FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DOS POTENCIAIS ANTIMICROBIANO E CARRAPATICIDA DE EXTRATIVOS VEGETAIS DE
Tagetes patula L. (ASTERACEAE)
Doutorando: Flávio Augusto Sanches Politi Orientadora: Profa. Dra. Rosemeire Cristina L. R. Pietro
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO DOS POTENCIAIS ANTIMICROBIANO E CARRAPATICIDA DE EXTRATIVOS VEGETAIS de Tagetes
patula L. (ASTERACEAE)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio De Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Doutorando: Flávio Augusto Sanches Politi Orientadora: Profa. Dra. Rosemeire Cristina L. R. Pietro
Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara
Politi, Flávio Augusto Sanches
Caracterização fitoquímica e avaliação dos potenciais antimicrobiano e carrapaticida de extrativos vegetais de Tagetes patula L. (Asteraceae) /
Flávio Augusto Sanches Politi. – Araraquara, 2012 182 f.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro
1. Tagetes patula. 2. Rhipicephalus sanguineus. 3. Flavonóides. 4. Fungos
entomopatogênicos. 5. Citotoxicidade. 6. Atividade antimicrobiana I. Pietro, Rosemeire Cristina L. R., orient. II. Título.
P766c
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Aparecida Sanches Politi, que me deixaram como
legado uma educação irrepreensível e uma
formação moral exemplar. Embora não estejam
fisicamente presentes, são em seus exemplos como
seres humanos ímpares que busco inspiração,
procurando fazer sempre o melhor, tanto
¾ Aos professores Maria Izabel Camargo Mathias, Glyn Mara Figueira, Ana Helena
Januário e Wagner Vilegas, essenciais em diversas etapas do projeto;
¾ Aos professores que fizeram parte da minha banca de qualificação, Gervásio Henrique
Bechara e Luís Vítor Silva do Sacramento, pelas críticas e sugestões construtivas;
¾ Aos professores que fizeram parte da minha banca de defesa de tese, Maria Izabel
Camargo Mathias, Nara Amélia da Rosa Farias, Lourdes Campaner dos Santos e Ary Fernandes Júnior;
¾ À minha orientadora, professora Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro, pela
parceria e pelo convívio amistoso, apoiando-me sempre em todas as situações;
¾ Às pessoas que de alguma forma me ajudaram ao longo do doutorado, sejam técnicos de
laboratório, professores ou colegas de trabalho: Rodrigo Sorrechia, Pedro Donizete Nogueira, Alberto Alécio, Talita Vieira Machado, Geisiany Maria de Queiroz, Edvânio Ramos Rodrigues, Tatiana Maria Souza Moreira, Émerson dos Santos, Vanessa Yuri Motoyama Watanabe, Bruno Sampieri, Andrea Mendez Araújo, Cláudia Rocha, Marcelo Tangerina, Gervásio Henrique Bechara, Matias Pablo Juan Szabó e outros;
¾ Ao professor Didier Raoult, pela parceria interinstitucional firmada, possibilitando a
realização de estágio de 3 meses na Unité de Recherche sur lês Maladies Infectieuses et Tropicales Émergentes (URMITE), Faculté de Médecine, Université de La Mediterranée (Aix-Marseille II), Marseille (France);
¾ Aos professores Philippe Parola e Cristina Socolovschi, por me orientarem neste período
na França, e ao técnico laboratorial Jean Michel Berenger, pela inestimável ajuda;
¾ À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), que tornou
1. INTRODUÇÃO ... 24
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 30
2.1. Tagetes patula L. (Asteraceae) ... 30
2.2. Flavonóides ... 32
2.3. Rhipicephalus sanguineus ... 37
2.4. Fungos entomopatogênicos ... 41
2.5. Fungos dermatófitos ... 46
3. OBJETIVOS ... 50
3.1. Objetivos Principais ... 50
3.2. Objetivos Secundários ... 50
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 51
4.1. Solventes, reagentes e meios de cultura ... 51
4.2. Equipamentos e utensílios laboratoriais ... 52
4.3. Material vegetal e material animal ... 54
