tumoral-alfa)

WHO World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ... 19 2. OBJETIVOS ... 22 2.1. OBJETIVO GERAL ... 22 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 22 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 23 3.1. AROMAS ... 23

3.2. OBTENÇÃO DE COMPOSTOS DE AROMAS NATURAIS POR VIA BIOTECNOLÓGICA ... 25

3.3. COMPOSTOS TERPÊNICOS ... 28

3.3.1. Definição geral ... 28

3.3.2. Importância da estereoisomeria no estudo de compostos terpênicos ... 31

3.3.3. Limoneno ... 34

3.3.4. α-terpineol ... 36

3.4. BIOTRANSFORMAÇÃO DE LIMONENO EM α-TERPINEOL ... 37

3.5. OBESIDADE ... 40

3.5.1. Obesidade: uma epidemia mundial ... 40

3.5.2. Obesidade e inflamação ... 41

3.5.3. Modelos experimentais de obesidade induzida por dieta hiperlipídica ... 44

3.6. POTENCIAL BIOLÓGICO DO α-TERPINEOL ... 46

4. MATERIAL E MÉTODOS ... 50

4.1. PRODUÇÃO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL POR BIOTRANSFORMAÇÃO ... 50

4.1.1. Micro-organismos e reagentes ... 50

4.1.2. Preparo da pré-cultura ... 50

4.1.3. Produção do biocatalisador ... 51

4.1.4. Procedimentos de biotransformação em sistema bifásico ... 51

4.1.5. Purificação dos produtos da biotransformação ... 52

4.2. ENSAIO BIOLÓGICO ... 53

4.2.1. Animais ... 53

4.2.2. Dietas ... 54

4.2.3. Procedimento experimental ... 57

4.2.4. Ganho de peso e consumo alimentar ... 58

4.2.6. Parâmetros bioquímicos... 59

4.2.7. Peroxidação lipídica (TBARS) ... 59

4.2.8. Análise histológica em tecido hepático... 60

4.2.9. Análise estatística ... 60

4.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA IN VITRO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-R-(+)-α-TERPINEOL ... 60

4.3.1. Preparo das suspensões celulares e aplicação das amostras ... 60

4.3.2. Análise dos resultados ... 62

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 64

5.1. PRODUÇÃO DE R-(+)-α-TERPINEOL E (-)-α-TERPINEOL POR BIOTRANSFORMAÇÃO ... 64

5.2. AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DOS ANIMAIS ... 67

5.2.1. Consumo alimentar dos animais ... 67

5.2.2. Peso corporal dos animais ... 70

5.2.3. Pesos dos tecidos ... 71

5.2.4. Testes de tolerância à glicose e sensibilidade à insulina ... 73

5.2.5. Análises bioquímicas ... 75

5.2.6. Peroxidação lipídica (TBARS) ... 79

5.2.7. Determinação dos níveis de citocinas TNF-α e IL-1β ... 80

5.2.8. Análise histológica ... 82

5.3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA EM CULTURA DE CÉLULAS ... 84

CONCLUSÃO GERAL ... 91

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 93

APÊNDICE ... 121

1. INTRODUÇÃO GERAL

O aroma é um dos mais importantes atributos sensoriais dos alimentos, bebidas e cosméticos. Correlaciona-se diretamente com o sabor e tem grande influência na seleção, aceitação e ingestão dos produtos pelo consumidor (FISHER; SCOTT, 1997; WRIGHT, 2010). Ampla variedade de compostos orgânicos está associada ao aroma, compreendendo compostos voláteis (individuais ou em misturas complexas em diferentes proporções) de inúmeras classes químicas, como aldeídos, alcoóis, ésteres, ácidos carboxílicos de cadeia curta, compostos fenólicos e de enxofre, cetonas e lactonas. Estes compostos podem ser obtidos por meio de extrações de recursos naturais, e também podem ser produzidos por via química ou biotecnológica (LONGO; SANRÓMAN, 2006; D’ACAMPORA ZELLNER et

al., 2008; BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; WRIGHT, 2010).

O setor de aromas e fragrâncias, em suas diversas aplicações, representa não somente um mercado global multibilionário, mas também uma fonte de desenvolvimento científico e de inovação constante. No ano de 2017, a indústria de aromas e fragrâncias rendeu um montante estimado de 26,3 bilhões de dólares (LEFFINWELL AND ASSOCIATES, 2017). Atualmente, o mercado de aromas é dominado por aromas artificiais; aproximadamente 80% dos aromas e fragrâncias são produzidos sinteticamente. No entanto, devido à alta demanda e maior conscientização do consumidor por produtos com apelo de saudabilidade, tem-se percebido uma tendência crescente ao uso de aromas naturais (SPEZIALI, 2012; ANDRADE et al., 2013). Nesse contexto, a biotecnologia se mostra como uma das maiores tendências da indústria em produzir ingredientes naturais para substituir aqueles que são utilizados em forma sintética (DHILLON; KAUR; BRAR, 2013).

Os compostos de aroma podem ser produzidos por via biotecnológica a partir de substratos de baixo custo. A utilização de subprodutos agroindustriais com alto teor desses substratos como, por exemplo, materiais ricos em monoterpenos, são de grande interesse na biotecnologia de produção de aromas. Assim, vários pesquisadores vêm estudando o aproveitamento de subprodutos da indústria de alimentos, pois além de contribuírem com a diminuição de impactos ambientais, estes subprodutos podem gerar renda colaborando com a economia do país e sendo promissor pra a obtenção de insumos de alto valor agregado, como compostos de aroma e fármacos (COELHO; VIANA; AZEVEDO, 2014; CAO et al., 2015).

