CAPÍTULO IV: RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.4 Avaliação do potencial citotóxico e antioxidante dos filmes poliméricos através de distintas formulações produzidas
Como citado anteriormente, o emprego de 20% m/m de glutaraldeído as formulações possibilitou a ocorrência do processo de reticulação, pelo menos em uma
maior extensão, entretanto, além disso, contribuiu para a compatibilização em termos de propriedades mecânicas das formulações 2.0 e 4.0 dentro do planejamento I.
O aditivo glutaraldeído tem sido questionado acerca do seu potencial citotóxico, como reportado por KARI (1993). Em se tratando de agentes reticulantes por via química, é interessante utilizá-lo, pois é bi funcionalizado, ou seja, possui os grupamentos funcionais em ambos os lados da cadeia polimérica. Outro ponto que merece ser destacado, é a sua solubilidade em água, uma vez que é comercializado como solução aquosa. Desse modo, do ponto de vista experimental trabalhar com aditivos, os quais sejam solúveis em relação ao solvente (água) empregado é importante, pois otimiza etapas e elimina por exemplo, a necessidade de compatibilizantes.
A avaliação do potencial citotóxico dos filmes poliméricos foi uma etapa importante para o trabalho, para garantir que as formulações de filmes poliméricos produzidos não são prejudiciais às células. Uma vez que poderia restringir a aplicação destes materiais, por exemplo, dentro da área de embalagens provenientes de fontes renováveis.
A Tabela 16 exibe os resultados de viabilidade celular percentual em função da concentração das amostras avaliadas.
Tabela 16:Viabilidade celular (%) em função das concentrações dos extratos analisados*. Concentração do extrato (%) Viabilidade celular (%) Controle negativo Controle positivo Formulação 2.0 Formulação 2.3 Formulação 4.0 Formulação 4.3 100 92 ± 10a 11 ± 8b 80 ± 4c 67 ± 7d 65 ± 14d 68 ± 10d 50 95 ± 10a 94 ± 3a 76 ± 4b 76 ± 2b 75 ± 1c 74 ± 6d 25 99 ± 6a 94 ± 4a 84 ± 9b 76 ± 1c 75 ± 3c 81 ± 10b 12,5 98 ± 6a 95 ± 4a 90 ± 3a 79 ± 9b 73 ± 3c 87 ± 12d 6,25 97 ± 8a 97 ± 3a 87 ± 10b 78 ± 7c 78 ± 7c 89 ± 14b
Fonte: A autora. *Valores são apresentados como médias ± desvio padrão. Linhas seguidas de letras diferentes são significativamente distintos com p≤0,05 pelo teste Tukey.
Diante dos dados da Tabela 16 foi possível observar que em concentração de 6,25% de extrato as formulações 2.0 (33,75, 21,25, 25,00, 20,00) e 4.3 (35,00/35,00/25,00/5,00) apresentaram os maiores valores de viabilidade celular com
p<0,05, em relação as outras formulações. Os valores foram estatisticamente distintos dos controles com p<0,05.
Ao dobrar a concentração de extrato, todas as formulações assumiram valores de viabilidade celular estatisticamente distinto com p<0,05 entre si, mas também em relação aos controles, com exceção da amostra de formulação 2.0.
Ao aumentar a concentração por um fator de 4 em relação à concentração inicial, ocorreu um comportamento semelhante para as formulações 2.0 e 4.3, as quais assumiram maiores valores de viabilidade celular, em comparação ao conjunto de amostras.
Em mais um incremento de concentração (50%), as formulações apresentaram valores médios próximos entre si, conforme pode ser visto na Tabela 16. Contudo, quando se atinge o valor máximo para o extrato (100%) a formulação 2.0 ainda se destaca dentre as demais devido ao maior valor de viabilidade celular. As demais formulações 2.3, 4.0 e 4.3 se mostraram idênticas do ponto de vista da estatística com (p>0,05).
Diante de toda a análise destes resultados, foi possível observar que houve de certo modo uma flutuação em relação ao valor numérico estimado para a viabilidade celular, à medida que se aumentou progressivamente os teores de extrato produzido a partir das formulações de filmes poliméricos. Contudo, a amostra de formulação 2.0 (33,75, 21,25, 25,00, 20,00) foi a que mais se destacou considerando, que através deste parâmetro, permite-se avaliar a preservação das células após a realização do ensaio.