4.4. Caracterização farmacognóstica da matéria-prima vegetal ... 56 4.4.1. Análise granulométrica ___________________________________________ 56 4.4.2. Determinação do teor de cinzas totais ________________________________ 57 4.4.3. Perda por dessecação em estufa ____________________________________ 57 4.4.4. Determinação do teor de extrativos da droga vegetal ____________________ 57 4.4.5. Determinação do pH _____________________________________________ 58 4.4.6. Controle de qualidade microbiológico da droga vegetal __________________ 58 4.4.6.1. Contagem total de micro-organismos ______________________________ 59 4.4.6.2. Pesquisa de Salmonella sp. e Escherichia coli _______________________ 60
4.5.1. Flavonóides ____________________________________________________ 61 4.5.1.1. Reações de caracterização de flavonóides ___________________________ 61 4.5.2. Taninos _______________________________________________________ 62 4.5.2.1. Reações de caracterização de taninos ______________________________ 63 4.5.3. Saponinas _____________________________________________________ 63 4.5.4. Cumarinas _____________________________________________________ 63 4.5.5. Glicosídeos cardiotônicos _________________________________________ 64 4.5.5.1. Reações de caracterização de glicosídeos cardiotônicos ________________ 64 4.5.6. Alcalóides _____________________________________________________ 65
4.6. Obtenção dos extratos ... 66
4.7. Obtenção do óleo essencial de partes aéreas ... 66
4.8. Determinação do teor de flavonóides totais ... 67
4.8.1. Curva analítica para quantificação de flavonóides totais _________________ 67 4.8.2. Preparo das soluções-teste a partir dos extratos vegetais _________________ 67 4.9. Caracterização e identificação dos constituintes químicos de T. patula ... 68
4.9.1. Fracionamento do extrato bruto de partes aéreas de T. patula _____________ 68 4.9.2. Perfil cromatográfico do extrato bruto por CLAE-UV-DAD ______________ 69 4.9.3. Espectrometria de massas _________________________________________ 69 4.10. Identificação dos constituintes químicos do óleo essencial por CG-EM ... 70
4.11. Atividade antioxidante de extratos e óleo essencial de T. patula ... 71
4.12. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ... 72
4.13. Avaliação da citotoxicidade de extratos e óleo essencial de T. patula ... 74
4.14. Bioensaios in vitro com Rhipicephalus sanguineus ... 74
4.14.2. Teste de Imersão Larval (TIL) ____________________________________ 77 4.14.3. Teste de eclodibilidade de larvas (EL) _____________________________ 78
4.15. Análise histológica de ovários de R. sanguineus tratados com PAEtOH70% ... 80
5. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 81
6. RESULTADOS ... 82
6.1. Obtenção e rendimento do material vegetal ... 82
6.2. Obtenção e rendimento dos extratos e óleo essencial ... 83
6.3. Caracterização farmacognóstica da matéria-prima vegetal ... 83
6.3.1. Análise granulométrica ___________________________________________ 83 6.3.2. Determinação do teor de cinzas totais, perda por dessecação em estufa, teor de extrativos e pH ________________________________________________________ 84 6.4. Controle de qualidade microbiológico da droga vegetal ... 85
6.5. Triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários ... 86
6.6. Determinação do teor de flavonóides totais ... 87
6.7. Fracionamento do extrato bruto de partes aéreas de T. patula ... 89
6.8. Perfil cromatográfico do extrato bruto por CLAE-UV-DAD ... 90
6.9. Espectrometria de massas ... 94
6.10. Constituintes químicos do óleo essencial de T. patula ... 101
6.11. Atividade anti-radicalar de extratos e óleo essencial de T. patula ... 104
6.12. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ... 106
6.13. Avaliação da citotoxicidade de extratos e óleo essencial de T. patula ... 107
6.14. Bioensaios in vitro com Rhipicephalus sanguineus ... 110