O limoneno, monoterpeno mais abundante na natureza, é o constituinte majoritário de óleos essenciais de laranja e limão, sendo encontrado nos subprodutos industriais do processamento de frutas cítricas e tem sido utilizado como precursor para a

produção biotecnológica de monoterpenóides bioativos e de maior valor agregado, como α-terpineol, carvona e álcool perílico (DUETZ et al., 2003; VAN BEILEN et al., 2005; BADEE; HELMY; MORSY, 2010; MARMULLA; HARDER, 2014). O limoneno se apresenta quimicamente como dois enantiômeros, sendo que o R-(+)-limoneno é o mais abundante no óleo da casca da laranja (até 90%) enquanto que o isômero S-(-) é encontrado em óleos da casca de limão e nas espécies Mentha e coníferas, em baixas concentrações (BAUER; GARBE; SURBURG, 2001; RESENDE; AMAURO; RODRIGUES FILHO, 2016).

Mais de 60 mil toneladas de R-(+)-limoneno são recuperadas ao ano como subproduto da indústria cítrica mundial. A disponibilidade de grandes quantidades de limoneno e o seu baixo custo (US$ 5–7/kg) tem despertado o interesse dos pesquisadores e da indústria. Além disso, o fato de alguns compostos medicinais e de aroma possuírem fórmulas estruturais semelhantes ao limoneno, há um indicativo do grande potencial de utilização industrial desse produto subaproveitado (CARVALHO; FONSECA, 2006; LAWRENCE, 2009; LANGE, 2015; ALICEWEB, 2016).

Um interessante produto da biotransformação do limoneno é o α-terpineol. Este monoterpenóide possui duas formas enantioméricas: R-(+)-α-terpineol, de aroma floral intenso, e S-(-)-α-terpineol, presente na espécie Pinus palustris Mill., que possui um odor caracteristicamente conífero. A bioconversão do limoneno para α-terpineol tem sido descrita, utilizando ampla variedade de fungos oriundos de diversas fontes como, por exemplo, solo, resíduos agroindustriais, frutos exóticos, sementes, como biocatalisadores (BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; MOLINA et al., 2013; ABRAHÃO; MOLINA; PASTORE, 2013). O processo biotecnológico de produção apresenta a vantagem de ser regido por reações enzimáticas, as quais se diferenciam da síntese química por serem enantio e regioespecíficas (RUIZ, FLOTATZ, 2014; LANGE, 2015).

O apelo comercial dos produtos biotecnológicos é um fator que influencia as pesquisas, uma vez que esses produtos são considerados naturais e tem-se comprovado que muitos deles apresentam atividades biológicas relevantes. Além de suas propriedades relativas a aromas e fragrâncias, α-terpineol vem sendo reconhecido por suas propriedades funcionais (BICAS et al., 2011). A comprovação do α-terpineol como possível composto biologicamente ativo gera novas possibilidades para sua utilização, em alimentos e bebidas, uma vez que a comprovação da atividade biológica dessas substâncias adere à demanda do mercado consumidor por produtos que possuam papel na prevenção de doenças. Estudos revelam que o α-terpineol apresenta atividade antiproliferativa in vitro, atividades antimutagênica e

antimicrobiana (HASSAN et al., 2010; BICAS et al., 2011; PARK et al., 2009; 2012). Outras propriedades atribuídas ao α-terpineol são as capacidades anti-inflamatória e antioxidante, às quais estão intimamente relacionadas, por exemplo, com a proteção contra os mecanismos fisiopatológicos envolvidos com a gênese da obesidade (MARÓSTICA JÚNIOR et al., 2009; BICAS et al., 2011; FRANÇA et al., 2013).

A obesidade é reconhecida hoje como um dos mais importantes problemas de saúde pública em todo o mundo devido a sua contribuição para o aumento significativo de morte prematura e invalidez precoce, uma vez que esta condição está intimamente relacionada a um maior risco para o desenvolvimento de uma série de doenças crônicas não transmissíveis, como resistência à insulina, diabetes tipo 2, hipertensão arterial, dislipidemias, doenças hepáticas e cardiovasculares e certos tipos de câncer (HALLIWELL, 2007; GALIC; OAKHILL; STEINBERG, 2010; JOHNSON; MILNER; MAKOWSKI, 2012). Dentre as principais causas da obesidade, destacam-se o consumo excessivo de produtos de alta densidade energética e com alto teor de gorduras e/ou açúcares, além da redução da prática de atividades físicas associado a mudanças de estilo de vida geradas pela urbanização (MATTES, 2013; 2014).

Diante do exposto, o presente estudo investigou a hipótese de que as respostas fisiológicas promovidas pela ingestão de R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, produzidos por biotransformação a partir dos enantiômeros de limoneno, em modelos experimentais de obesidade, poderiam atenuar eventuais distúrbios metabólicos provocados por consumo de dieta hiperlipídica.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

O principal objetivo deste trabalho foi produzir os enantiômeros R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, a partir da biotransformação do limoneno, e estudar os efeitos biológicos destes dois enantiômeros.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Produção, por biotransformação, de R-(+)-α-terpineol e (-)-α-terpineol, a partir de limoneno, pela linhagem Sphingobium sp., partindo de condições otimizadas em estudos anteriores;

- Separação do α-terpineol e do limoneno remanescente do processo de biotransformação por cromatografia em coluna aberta;

- Caracterização química e determinação do excesso enantiomérico dos enantiômeros de α-terpineol por cromatografia gasosa;

- Determinação da atividade antiproliferativa in vitro do R-(+)- e do (-)-α-terpineol contra nove linhagens de células tumorais;

- Produção das dietas para os estudos in vivo e sua caracterização, com relação ao conteúdo de umidade, proteínas, cinzas e lipídeos;

- Avaliação o potencial da suplementação de R-(+)- e do (-)-α-terpineol em modelo experimental de dieta hiperlipídica em ratos machos Sprague Dawley, sobre os seguintes parâmetros biológicos: peso do fígado, teor de tecido adiposo e soro, peso corporal, ingestão alimentar, níveis de triglicerídeos e colesterol, tolerância à glicose (GTT), sensibilidade à insulina (ITT), citocinas inflamatórias (TNFα e IL-1β) e níveis das enzimas alanina aminotransferase (ALT), e aspartato aminotransferase (AST); perfil oxidativo do plasma e tecido hepático, além de análise histológica do fígado.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. AROMAS

Os aromas sempre foram parte integrante da evolução da humanidade e com o desenvolvimento tecnológico dos materiais, eles se destinam a melhorar a qualidade sensorial e aprimorar os produtos. Os compostos de aroma são amplamente utilizados em formulações de alimentos, rações, bebidas, cosméticos, detergentes, produtos químicos e farmacêuticos, entre outros produtos. Com o desenvolvimento tecnológico na área de alimentos, os aromas assumem a função de melhorar a qualidade sensorial dos alimentos, sendo considerado um dos atributos mais importantes na aceitação do produto pelo consumidor (LONGO; SANROMÁN, 2006; GUPTA; PRAKASH; GUPTA, 2015).