Esse resultado foi bastante interessante, pois, o teor mais elevado de glutaraldeído (20%) não foi prejudicial as células, dentro das condições de análise “in
vitro”. Foi possível a construção de um diagrama, no qual se avalia conjuntamente os
valores de viabilidade celular como função da concentração do extrato, para a estimativa do parâmetro IC50, ou seja, a concentração de amostra necessária para levar à lise ou morte celular, conforme pode ser visto na Figura 56.
Figura 56: Avaliação do potencial citotóxico dos filmes poliméricos. 0,0 12,5 25,0 37,5 50,0 62,5 75,0 87,5 100,0 0 25 50 75 100 V iab ilida de c elula r (%) Concentraçăo do extrato (%) Controle negativo Controle positivo Formulaçăo 2.0 Formulaçăo 2.3 Formulaçăo 4.0 Formulaçăo 4.3 IC50 Fonte: A autora.
A análise comparativa do aumento na concentração do extrato produzido com os filmes poliméricos permite estimar o parâmetro IC50, ou seja, o teor de amostra necessário para ocasionar a morte de 50% das células. O controle positivo apresentou IC50 estimado em 76%. Todas as amostras apresentaram IC50 superior ao controle indicando que este conjunto de amostras possui baixa citotoxicidade, o que está de acordo com a manutenção em termos de viabilidade celular para as formulações.
Após o conhecimento, do baixo potencial citotóxico das amostras, foi interessante analisar o potencial antioxidante tanto para a matriz de hidrocoloide, quanto para a matriz de pectina de maçã, assim como para os aditivos isoladamente, e consequentemente de todo o conjunto, isto é, das formulações dos filmes poliméricos.
Um dos objetivos ao se propor o estudo de obtenção e caracterização da matriz de hidrocoloide, obtida a partir da semente de chia, foi justamente conseguir um material polimérico diversificado, passível de ser empregado na produção de filmes poliméricos, os quais estivessem intrinsecamente em sua composição compostos com potencial antioxidante.
Nesse sentido, como já apresentado no CAPÍTULO I, há registos na literatura em duas frentes isoladas: estudo de obtenção e caracterização do hidrocoloide como uma fonte alternativa de material polimérico, proveniente de fontes renováveis (MUÑOZ et
al., 2012a; DICK et al., 2015; ORIFICI et al., 2018; VELÀZQUEZ-GUTIÉRREZ et al.,
2015) e em contrapartida o estudo da semente de chia (IXTAINA et al., 2011; MUÑHOZ
et al., 2012b; COOREY; TJOE; JAYASENA, 2014.) e suas propriedades. Contudo,
encontrou-se um limiar no qual este trabalho poderia ser enquadrado, isto é, o estudo de produção de um material polimérico passível de ser empregado como matriz polimérica dentro da produção de filmes com potencial antioxidante.
Para isso, fez-se necessário não trabalhar com solventes orgânicos, como o metanol, os quais seriam interessantes para a maximização em termos da extração destes compostos antioxidantes de interesse. Porém, tem-se em contrapartida o potencial citotóxico deste solvente, e mais que isso, a presença de um meio apolar não permite a obtenção do hidrocoloide, ou seja, as sementes não intumescem, permanecem intactas.
Diante deste impasse, prevaleceu o objetivo de se trabalhar somente com extração aquosa, pois, já era de conhecimento que as formulações dos filmes poliméricos apresentavam baixa toxicidade, e em relação a este quesito não seria interessante adicionar mais variáveis, as quais poderiam aumentar consideravelmente a citotoxicidade dos materiais produzidos, inviabilizando qualquer potencial de aplicação prática.
A metodologia empregada foi o método DPPH, no qual foi possível estimar a AA conforme apresenta a Figura 57.
Figura 57: Atividade antioxidante para as matrizes, aditivos e para as formulações de filmes poliméricos utilizando o ensaio de DPPH.
Hidrocoloide Pectina Glicerol Glutaraldeído Formulação 2.0 Formulação 2.3 Formulação 4.0 Formulação 4.3 0 10 20 30 40 50 60 70 h g f e d c b Atividade antioxidante (%) A mo s tr a s a
Fonte: A autora. *Valores são apresentados como médias ± desvio padrão. Colunas seguidas de letras diferentes são significativamente distintos com p≤0,05 pelo teste Tukey.