6.14.3. Teste de eclodibilidade de larvas (EL) ____________________________ 120
6.15. Análise histológica de ovários de R. sanguineus tratados com PAEtOH70% ... 123
7. DISCUSSÃO ... 128
8. CONCLUSÕES ... 148
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 149
10. ANEXOS ... 181
10.1. Equações ... 181
FIGURA 1. Vista aérea de canteiro cultivado com Tagetes patula L. (Fonte:
http://www.zahradnictvifous.cz/zahradnictvi-fous.php?s=kvetiny-na-hroby) ... 30
FIGURA 2. Esquema da biossíntese de flavonóides (Fonte: Adaptado de Cuyckens e Clayes, 2004). ... 34
FIGURA 3. Estruturas básicas das principais classes de flavonóides e compostos relacionados. As setas indicam posições comuns de O- e C- glicosilações (Fonte: Adaptado de
Harborne, 1984). ... 35
FIGURA 4. Formas de vida do carrapato vermelho dos cães Rhipicephalus sanguineus. (A)
visão dorsal da larva; (B) visão ventral da larva; (C) visão dorsal da fêmea adulta; (D) visão ventral da fêmea adulta; (E); visão dorsal do macho adulto (F) visão ventral do macho adulto; (G) visão dorsal da fêmea parcialmente ingurgitada; (H) visão ventral da fêmea parcialmente ingurgitada; (I) visão dorsal da fêmea ingurgitada; (J) visão ventral da fêmea ingurgitada (Fonte: Adaptado de http://www.tickencounter.org/tick_identification). ... 39
FIGURA 5. Ciclo de vida do ixodídeo Rhipicephalus sanguineus. (Ilustração: POLITI,
F.A.S., 2011). ... 40
FIGURA 6. (A) Observação microscópica (x20) das hifas septadas de Metarhizium
anisopliae; (B) Colônia simples de M. anisopliae em ágar Sabouraud enriquecido com
dextrose, após três semanas de crescimento; (C) Vista aproximada da colônia mostrada em (A), detalhando colunas de conídios; (D) Fotomicrografia (x920) de cadeias de conídios em
M. anisopliae (Fontes: (A) http://www.beedata.com/apis-uk/newsletters08/apis-uk1008.htm;
(B-D) Sutton, D. A., Fothergill, A. W. and Rinaldi, M. G. Guide to clinically significant fungi,
microscópica (x40) de três células conidiogênicas em hifa de B. bassiana, detalhando-se os
conídios localizados em estruturas agregadas nas suas extremidades (Fontes: (A)
http://phil.cdc.gov/phil/details.asp; (B) http://www.uoguelph.ca/~gbarron/MISCELLANEOUS/nov01.htm. ... 46
FIGURA 8. (A) Macroconídio e alguns microconídios de Trichophyton rubrum var. rodhaini
(x40); (B) Colônia de T. rubrum em ágar Saboraud (Fontes: (A)
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/Trichophyton_rubrum_var_rodhaini.jp g; (B) http://provlab.ab.ca). ... 48
FIGURA 9. (A) Observação microscópica (x40) dos macroconídeos de Microsporum canis;
(B) Colônia de M. canis em ágar Sabouraud (Fontes: (A)
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b0/Macroconidia_Microsporum_canis.JP G; (B) http://www.eol.org/pages/6551034). ... 49
FIGURA 10. Identificação de Tagetes patula fornecida pela empresa Agristar® (Fonte:
http://www.agristar.com.br/descrtr/tagete-anaodobradosortido.htm). ... 54
FIGURA 11. Colônias dos micro-organismos utilizados nos ensaios antimicrobianos: (A)
Beauveria bassiana (ATCC 507); (B) B. bassiana (ATCC 4531); (C) Microsporum canis
(isolado clínico); (D) Thricophyton mentagrophytes (INCQS 40051); (E) Metarhizium
anisopliae (ATCC 46); (F) M. anisopliae (ATCC 343); (G) M. anisopliae (isolado clínico);
(H) Thricophtyon rubrum INCQS 40004; (I) T. rubrum (isolado clínico). ... 56
FIGURA 12. Esquema do teste de controle microbiológico para amostras vegetais (droga e extrato). ... 59
FIGURA 13. Esquema da montagem de microplaca para teste antimicrobiano (CIM). ... 73
posterior incubação em estufa BOD (27-28 °C, 70-80% UR, 12/12 h fotoperíodo); (D) Massas de ovos ovipostos pelas fêmeas de R. sanguineus; (E) Incubação das massas de ovos em tubos
de ensaio (BOD, 27-28 °C, 70-80% UR); (F) Tubos de ensaio após eclosão das larvas. ... 76