Em 1994, a indústria de aromas e fragrâncias rendeu um montante estimado em aproximadamente US$ 9,7 bilhões. Até esta época, em torno de 6.400 voláteis naturais e 10.000 fragrâncias sintéticas eram conhecidos. Entretanto, apenas em torno de 400 compostos de aroma foram comercializados em escala superior a uma tonelada por ano (SOMOGYI, 1996; KRINGS; BERGER, 1998). Outros dados mostram que, em 2013, a indústria de aromas e fragrâncias apresentou um faturamento estimado em torno de US$ 23,9 bilhões, e subiu para US$ 26,3 bilhões em 2017 (LEFFINGWELL AND ASSOCIATES, 2017).

A Resolução-RDC n° 2, de 15 de janeiro de 2007, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2007), dispõe acerca do Regulamento Técnico sobre Aditivos Aromatizantes. Os aromas, ou aromatizantes, são definidos como “substâncias ou misturas

de substâncias com propriedades odoríferas e/ou sápidas, capazes de conferir ou intensificar o aroma e/ou sabor aos alimentos”. Excluem-se desta definição “as substâncias que conferem exclusivamente sabor doce, salgado ou ácido; as substâncias e produtos alimentícios com propriedades odoríferas e/ou sápidas consumidas sem transformação, com ou sem

reconstituição” e “as matérias de origem vegetal ou animal que possuam propriedades

aromatizantes intrínsecas, quando não sejam utilizadas exclusivamente como fonte de aromas”.

Dentro da classificação dos aromas, encontram-se os aromas naturais, que são “obtidos

exclusivamente por métodos físicos, microbiológicos ou enzimáticos, a partir de matérias-primas aromatizantes naturais”, as quais são “produtos de origem animal ou vegetal aceitáveis para consumo humano, que contenham substâncias odoríferas e/ou sápidas, seja em seu estado natural ou após um tratamento adequado, como: torrefação, cocção, fermentação, enriquecimento, tratamento enzimático ou outros”.

Os aromas de produtos naturais são geralmente formados por misturas complexas de centenas de substâncias, representantes de várias classes de compostos como hidrocarbonetos, ésteres, aldeídos, cetonas, lactonas, alcoóis e outras moléculas complexas resultantes do metabolismo secundário de plantas e de micro-organismos, que possuem potencial para produzir aromas (FRANCO, 2004; LONGO; SANROMÁN, 2006). Apesar de não representarem nenhuma função nutritiva ao alimento, estes compostos são frequentemente utilizados como aditivos na indústria de alimentos, bebidas, perfumes e cosméticos para conferir, intensificar e melhorar o aroma do produto, e até mesmo o sabor, como o caso dos alimentos (BERGER, 1995; GAVA; SILVA; FRIAS, 2009).

Muitos compostos de aromas disponíveis no mercado ainda são produzidos sinteticamente ou extraídos de fontes naturais. Devido ao aumento do interesse e conscientização do consumidor em produtos naturais, há uma maior procura por fragrâncias obtidas a partir de fontes naturais sendo, portanto, mais valorizados no mercado do que os aditivos químicos artificiais. A preferência do consumidor por alimentos ou produtos cujos ingredientes possam ser rotulados como “naturais” dão suporte ao desenvolvimento da área biotecnológica para produção de aromas, visto que o custo de produção é significatimente menor se comparado à extração a partir de fontes naturais (DUBAL et al., 2008; GUPTA; PRAKASH; GUPTA, 2015).

Neste sentido, há um grande interesse pela bioprodução e aplicação de compostos de aroma naturais de origem microbiana, resultando nos chamados bioaromas. O termo bioaromas é utilizado para designar aromas de origem enzimática ou fermentativa. Avanços na biotecnologia de plantas, na tecnologia enzimática, na engenharia genética, no monitoramento de bioprocessos e nas técnicas de recuperação de produtos proporcionam novas oportunidades em potencial para a biotecnologia de produção de aromas. Além de serem menos agressivos ao meio ambiente – por gerar menos resíduos não biodegradáveis - os processos biotecnológicos produzem aromas considerados naturais (BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; BICAS et al., 2010a; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017).

Por isso, torna-se interessante o desenvolvimento de aromas naturais por parte dos grupos de pesquisa acadêmicos e industriais, já que sua produção apresenta menores impactos ambientais e custos de produção, pela utilização de matérias-primas de baixo custo que são produzidas em maior escala e em geral subaproveitadas, resultantes principalmente da industrialização de alimentos, indicando a importância desses processos no desenvolvimento futuro de novos compostos naturais.

3.2. OBTENÇÃO DE COMPOSTOS DE AROMAS NATURAIS POR VIA BIOTECNOLÓGICA

Os compostos de aroma podem ser obtidos por três processos, a saber, a extração de fontes naturais, transformações químicas e por via biotecnológica (biotransformações microbiológicas e enzimáticas). Esta última é bastante atrativa por oferecer vários produtos e por ser um processo mais limpo (CALAZANS, 2012; MOLINA et al., 2015; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017). A obtenção de aromas da natureza é realizada pela extração de plantas, embora apresentem desvantagens como a obtenção do produto de interesse com baixos rendimentos, o alto custo do processo, a sazonalidade, problemas envolvendo a extração como possíveis fatores ecológicos e variações na qualidade do produto final (BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; GALVÃO, 2014; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017). Já os aromas obtidos por síntese química apresentam vantagens como rendimentos satisfatórios e bons índices de produção. No entanto, possuem também muitos obstáculos, como geração de resíduos não biodegradáveis e de produção de misturas de substâncias que alteram sensorialmente o aroma desejado reduzindo seu interesse econômico (BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; AKACHA; GARGOURI, 2015).