De acordo com a Figura 57, a metodologia empregada somente com água destilada conduziu a um resultado satisfatório do ponto de vista dos valores de AA para a matriz de hidrocoloide, com 59,5 ± 0,6%. A matriz de pectina de maçã também exibiu AA, em torno de 18,6 ± 0,2%. Os aditivos, glicerol e glutaraldeído, também exibiram AA em 15,7 ± 4,7% e 27,3 ± 1,5% respectivamente.
ORONA-TAMAYO, VALVERDE; PAREDES-LÓPEZ (2017) mostraram que na composição química das sementes de chia (fonte de partida para a obtenção do hidrocoloide) há concentrações significativas de ácidos gálico, cafeico, clorogênico, ferúlico e rosmarínico; miricetina, quercetina e kaempferol, responsáveis pela AA observada para o hidrocoloide.
SAMOUT et al. (2016) avaliou o potencial antioxidante de pectina de maçã (não foram encontradas informações acerca do GE e massa molar) através da curva de AA em função de distintas concentrações de soluções de pectina de maçã diluídas. Ao se analisar comparativamente a solução utilizada neste trabalho na concentração de 0,02 g mL-1 na curva obtida experimentalmente por estes autores, os resultados de AA foram próximos a 20%. Resultado este, muito semelhante ao obtido neste trabalho (18,6 ± 0,2%).
Em relação aos aditivos, é importante destacar que estes foram analisados em sua forma pura. Entretanto, ao serem incorporados durante a etapa de preparo dos filmes, estes são solubilizados no solvente, e dessa forma acredita-se que a AA seja minimizada.
Em relação às formulações dos filmes poliméricos, houve uma alteração em relação aos valores de AA. Todas as amostras apresentaram bons resultados em termos de AA com valores mínimos para a formulação 2.3 (40,4 ± 1,7%) e máximos para as formulações 4.0 (63,1 ± 0,3%), e 4.3 (59,0 ± 0,4%).
Visando selecionar amostras nas quais houve uma maximização em termos de AA, as amostras de formulação 4.0 (41,25/13,75;25,00/20,00) e 4.3 (37,50/37,50/25,00/5,00) puderam ser destacadas. Dessa forma, os resultados permitem inferir que, não somente a matriz de hidrocoloide contribui para a AA, mas sim, o conjunto de todos os componentes da blenda.
Após a seleção das formulações 4.0 e 4.3 estimou-se o CE50, isto é, a quantidade necessária de amostra para consumir 50% do DPPH. Para isso, o ensaio de DPPH foi realizado com distintas concentrações de soluções preparadas dos filmes, conforme exibe a Figura 58.
Figura 58: Curvas de CE50 em função da concentração de amostra para a formulação 4.0 (a) e 4.3 (b) respectivamente. 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dados experimentais Fit linear A tivi dad e anti oxi dan te (%) Concentraçăo (g mL-1) Y= 5,5018+2805,5158*X R2= 0,9964
a)
Formulaçăo 4.0 (41,25/13,75/25,00/20,00) 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Y= 16,2527+ 2012,36*X R2= 0,9827 Dados experimentais Fit linearb)
A tivi da de an tioxi da nte (%) Concentração (g mL-1) Formulação 4.3 ( 37,50/37,50/25,00/5,00) Fonte: A autora.Conforme a Figura 58 ambas as formulações apresentaram correlação linear à medida que se aumentou a faixa de concentrações investigadas. O parâmetro CE50 estimado para as amostras 4.0 e 4.3 foram: 0,0159 ± 0,0010 g mL-1 e 0,0168 ± 0,0020 g mL-1 respectivamente. Do ponto de vista da estatística estes valores não são diferentes
(p<0,05), assim, independentemente da formulação empregada ambas possuem potencial antioxidante devido à capacidade de doação do átomo de hidrogênio ao radical DPPH, representados pelos baixos valores de CE50.
As caracterizações que foram realizadas conduziram a bons resultados em termos de propriedades mecânicas, morfológicas e características adicionais como AA e não toxicidade (citotoxicidade). Contudo, para uma adequada caracterização das amostras, mas também para o entendimento acerca de outras propriedades, tais como as de transportes e térmicas, outras técnicas de caracterização e ensaios foram realizados, cujos resultados serão apresentados na sequência.
4.5 Avaliação das propriedades de barreira dos filmes poliméricos: permeação aos