FIGURA 15. Procedimento experimental para o teste de imersão larval. (A) Fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus em fase de oviposição; (B) Cerca de 0,01 g de ovos foram
acondicionados dentro de saquinhos de TNT (6 cm x 6 cm) e postos em estufa BOD a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por 3 semanas; (C) Dos saquinhos incubados por 3 semanas, foram coletados aproximadamente 200 larvas e transferidas para novos saquinhos, os quais foram imersos em soluções-teste por 5 minutos; (D) Após o ensaio, os saquinhos permaneceram por cerca de 30 minutos em ambiente ventilado, a 25 °C, para secagem. O excesso foi retirado repousando os saquinhos sobre toalha de papel de filtro; (E) Os saquinhos já secos, foram alocados novamente em estufa BOD, a 27-28 °C e 70-80% UR (12/12 h fotoperíodo) por 48 horas; (F) A leitura dos resultados foi feita contabilizando-se o número de larvas vivas e mortas para posterior cálculo da taxa de mortalidade. ... 78
Campinas (SP); (B) Área cultivada total de 100 m (Fotos: FIGUEIRA, G. M., 2010). ... 82 FIGURA 18. (A) Plantas após 40 dias do cultivo; (B) Coleta após 40 dias do cultivo (Fotos: FIGUEIRA, G. M., 2010). ... 82
FIGURA 19. Fluxograma de obtenção e rendimento dos extratos de T. patula L. (PA: partes
aéreas de T. patula; Fl: flores de T. patula; PASF; partes aéreas sem flores de T. patula;
MeOH: metanol; EtOH70%: etanol 70%; R: rendimento). ... 83
FIGURA 20. Tamanho médio das partículas de partes aéreas trituradas de T. patula. ... 84
FIGURA 21. Curva analítica de absorbância da solução padrão de quercetina. ... 87
FIGURA 22. (A) Sub-frações obtidas do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula
(PAEtOH70%) eluído com MeOH:H20 (8:2, v/v) em coluna de sílica gel LH-20; (B) Cromatoplaca visualizada sob luz UV, destacando a fluorescência de compostos flavonóidicos. Sistema eluente: CHCl3:MeOH:nPropOH:H2O (5:6:1:4, v/v/v/v); Revelador:
anisaldeído sulfúrico. [Re: resíduo da coluna; R: rutina; Q: quercetina. ... 89
FIGURA 23. Perfil cromatográfico por CLAE-DAD do extrato etanólico de partes aéreas de
T. patula (PAEtOH70%) diluído em MeOH:H2O (8:2, v/v). Coluna Phenomenex® Luna (2) RP
C18 (250 x 4,6 mm i.d., 5 µm), HPLC (Varian®), fluxo 1,0 mL/min., Ȝ = 361 nm (analítico, gradiente exploratório 5-100% MeOH, 60 minutos). ... 90
FIGURA 24. Perfis de absorção no UV dos picos 1-8 eluídos na CLAE-DAD. ... 92
FIGURA 25. Perfis de absorção no UV dos picos 9-16 eluídos na CLAE-DAD. ... 93
partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%). Para condições espectrométricas ver: Materiais e Métodos. ... 95
FIGURA 28. Espectros de massas MS² dos picos 1 (A), 2 (B), 3 (C), 4 (D), 5 (E), 6 (G), 7 (H) e fragmentação MS³ do íon precursor de m/z 493 (F). ... 99
FIGURA 29. Espectros de massas MS² dos picos 8 (J), 9 (M), 10 (N) e fragmentações MS³ dos íons precursores de m/z 593 (I) e m/z 609 (K e L). ... 100
FIGURA 30. Estruturas químicas dos compostos identificados por MS/MS no extrato etanólico 70% de partes aéreas de T.patula L. ... 101
FIGURA 31. Cromatograma obtido via CG-EM (cromatografia gasosa acoplada à espectrômetro de massas) do óleo essencial de partes aéreas de Tagetes patula. ... 102
FIGURA 32. (A) Espectro de massas (EM) obtido pela fragmentação de substância com tempo de retenção tR = 15,058 minutos; (B) Espectro de massas comparativo obtido da biblioteca de padrões de referência Wiley 7. ... 104
FIGURA 33. (A) IC50 para extratos de T. patula; (B) Valores de IC50 para os extratos de partes aéreas de T. patula; (C) Valores de IC50 para os extratos de flores de T. patula; (D) Valores de IC50 para os extratos etanólicos de partes aéreas (PAEtOH70%), partes aéreas sem flores (PASFEtOH70%) e flores (FlEtOH70%) de T. patula; (E) Valor de IC50 para o óleo essencial
de T. patula. ... 109
FIGURA 34. Porcentagens de inibição de oviposição de fêmeas ingurgitadas de R.