Estas desvantagens fazem com que a produção de aromas por processos biotecnológicos seja bastante interessante, pelo fato de que, em geral, resultam em menor impacto ambiental, utilizam condições brandas de processo e não estão sujeitos a variações sazonais. Outra vantagem é a alta enantioseletividade do processo, que permite a obtenção de aromas de alta pureza óptica, impactando positivamente nas características sensoriais do produto. Além de serem mais valorizados no mercado que os aditivos químicos artificiais, por serem “naturais”, já que produtos com estas características têm sido bastante procurados devido à conscientização dos consumidores em relação à alimentação e saúde (CALAZANS, 2012; AKACHA; GARGOURI, 2015; BERGER, 2015; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017).

Os métodos biotecnológicos para a produção de aromas incluem a síntese de novo (fermentação) e a biotransformação (biocatálise de precursores de aroma), sendo que ambos podem ser apoiados pela engenharia genética. A síntese de novo, termo originário do latim, significa síntese “do zero”, “do início”. Os micro-organismos são capazes de produzir uma ampla variedade de compostos de aroma - álcoois de cadeia curta, ésteres, aldeídos, cetonas, metilcetonas e ácidos, bem como pirazinas e lactonas - por vias metabólicas complexas, a partir de moléculas simples (açúcares e aminoácidos) e sem a adição de substratos ao meio. No entanto, os níveis de produção são muito pobres (< 100 mg. L-1) bem como as dificuldades enfrentadas no processo de purificação dada a complexidade da amostra, constituem um

limite para a exploração industrial. Apesar disso, algumas empresas de biotecnologia estão investindo em biologia sintética para produzir compostos de aroma. A empresa americana Amyris, Inc., por exemplo, está usando bioprocessos para a síntese de novo de sesquiterpenos como o farneseno (Biofene™) e patchouli (Clearwood™) com Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada em grande escala usando cana-de-açúcar como substrato (FERON; WACHÉ, 2006; MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007a; BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; RENNINGER et al., 2010; GALLAGE; MØLLER, 2015; SCHALK; DEGUERRY, 2015; FELIPE; BICAS, 2017; FELIPE; OLIVEIRA; BICAS, 2017). Já a biotransformação gera rendimento mais elevado e possibilita a utilização de substratos com baixo valor agregado, como os subprodutos agroindustriais (BERGER, 2009).

A biotransformação pode ser definida como o uso de sistema químico catalisado por micro-organismos ou enzimas para produzir mudanças químicas em compostos que não são seus substratos originais. Pode ser realizada pela adição do substrato durante o crescimento das células e, nesse caso, a transformação ocorre ao mesmo tempo em que o micro-organismo cresce, ou pela adição do substrato às células previamente crescidas. É possível, ainda, utilizar enzimas isoladas e, nesse caso, a reação geralmente ocorre em meio aquoso tamponado. Tanto as células íntegras quanto as enzimas podem ser utilizadas na sua forma livre ou imobilizadas. Sistemas bifásicos (fase aquosa contendo biocatalisador e fase oleosa contendo substratos/produtos) apresentam vantagens para os casos em que o substrato é tóxico ou pouco solúvel em água (TONIAZZO et al., 2005; BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; BIER, 2011).

A biotransformação utilizando células previamente crescidas pode eliminar ou minimizar a inibição pelo substrato. Consiste de duas etapas: na primeira, o micro-organismo é crescido em meio adequado, com elevada formação de biomassa e separado do meio por centrifugação ou filtração. Na segunda etapa, a biomassa é transferida para um meio próprio para a biotransformação. Este processo apresenta algumas vantagens, como menor tempo de transformação, maior concentração de substrato (efeitos tóxicos do substrato podem ser minimizados), controle mais fácil de reações e facilidade na extração e purificação do produto. A reutilização de biocatalisadores também é possível, especialmente se estiverem imobilizados (MEDEIROS; AVERY; AVERY, 2002). No entanto, alguns desafios e limitações precisam ser superados para obtenção de alta produtividade na biotransformação como a instabilidade química, baixa solubilidade em água, alta volatilidade e inibição do processo por substratos xenobióticos, metabólitos intermediários e produtos finais. Estas substâncias geralmente interferem em importantes processos metabólicos, incluindo

transporte celular, geração de energia, síntese e reparo de DNA, síntese de proteínas e danos na membrana celular, levando a uma diminuição da viabilidade celular. Além disso, os rendimentos obtidos na maioria dos processos ainda são insuficientes para uma aplicação em escala industrial (VAN DE WERF; DE BONT; LEAK, 1997; BERGER, 2009; LING et al., 2013; LO et al., 2013).

A seleção das condições de cultivo e do método de biotransformação deve ser realizada buscando sempre a melhor condição para crescimento do micro-organismo e a realização da reação. O fator crucial para a execução da biotransformação é identificar cepas de micro-organismos resistentes às condições deste processo e que possam utilizar diferentes substratos como fonte de carbono para a produção de metabólitos desejáveis e em quantidades satisfatórias. Fungos filamentosos, bactérias e leveduras oriundos de diversas fontes como, por exemplo, solo, resíduos agroindustriais, frutos exóticos e sementes podem ser utilizados para a produção de aromas. Nos últimos anos tem-se dado especial importância aos micro-organismos endofíticos, pois são potenciais fontes de produtos naturais de interesse na medicina, agricultura e indústria (STROBEL et al., 2004; BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; MOLINA et al., 2013; ABRAHÃO; MOLINA; PASTORE, 2013). Além disso, as condições de processo como composição do meio de cultura, pH, temperatura de incubação, aeração e agitação são fatores importantes que vão influenciar no tipo e na quantidade de aroma produzido (ROTTAVA et al., 2010).

