Bioensaios in vitro com Rhipicephalus sanguineus

Os ensaios biológicos com carrapatos foram executados com supervisão do Prof. Dr. Gervásio Henrique Bechara, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) de Jaboticabal (SP) e da Profa. Dra. Maria Izabel Camargo Mathias, do Instituto de Biociências Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) de Rio Claro (SP). Para o desenvolvimento do experimento, o projeto foi submetido ao Comitê de Ética e Pesquisa Animal da Universidade Estadual Paulista, campus de Rio Claro (SP). O parecer encontra-se em Anexo.

Para a obtenção das fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus, foram utilizados coelhos (Oryctolagus cuniculis) com seis meses de idade da raça New Zealand, pesando entre 2,0-3,0 Kg. Cada animal foi infestado com 30 casais de adultos, alocados em câmaras de alimentação confeccionadas com tecido especial e fixadas com cola atóxica no dorso depilado dos animais (BECHARA et al., 1995). Os coelhos foram mantidos individualmente em gaiolas de contenção dentro de uma sala com controle térmico e exaustão, recebendo cuidados diários como a troca de água, reabastecimento de ração (Purina®) e limpeza.

4.14.1. Teste de imersão de formas adultas (TIA)

Grupos de 10 fêmeas de Rhipicephalus sanguineus, escolhidas aleatoriamente, foram imersas por 5 minutos em placas de Petri contendo 10,0 mL das respectivas diluições do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%): 12,5, 25,0, 50,0 e 100,0

mg/mL, utilizando-se solução de Triton X-100 1,25% (v/v) como controle negativo, uma vez que o EtOH 70% mostrou-se tóxico em teste executado preliminarmente. Também foram executados testes com o óleo essencial de partes aéreas de T. patula (OE) nas seguintes concentrações: 0,04% (0,292 mg/mL), 0,4% (2,92 mg/mL), 1,0% (7,3 mg/mL) e 4,0% (29,2 mg/mL).

Os carrapatos foram retirados das soluções, secos gentilmente sobre papel toalha e alocados individualmente em microplacas estéreis de 24 poços. Após, essas microplacas foram incubadas a 27-28 °C e 70-80% de UR (12/12 h fotoperíodo). Depois de duas semanas, o número de fêmeas que ovipuseram foi determinado. Os ovos foram coletados, pesados e, posteriormente, colocados em tubos de ensaio, os quais foram incubados nas mesmas condições previamente descritas (RIBEIRO et al., 2008) (Figura 13). O cálculo da porcentagem de inibição da oviposição foi feita de acordo com as seguintes equações, propostas por Sabatini et al. (2001):

Equação 4: IO (índice de oviposoção) = Massa dos ovos postos (g)/ Massa das fêmeas (g)

Equação 5: (%) de inibição de oviposição = IO (controle) – IO (grupo tratado) x 100/ IO (controle)

FIGURA 14. Procedimento experimental para o teste de imersão de adultos. (A) Imersão de fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus na solução-teste; (B) Secagem dos carrapatos em papel toalha; (C) Alocação dos carrapatos individualmente em microplaca de 24 poços para posterior incubação em estufa BOD (27-28 °C, 70-80% UR, 12/12 h fotoperíodo); (D) Massas de ovos ovipostos pelas fêmeas de R. sanguineus; (E) Incubação das massas de ovos em tubos de ensaio (BOD, 27-28 °C, 70-80% UR); (F) Tubos de ensaio após eclosão das larvas.

Ao final da terceira semana, a taxa de eclosão larval foi estimada procedendo-se a contagem em lupa. A eficácia dos extratos foi calculada seguindo-se o proposto por Drummond et al. (1973) (Equações 6 e 7):

Equação 6: ER = [Massa dos ovos (g) x (%) Eclosão x 20000*] / Massa das fêmeas (g) Equação 7: EP = [ER (grupo controle) – ER (grupo tratado) x 100] / ER (grupo controle)

Onde:

ER = eficiência reprodutiva; EP = eficiência do produto; * = número de larvas que se tem, aproximadamente, em 1,0 g de ovos (número obtido experimentalmente).

A B C

4.14.1.1. Cinética de ação do extrato PAEtOH70% no teste de imersão de adultos

A fim de se determinar até que ponto o tempo de exposição dos carrapatos na solução- teste contribui com os resultados obtidos, foi realizado o ensaio de imersão de fêmeas adultas ingurgitadas com o extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (50,0 mg/mL) durante 10, 30 e 60 minutos. As condições do teste foram idênticas às descritas anteriormente para t = 5 minutos.