sanguineus tratadas com diferentes diluições do óleo essencial (OE) de partes aéreas de T.
patula (média de duas determinações ± desvios-padrões). ... 112
FIGURA 35. Padrão gráfico obtido pela porcentagem de inibição da postura de ovos x
do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%) frente R. sanguineus. ... 115 FIGURA 37. (A) Ovos oriundos de fêmeas de R. sanguineus não tratadas (aumento 40x); (B)
Ovos oriundos de fêmeas de R. sanguineus submetidas ao teste de imersão de adultos (TIA)
por 5 minutos em solução de Triton-X-100 (1,25%) (aumento 50x); (C) Ovos oriundos de fêmeas de R. sanguineus submetidas ao teste de imersão de adultos (TIA) por 5 minutos em
solução do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%) a 50 mg/mL (aumento 40x); (D) Ovos oriundos de fêmeas de R. sanguineus submetidas ao teste de
imersão de adultos (TIA) por 5 minutos em solução de óleo essencial de partes aéreas de T.
patula (OE1,0%) a 1,0% (aumento 32x). Imagens obtidas em estereomicroscópio Olympus
SZX16. ... 116
FIGURA 38. Ação do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (50,0 mg/mL) em
fêmeas adultas ingurgitadas de R. sanguineus no teste de imersão por 5, 10, 30 e 60 minutos.
Valores com letras sobrescritas iguais não apresentam diferenças estatisticamente significantes pelos testes de Tukey e de Neuman-Keuls (p < 0,05). ... 117
FIGURA 39. Taxa de mortalidade de larvas de R. sanguineus frente às diluições de extrato
etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%). ... 119 FIGURA 40. Porcentagem de eclodibilidade de larvas de R. sanguineus submetidos a
tratamento com diferentes diluições do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula
(PAEtOH70%) (média de três determinações ± desvios-padrões). ... 121 FIGURA 41. (A-B) Comparação visual entre a taxa de eclodibilidade de larvas de R.
sanguineus submetidos ao controle negativo (água destilada) e ao extrato etanólico 70% de
partes aéreas de T. patula (100 ȝg/mL), respectivamente. A massa escura no fundo do tubo
aéreas de após 21 dias do teste (aumento 100x). ... 122 FIGURA 42. (A-E) Sumário diagramático da vitelogênese em ovário seccionado de R.