A inclusão de etapas de biotransformação usando micro-organismos ou enzimas isoladas (lipases, proteases, glicosidases, isomerases etc.) propiciou um aumento significativo das sínteses realizadas em escala laboratorial. A utilização da biotransformação permitiu a introdução de reações catalizadas por enzimas com controle régio e estereoquímico, gerando compostos opticamente puros, além do desenvolvimento de rotas mais eficientes. As biotransformações empregando micro-organismos, ou seja, células íntegras, como bactérias, leveduras e fungos filamentosos, apresentam vantagens em relação ao uso de enzimas isoladas, pois os micro-organismos apresentam rápido crescimento e fácil formação do sistema multienzimático, além da facilidade de desenvolvimento experimental e possibilidade de reutilização das células microbianas. As células íntegras destes micro-organismos contêm enzimas com diferentes estruturas, responsáveis por catalisar diversas reações, destacando-se as hidrolases como a mais utilizada para produção de aromas (FABER, 2004).

Apesar dos elevados custos da aplicação de enzimas isoladas na produção de aromas, estas podem oferecer alta seletividade para a conversão de um determinado substrato. Reações que são efetuadas por enzimas isoladas de células - oxidação, redução, reações

hidrolíticas, formação de novas ligações C-C e reações de degradação - são altamente específicas ao substrato, permitindo reconhecê-lo de formas régio e enantioseletiva, sendo, portanto, capazes de realizarem reações não acessíveis por processos químicos clássicos (PETERSEN, 2006; PANDEY et al., 2008). Desta forma, os produtos obtidos por biotransformação, em geral, apresentam maior pureza enantiomérica em função da capacidade enantioseletiva apresentada por sistemas biológicos (WACHÉ; DIJON, 2013).

3.3. COMPOSTOS TERPÊNICOS 3.3.1. Definição geral

Os vegetais sintetizam substâncias que são divididas, didaticamente, em dois grandes grupos: metabólitos primários, como a celulose, lignina, proteínas e outras substâncias, que são originadas do metabolismo primário, que realizam suas principais funções vitais e que fazem parte da atividade celular de praticamente todos os seres vivos e os metabólitos secundários, originados do metabolismo secundário, que são substâncias de baixo peso molecular, geralmente produzidas em pequenas quantidades, que possuem características químicas muito variadas e, às vezes, bem complexas, mas nem por isso menos importante (DEWICK, 2002). Os metabólitos secundários despertam grande interesse pelas atividades biológicas exercidas nas plantas em resposta aos estímulos do meio ambiente e também pela sua grande atividade farmacológica. Muitos são de importância comercial nas áreas farmacêutica, alimentícia, agronômica, perfumaria e outras (PEREIRA, 2006).

Os compostos terpênicos constituem o maior grupo de metabólitos secundários conhecidos, com mais de 40.000 substâncias já identificadas. As diversas substâncias desta classe são sintetizadas através da rota do ácido mevalônico a partir da condensação de uma unidade de acetocetil-CoA e acetil-CoA, seguida de uma hidrólise, formando o 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA (HMGCoA). Em seguida, o HMGCoA é reduzido por um processo dependente de NADPH e catalisado pela HMGCoA-redutase a mevalonato. O mevalonato então é convertido em isopentil-pirofosfato (IPP) e seu isômero dimetilalilpirofosfato (DMAPP). A produção de IPP pode também ocorrer no cloroplasto pela via 1-deoxi-xilulose (DXP), iniciando com a condensação de uma molécula de piruvato a outra D-gliceraldeído-3-fosfato, formando 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato, após reações sucessivas, a molécula de IPP e DMAPP são formadas. Estas moléculas, formadas em ambas as vias, condensam-se e originam o trans-geranilpirofosfato (GPP), o qual é convertido em diferentes monoterpenos. Os terpenos e terpenóides mais simples (mono e sesquiterpenos/terpenóides)

são amplamente utilizados na indústria de aromas e são os principais constituintes dos óleos essenciais (DEWICK, 2002; DZUBAK et al., 2006; BICAS et al., 2010a; SIMÕES et al., 2010).

Do ponto de vista químico, são substâncias hidrofóbicas, armazenadas em canais de resina, células de óleos essenciais ou mesmo tricomas glandulares, contendo ou não oxigênio que, devido à origem biossintética são constituídos de unidades básicas de isopreno (2-metil-1,3-butadieno, C5H8). A união de duas moléculas de isopreno pode ocorrer de três

maneiras diferentes: cabeça-cabeça, cabeça-cauda e cauda-cabeça. Nos monoterpenos, classe formada por uma grande variedade de substâncias encontradas na natureza, a conexão normalmente encontrada entre as unidades de isopreno é a cabeça-cauda (Figura 1), embora existam algumas exceções para este arranjo (KIRK-OTHMER, 1983; LOOMIS; CROTEAU, 2014).

Figura 1. Representação da formação estrutural do limoneno. Fonte: Meireles (2013).

Assim, os compostos terpênicos podem ser classificados de acordo com o número de unidades de isopreno que possuem (Tabela 1). Outra forma de classificação dos compostos terpênicos refere-se à ciclização ou não da cadeia e ao número de anéis na molécula. Assim, podem ser caracterizados como acíclicos (cadeia aberta), monocíclicos (um anel), bicíclicos (dois anéis), tricíclicos (três anéis), etc., podendo ser oligômeros de isopreno e também isômeros saturados ou parcialmente saturados, bem como derivados oxigenados, como alcoóis, aldeídos, cetonas, fenóis, éteres e ésteres, podendo estes ser denominados “terpenóides” (derivados dos terpenos). Uma única planta pode sintetizar muitos compostos terpênicos diferentes, em diferentes órgãos, para uma grande variedade de propósitos e em

épocas diferentes, ao longo do seu desenvolvimento (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997; DEWICK, 2002; HILL; CONNOLLY, 2012; KRIVORUCHKO; NIELSEN, 2014).