4.14.2. Teste de Imersão Larval (TIL)

O teste foi executado em triplicata seguindo-se o protocolo proposto por Shaw (1966), com algumas modificações. Aproximadamente 0,01 g de ovos embrionados foram colocados individualmente em saquinhos de tecido TNT (6,0 cm x 6,0 cm) e incubados em estufa BOD a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por três semanas. Após este período de eclosão, foram recolhidas cerca de 200 larvas viáveis, e transferidas para novos saquinhos. O procedimento consistiu em despejar o conteúdo do pacote, previamente refrigerado a -8 °C, por 1 minuto, no centro de uma placa de Petri, mantida sobre um recipiente com água e detergente, de maneira a prevenir que as larvas escapassem pelo laboratório. Sob efeito da baixa temperatura ao qual ficaram submetidas, as larvas permaneceram temporariamente imóveis, o que possibilitou sua realocação. Estes novos saquinhos foram imersos por 5 minutos em placas de Petri contendo cerca de 20,0 mL das respectivas diluições do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%): 12,5, 25,0, 50,0 e 100,0 mg/mL,

utilizando-se água destilada como controle negativo. Em seguida, os saquinhos foram deixados sobre papel de filtro até completa secagem. Após este procedimento, os saquinhos foram incubados a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por 48 horas (Figura 14). Larvas vivas e mortas foram contabilizadas para cálculo da taxa de mortalidade corrigida (Equação 8), de acordo com a fórmula de Abbott (ABBOTT, 1925), recomendada pela Food Agriculture Organization of the United Nations (FAO, 2004):

Equação 8: (%) Mortalidade (corrigida) = [(%) Mortalidade (grupo teste) - (%) Mortalidade (grupo controle) / 100 - (%) Mortalidade (grupo controle)] x 100

FIGURA 15. Procedimento experimental para o teste de imersão larval. (A) Fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus em fase de oviposição; (B) Cerca de 0,01 g de ovos foram acondicionados dentro de saquinhos de TNT (6 cm x 6 cm) e postos em estufa BOD a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por 3 semanas; (C) Dos saquinhos incubados por 3 semanas, foram coletados aproximadamente 200 larvas e transferidas para novos saquinhos, os quais foram imersos em soluções-teste por 5 minutos; (D) Após o ensaio, os saquinhos permaneceram por cerca de 30 minutos em ambiente ventilado, a 25 °C, para secagem. O excesso foi retirado repousando os saquinhos sobre toalha de papel de filtro; (E) Os saquinhos já secos, foram alocados novamente em estufa BOD, a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por 48 horas; (F) A leitura dos resultados foi feita contabilizando-se o número de larvas vivas e mortas para posterior cálculo da taxa de mortalidade.

4.14.3. Teste de eclodibilidade de larvas (EL)

Aproximadamente 200 ovos (0,01 g) foram colocados em tubos de ensaio e imersos por 5 minutos em 1,0 mL das diluições do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%): 12,5, 25,0, 50,0 e 100,0 mg/mL. Água destilada foi utilizada como controle

negativo. Posteriormente, as massas de ovos foram secas sobre papel de filtro, à temperatura

A B C

ambiente, por 15 minutos. Os tubos terminaram de ser drenados com o auxílio de tiras de papel de filtro e em seguida os ovos foram realocados neles. Após, foram levados até estufa BOD e mantidos a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por 3 semanas (Figura 15) (RIBEIRO et al., 2008). O teste foi executado em triplicata. A porcentagem de eclodibilidade foi calculada como o número de larvas eclodidas dividido pelo número total de ovos incubados, considerando-se que em 0,01 g estão contidos aproximadamente 200 ovos (número obtido experimentalmente).

FIGURA 16. Procedimento experimental para o teste de eclodibilidade de larvas. (A) Aproximadamente 0,01 g de ovos embrionados foram colocados em tubos de ensaio; (B) Tubos foram escolhidos aleatoriamente para constituir os grupos-teste; (C) Após separação dos grupos, os tubos receberam individualmente 1,0 mL das respectivas diluições das soluções-teste. A massa de ovos permaneceu imersa durante 5 minutos; (D) Após, as massas de ovos foram deixadas sobre papel de filtro, em temperatura ambiente, por 15 minutos, até completa secagem. Depois deste tempo, as massas foram devidamente realocadas em seus respectivos tubos; (E) Os tubos foram incubados em estufa BOD a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por 3 semanas; (F) A leitura dos resultados foi feita contabilizando-se o número de larvas eclodidas.

A _{B C}

E