sanguineus; (A) Ovócito I; (B) Ovócito II; (C) Ovócito III; (D) Ovócito IV; (E) Ovócito V;
gv: vesícula germinativa; ch: cório; nu: núcleo; yg: grânulos de vitelo (Fonte: extraído de OLIVEIRA et al., 2005). ... 123
FIGURA 43. Secções histológicas de ovário de fêmeas adultas ingurgitadas de R. sanguineus
tratadas com extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula, mostrando detalhes de
ovócitos II-V corados com hematoxilina-eosina (HE). Notar ovócito IV com severa deformação do cório e intensa vacuolização citoplasmática (seta). pe: células do pedicelo; vg: vesícula germinativa; nu: núcleo; co: cório; va: vacúolo. ... 125
FIGURA 44. Secções histológicas de fêmeas adultas ingurgitadas de R. sanguineus tratadas
com extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula, mostrando ovócitos em diversos
estágios de desenvolvimento (II-V), aderidos à parede do ovário pelas células do pedicelo. As células foram coradas com hematoxilina-eosina (HE). Notar o vacúolo formado ao redor da vesícula germinativa (seta) e a desorganização no epitélio do ovário, com formação de vacúolos entre as células do pedicelo (ponta de seta). lu: lúmen; pe: células do pedicelo; vg: vesícula germinativa; nu: núcleo; co: cório; va: vacúolo; eo: epitélio do ovário. ... 126
FIGURA 45. Secções histológicas de ovário de fêmeas adultas ingurgitadas de R. sanguineus
tratadas com extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula, mostrando detalhes de
TABELA 1. Micro-organismos utilizados nos testes antimicrobianos. _________________ 55
TABELA 2. Porcentagens cumulativas de retenção e de passagem das partes aéreas moídas
de Tagetes patula. __________________________________________________________ 84
TABELA 3. Parâmetros de controle de qualidade da droga vegetal. ___________________ 85
TABELA 4. Análise microbiológica de partes aéreas moídas de T. patula. _____________ 85
TABELA 5. Análise fitoquímica de partes aéreas moídas de T. patula. ________________ 86
TABELA 6. Quantificação espectrofotométrica dos flavonóides totais, equivalentes em quercetina, presentes nos extrato secos de Tagetes patula, a 430 nm. __________________ 88
TABELA 7. Faixa espectral de absorção no UV para flavonóides. ____________________ 91
TABELA 8. Lista de compostos fenólicos identificados em extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula por FIA-ESI-IT-MS. ________________________________________ 98
TABELA 9. Composição química do óleo essencial de partes aéreas de T. patula _______ 102
TABELA 10. Atividade anti-radicalar percentual das substâncias padrão e dos extratos etanólicos 70% de T. patula pelo método do DPPH. ______________________________ 105
TABELA 11. Valores de concentração inibitória mínima (CIM) em ȝg/mL. ___________ 106
TABELA 12. Viabilidade celular de macrófagos J774 frente a extratos e óleo essencial de T.
patula (os valores representam a média de três determinações ± os desvios-padrões). ____ 107
TABELA 13. IC50 dos extratos de T. patula frente a macrófagos J774. Os valores correspondem à média de três determinações mais ou menos os desvios-padrões. _______ 110
TABELA 14. Índices de postura de ovos e porcentagens de inibição de oviposição de fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus tratadas com extrato etanólico 70% de partes aéreas de T.
ingurgitadas de R. sanguineus tratadas com óleo essencial de partes aéreas de T. patula (OE),
média de dois ensaios. ______________________________________________________ 111
TABELA 16. Valores de eficiência reprodutiva (ER) e eficiência do produto (EP) do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%) em diferentes concentrações. ___ 114 TABELA 17. Taxa de mortalidade larval de Rhipicephalus sanguineus frente às diluições do
extrato etanólico 70% de partes aéreas de Tagetes patula L. (PAEtOH70%). ______________ 118 TABELA 18. Concentrações letais de extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula
(PAEtOH70%) em larvas de R. sanguineus e seus respectivos intervalos de confiança, calculados por Análise de Probit (método de Finney). ______________________________________ 119
TABELA 19. Valores médios (± desvios-padrões) de parâmetros utilizados no cálculo da porcentagem de eclodibilidade de larvas do ixodídeo Rhipicephalus sanguineus submetidos
ao teste de imersão. ________________________________________________________ 120