Tabela 1. Classificação dos terpenos, com base no número de subunidades de isopreno.

Unidades de isopreno Átomos de Carbono Classificação

1 5 Hemiterpeno 2 10 Monoterpeno 3 15 Sesquiterpeno 4 20 Diterpeno 5 25 Sesterpeno 6 30 Triterpeno 8 40 Tetraterpeno 10 ou > 10 50 ou > 50 Politerpeno

Fonte: Adaptado de Mikami (1988).

O Brasil é um dos maiores exportadores mundiais de terpenos. Os terpenos de ocorrência natural são constituintes principais de óleos essenciais (Tabela 2) e representam uma matéria-prima renovável comercialmente importante para as indústrias farmacêuticas, de perfumes, de flavorizantes, agroquímicas, cosméticos e de aromas, além de intermediários sintéticos versáteis, podendo ser usados na síntese de produtos quirais. Os monoterpenos e sesquiterpenos, com estruturas terpênicas de menor massa molecular, apresentam volatilidade acentuada. Essa última característica, por sua vez, apresenta grande importância para o aroma dos produtos naturais, particularmente de frutas cítricas, ervas aromáticas, especiarias e condimentos (SELL, 2006; FARKAS; MOHÁCSI-FARKAS, 2014; FELIPE; BICAS, 2017).

Tabela 2. Principais constituintes de alguns óleos vegetais

Óleo essencial Composição

Alecrim Monoterpeno (α-pineno, β-mirceno, canfeno), monoterpenoide (1,8 cineol, borneol, geraniol), outros compostos (verbenona).

Bergamota Ésteres de álcoois monoterpênicos (linalil acetato, neril acetato, geranil acetato); monoterpenos (limoneno, β-pineno, γ-terpineno); monoterpenoides (linalol, geraniol, geranial, neral).

Capim citronela Monoterpeno (limoneno), monoterpenoide (β-citronelol, nerol, α-terpinoleno) outros compostos (citronelal).

Casca de laranja Monoterpenos (limoneno, mirceno); sesquiterpenoides (β-sinensal, α-sinensal), sesquiterpeno (valenceno); monoterpenoides (decanal, linalol, neral, geranial, citronelal), outros compostos (octanal).

Gengibre Sesquiterpenos (zingibereno, AR-curcumeno, β-sesquifelandreno, bisaboleno); monoterpenos (canfeno, β-felandreno), monoterpenoide (1,8-cineol)

Hortelã pimenta Monoterpenoide (isomentona, (−)-mentol, (−)-mentona, 1,8-cineol, mentofurano); monoterpeno (limoneno), álcoois (octan-3-ol, oct-1-en-3-ol).

Limão Monoterpenos (limoneno, β-pineno, γ-terpineno); monoterpenoides (geranial, neral, citronelal, linalol); outros compostos (neril acetato, geranil acetato, nonanal).

Melaleuca Monoterpeno (limoneno, α-terpineno, γ-terpineno, α-terpinoleno, p-cimeno), monoterpenoide (1,8-cineol, terpinen-4-ol, α-terpineol)

Pimenta Monoterpeno (sabineno).

Pinus Monoterpenos (pinenos, car-3-eno, limoneno, mirceno). Terebintina Monoterpenos (α-pineno, canfenos)

Adaptado de: Margetts (2005); Baser e Demirci (2007); Ribeiro et al. (2012); Felipe e Bicas (2017).

3.3.2. Importância da estereoisomeria no estudo de compostos terpênicos

A quiralidade está presente em muitas moléculas orgânicas, inclusive nos óleos essenciais. Este fenômeno ocorre quando um átomo de carbono está ligado a quatro diferentes grupos funcionais. Carbonos desse tipo são chamados de assimétricos ou quirais e as moléculas são denominadas moléculas quirais (ASZTEMBORSKA; OCHOCKA, 2002; McMURRY, 2011; SOLOMONS; FRYHLE, 2012).

A isomeria pode ser dividida em dois tipos principais (Figura 2): i) plana ou constitucional (isômeros de cadeia, de posição, de função, de compensação e tautomeria) e ii) espacial ou estereoisomeria (isomeria geométrica ou cis-trans e isomeria óptica). Os estereoisômeros têm seus átomos conectados na mesma sequência (mesma constituição), mas

diferem no arranjo de seus átomos no espaço, e podem ser subdivididos em duas categorias: aqueles que são enantiômeros entre si e aqueles que são diasteroisômeros entre si. Os enantiômeros são estereoisômeros cujas moléculas são imagens especulares não sobreponíveis entre si e os diastereoisômeros são estereoisômeros cujas moléculas não são imagens especu-lares entre si (SOLOMONS; FRYHLE, 2012).

Figura 2. Subdivisão dos isômeros.

Fonte: Adaptado de Solomons e Fryhle (2012).

Os enantiômeros são tipos de isômeros que ocorrem em moléculas quirais, ou seja, moléculas cuja imagem não é sobreponível, mas é simétrica em relação a um plano e apresentam desvios polarimétricos opostos e de mesma magnitude. Podem ser encontradas na forma de mistura racêmica, quando os enantiômeros estão em igual proporção, sendo oticamente inativa, ou estar em excesso de uma de suas formas (ASZTEMBORSKA; OCHOCKA, 2002; SOLOMONS; FRYHLE, 2012).

Esses isômeros possuem algumas propriedades físicas semelhantes, como solubilidade, densidade e ponto de fusão. No entanto apresentam diferenças quanto ao aroma, sabor, toxicidade, atividade biológica e atividade ótica. Com base na atividade ótica, se o desvio da luz polarizada for para a direita, os isômeros são denominados dextrógiros,

ISÔMEROS

(Compostos diferentes com a mesma fórmula molecular).

Isômeros Constitucionais (Isômeros cujos átomos têm conectividades diferentes).

Estereoisômeros

(Isômeros que tem a mesma conectividade, mas que diferem no arranjo espacial de seus átomos).

Enantiômeros (Estereoisômeros que são imagens especulares não sobreponíveis um do outro).

Diasteroisômeros (Estereoisômeros que não são imagens especulares um do outro).

representados por (d) ou (+); se o giro for para esquerda, são chamados de levógiros (l) ou (-). Também pode ser denotado pela ordem decrescente de prioridade do número atômico do(s) átomo(s) ligado(s) ao carbono quiral. Se a configuração for ao sentido horário em torno do carbono, é designado como R- (“rectus”); se a configuração for anti-horária, é indicado por S- (“sinister”). Esta última notação (R, S) é comumente utilizada para estabelecer a configuração absoluta dos enantiômeros e foi desenvolvida por Can-Ingold-Prelog (Robert S. Can, Christopher Ingold e Vladimir Prelog) em 1966 e adotado pela International Union of Pure

and Applied Chemistry (IUPAC) (IUPAC, 1997; McMURRY, 2011; SOLOMONS;

FRYHLE, 2012).

A atividade biológica de substâncias opticamente ativas não é idêntica para ambos os enantiômeros. Um modelo explicativo deste é a teoria dos três pontos: a formação do complexo enzima-substrato só é possível para o enantiômero que possui três pontos corretamente posicionados para ocorrer interação com o sítio ativo da enzima (Figura 3) (BRUICE, 2003). A existência de enzimas e receptores estereoespecíficos no organismo conduz às características biológicas diferentes para compostos com estruturas quirais. Tais características são de extrema importância biológica, uma vez que a maioria dos receptores endógenos dos fármacos e compostos bioativos também é composto quiral (THALL, 1996).

Figura 3. Diagrama esquemático da interação de moléculas quirais com enzimas receptoras. Teoria dos três pontos. Fonte: Rinaldo (2010).

Como os nossos receptores são feitos de proteínas quirais, dois enantiômeros de um composto quiral, similares em suas estruturas químicas, podem diferir substancialmente em suas atividades biológicas. Como exemplo clássico da importância da quiralidade na indústria farmacêutica encontra-se o caso da talidomida, comercializada como mistura

Enantiômero R Enantiômero S

racêmica, na década de 1960, como sedativo e analgésico. Após a tragédia causada por esse fármaco, em razão do enantiômeros S-(-) apresentar efeitos teratogênicos, levando à má formação de milhares de fetos humanos, novos modelos de estudos para fármacos quirais foram desenvolvidos (CALDWELL, 1995; BARREIRO; FERREIRA; COSTA, 1997; SILVA JÚNIOR et al., 2006).

A detecção de aromas envolve a interação de moléculas voláteis quirais com os receptores nasais. Por este motivo, dois enantiômeros de um monoterpeno podem dar diferentes impressões olfatométricas. O S-(-)-limoneno e R-(+)-limoneno, por exemplo, encontrados nas cascas de frutas cítricas, possuem odores de limão e laranja, respectivamente;

S-(+)-carvona apresenta aroma de hortelã, enquanto R-(-)-carvona possui odor de sementes de

pinheiro. O R-(+)-α-terpineol possui aroma floral, enquanto que o S-(-)-α-terpineol possui um odor conífero. (ASZTEMBORSKA; OCHOCKA, 2002; HARRATHI et al., 2012; PORTE; PORTE; OLIVEIRA, 2014; REZENDE; AMAURO; RODRIGUES FILHO, 2016).

Os aromas são resultantes de misturas complexas de substâncias voláteis e geralmente consistem de centenas de substâncias de funções orgânicas diferentes, e entre elas os terpenos enantioméricos. Eles são geralmente limitados a monoterpenos, sesquiterpenos e, em raras ocasiões, diterpenos. Como os enantiômeros de um composto podem apresentar ca-racterísticas de odor distintas, é fundamental a utilização de técnicas que permitam a elucidação da configuração absoluta (R ou S) presente, bem como o conhecimento da proporção e da pureza enantiomérica destes compostos no alimento. A proporção enantiomérica é dada normalmente pelo excesso enantiomérico (ee) das substâncias quirais, definido por (R - S)/(R + S) x 100, onde R e S são as quantidades relativas dos enantiômeros R e S. Enquanto que a concentração do excesso enantiomérico é a diferença entre os percentuais dos dois enantiômeros, a pureza enantiomérica é definida como a proporção (expressa em percentagem) dos enantiômeros detectados (ELIEL; WILEN; MANDER, 1994; ASZTEMBORSKA; OCHOCKA, 2002; TEMBA; OLIVEIRA; DONNICI; 2003; PORTE; PORTE; OLIVEIRA, 2014).

3.3.3. Limoneno

O limoneno, de nomenclatura IUPAC 1-metil-4-isopropenilciclohex-1-eno, é um hidrocarboneto monoterpênico cíclico insaturado (C10H16, MM = 136,24 g. mol-1). Por

apresentar um carbono quiral no anel ciclo-hexeno, muitas espécies de plantas podem biossintetizá-lo nas formas de seus enantiômeros (Figura 4) e na forma racêmica. Limoneno (em ambas as formas enantioméricas) já foi encontrado nos óleos essenciais de mais de 300

espécies de plantas (DNP, 2015), incluindo laranja, limão, hortelã e árvores coníferas, sendo a prevenção da desidratação e a inibição do crescimento microbiano suas funções naturais nos vegetais. O R-(+)-limoneno é encontrado em espécies de Citrus ssp, Lippia e Artemia, sendo o principal constituinte do óleo da casca de laranja (concentrações entre 90 e 97%) e do óleo essencial de alcarávia. Já o S-(-)-limoneno é encontrado principalmente no óleo da casca de limão e em óleo essencial da espécie de Mentha ssp. (ERASTO; VILJOEN, 2008; RUIZ; FLOTATS, 2014).

Figura 4. Estruturas enantioméricas do limoneno.

Mais de 60 mil toneladas de R-(+)-limoneno são recuperadas ao ano como subproduto da indústria cítrica mundial. O limoneno é geralmente extraído do óleo essencial contido na casca de laranja pela sua baixa solubilidade em água, alta tendência à autoxidação e polimerização, tornando-se um subproduto industrial adequado para bioconversões em compostos de alto valor comercial. (CARVALHO; FONSECA, 2006; MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007b; LANGE, 2015).

A disponibilidade de grandes quantidades de limoneno e o seu baixo custo (US$ 5–7/kg) (ALICEWEB, 2016) têm despertado o interesse dos pesquisadores e da indústria. Isso se explica, principalmente, pelo fato de alguns compostos medicinais e de aroma possuírem fórmulas estruturais semelhantes ao limoneno, sugerindo grande potencial para a utilização industrial desse rejeito. Por exemplo, o limoneno tem sido utilizado na produção biotecnológica de monoterpenos oxigenados bioativos. Diversos estudos foram desenvolvidos no intuito de utilizar o limoneno como substrato para a produção biotecnológica de aromas naturais de maior valor comercial como a biotransformação em álcool perílico, carvona,

S-(-)-limoneno R-(+)-limoneno

carveol e α-terpineol (TAN; DAY, 1998; DUETZ et al., 2001; MENÉNDEZ et al., 2002; TRYTEK; FIEDUREK, 2005; ROTTAVA et al., 2010; RUIZ; FLOTATS, 2014; MARMULLA; HARDER, 2014; LANGE, 2015).

3.3.4. α-terpineol

O α-terpineol (Figura 5), de nomenclatura IUPAC 2-(4-Metil-1-ciclohex-3-enil)propan-2-ol, é um monoterpenóide cíclico hidroxilado (C10H18O, MM = 154,25 g/mol),

incolor e de aroma agradável encontrado em uma grande variedade de óleos essenciais, com ampla aplicação industrial. O consumo anual do α-terpineol é estimado em, aproximadamente, 9,2 toneladas, o que representa uma ingestão individual diária de 17,2 µg/kg, nos Estados Unidos (BATHIA; LETIZIA; API, 2008; BURDOCK; FENAROLI, 2010).

Este monoterpenoide é utilizado em indústrias de produtos de perfumaria como constituinte de sabonetes e cosméticos, em indústrias de produtos de limpeza como repelente de insetos, desinfetante e aromatizante, em indústrias farmacêuticas como antifúngico e antisséptico, sendo aprovado como substância GRAS (Generally Recognized as Safe – GRAS 3045). O uso do α-terpineol em alimentos, geralmente em uma faixa de 10-25 ppm, incluem produtos cozidos, gomas de mascar, condimentos, produtos lácteos, doces e bebidas. Devido a essa enorme demanda, o α-terpineol utilizado no mercado mundial é obtido, em grande parte, por via sintética, e vários métodos para tal são disponíveis, com especial destaque àqueles que utilizam pinenos ou a própria terebintina como materiais de partida (BAPTISTELLA et al., 2009; BICAS et al., 2010a; BURDOCK; FENAROLI, 2010; DIONÍSIO et al., 2012).

Figura 5. Estruturas enantioméricas do α-terpineol.

O α-terpineol apresenta duas formas isoméricas (Figura 5), que vão determinar suas propriedades de aroma: R-(+)-α-terpineol, de aroma floral intenso, e S-(-)-α-terpineol, presente na espécie Pinus palustris Mill., em concentração menor de 60% em seu óleo essencial, que possui um odor caracteristicamente conífero. Apesar do α-terpineol ocorrer em muitos óleos essenciais, apenas pequenas quantidades são isoladas. Está presente em concentrações de 3 a 4% em óleos essenciais de Melaleuca alternifolia, Salvia officinalis e

Carthamus tinctorius (HARRATHI et al., 2012), bem como nos óleos essenciais de laranja

(grapefruit), bergamota e lima em concentrações variáveis (BAUER; GARBE; SURBURG, 2001; ROTTAVA et al., 2010). O α-terpineol está comercialmente disponível como mistura racêmica (mistura em quantidades iguais dos isômeros óticos), recuperado como subproduto da indústria de celulose e papel (CADWALLADER; BRADDOCK; PARISH, 1992).

Uma das mais recentes tendências é a produção de α-terpineol natural pela biotransformação do limoneno, α-pineno ou β-pineno. A biotransformação de limoneno para α-terpineol como principal produto já foi descrita por fungos filamentosos Cladosporium,

Penicillium digitatum, Aspergillus niger e Fusarium oxysporum. Para as bactérias, este

caminho de conversão tem sido relatado em Pseudomonas gladioli, Escherichia coli,

Pseudomonas fluorescens e Sphingobium spp. (BICAS et al., 2008; 2010bc; TAI et al., 2016).

Em todos os casos, o processo é altamente enantioespecífico, mas a concentração do produto depende das condições da reação (KRAIDMAN; MUKHERJEE; HILL, 1969; BICAS; DIONÍSIO; PASTORE, 2009; BICAS et al., 2010b).

3.4. BIOTRANSFORMAÇÃO DE LIMONENO EM α-TERPINEOL

O limoneno tornou-se um dos precursores mais estudados em experimentos de bioconversão para a produção de derivados de alto valor, o que pode revelar-se uma boa estratégia para o enriquecimento do valor comercial dos subprodutos da agroindústria, como óleo de casca de laranja. O limoneno pode ser biotransformado em monoterpenos oxigenados como o α-terpineol, que é um monoterpenoide que tem um valor agregado significativamente maior que o limoneno (MARÓSTICA JÚNIOR; PASTORE, 2007a; BURDOCK; FENAROLI, 2010; MARMULLA; HARDER, 2014).

Há progressos no campo da biotransformação de limoneno, especialmente no que se refere à regioespecificidade da biocatálise por micro-organismos. Maróstica Júnior e Pastore (2007b) e Bicas et al. (2008) expuseram as seis principais reações químicas da biotransformação do limoneno (Figura 6): (1) a oxidação de carbono 7 do limoneno a