AlCl3.6H2O Cloreto de Alumínio Hexahidratado
ANOVA Analysis of Variance
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain Heart Infusion
BM Banho-Maria
BOD Biological Oxygen Demand
BS Agar Bismuto-Sulfito
CCCD Cromatografia Comparativa em Camada Delgada
CCD Cromatografia em Camada Delgada
Ce Agar Cetrimida
CFM Concentração Fungicida Mínima
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
CHCl3 Clorofórmio
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CPMA Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH 2.2-Difenil-1-Picrilhidrazila
EM Espectrometria de Massas
EMB Agar Eosina-Azul de Metileno
ESI Electrospray Ionization
EtOH Etanol (Álcool Etílico)
FAO Food Agriculture Organization of the United Nations
FD Fator de Diluição
FeCl3 Cloreto de Ferro
FIA Flow Injection Analysis
Fl Flores
GC-MS Gas Chromatography - Mass Spectrometry GPC Cromatografia de Permeação em Gel
H2SO4 Ácido Sulfúrico
HCl Ácido Clorídrico
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
IK Índice de Retenção de Kovats
IO Índice de Oviposição
IS Índice de Similaridade
IT Íon-Trap IV Infravermelho
MC Agar Mac-Conkey
MeOH Metanol (Álcool Metílico)
MOPS Ácido propanosulfônico 3-(N-morfolino)
NaOH Hidróxido de Sódio
Na2SO4 Sulfato de Sódio
OMS Organização Mundial da Saúde
PA Partes Aéreas
PASF Partes Aéreas sem Flores
PBS Tampão Fosfato-Salina
PTFE Politetrafluoretileno
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RPMI 1640 Roswelt Park Memorial Institute Medium 1640
S Agar Saboraud
SC Caldo Selenito Cistina
TE Teor de Extrativos
Te Caldo Tetrationato
Ti Agar Tioglicolato
TIA Teste de Imersão de Formas Adultas
TIL Teste de Imersão Larval
TSI Agar Tríplice Açúcar-Ferro
UFC Unidade Formadora de Colônia
UR Umidade Relativa
USP United States Pharmacopeia
UV Ultravioleta
VB Agar Verde-Brilhante
VJ Agar Vögel-Johnson
WHO World Health Organization
O carrapato é a espécie de maior disseminação mundial e está comprovadamente envolvido na transmissão de agentes patogênicos. Estudos têm demonstrado aquisição de resistência a alguns dos princípios ativos usados em formulações comerciais de acaricidas. Neste trabalho, utilizando-se extrato etanólico 70% (PAEtOH70%) e óleo essencial (OE) de partes aéreas de Tagetes patula, avaliamos a ação carrapaticida in vitro
contra os diversos estágios de desenvolvimento no ciclo de vida do ixodídeo R. sanguineus.
Na concentração de 50,0 mg/mL, PAEtOH70% diminuiu a oviposição em 21,5%, eliminou 99,8% das larvas e destruiu 96,5% dos ovos. O OE a 4% inibiu a oviposição em 33,94%. Apesar da baixa taxa de mortalidade de fêmeas adultas ingurgitadas, análises microscópicas da estrutura dos ovários revelaram importantes alterações morfológicas na estrutura dos ovócitos II-V e células do pedicelo, interferindo diretamente na embriogênese normal, prejudicando ou inviabilizando a formação de larvas sadias. Para garantir o uso seguro em uma possível formulação, avaliamos a atividade citotóxica de PAEtOH70% e do OE frente a macrófagos murinos, obtendo-se IC50 de 210,9 µg/mL e IC50 de 0,04%, respectivamente. O extrato foi caracterizado fitoquimicamente por HPLC-EM, tendo sido identificados 12 favonóides O-glicosilados. O óleo foi caracterizado fitoquimicamente por CG-EM, revelando
a presença de 55 compostos, sendo os principais o 4-vinil-guaiacol e o gama-terpineno. Quanto aos ensaios antimicrobianos, o extrato PAEtOH70% não inibiu o crescimento de B.
bassiana e M. anisopliae (CIMs > 1250,0 ȝg/mL) e apresentou a melhor ação contra T.
rubrum e T. rubrum (FOC) (312,5 e 468,75 ȝg/mL, respectivamente).
Palavras-Chave: Tagetes patula; Rhipicephalus sanguineus; flavonóides; fungos
The tick is the species most worldwide spread and is proven to be involved in the transmission of pathogens. Studies have shown acquisition of resistance to some of the active ingredients used in commercial formulations of acaricides. In this study, using 70% ethanol extract (PAEtOH70%) and essential oil (EO) from aerial parts of Tagetes
patula, we evaluated the in vitro acaricide action against various developmental stages in the
life cycle of ixodid R. sanguineus. At the concentration of 50.0 mg/mL, PAEtOH70% decreased the oviposition by 21.5%, eliminated 99.8% of the larvae and destroyed 96.5% of the eggs. The OE 4% inhibited oviposition in 33.94%. Despite the low mortality rate of engorged adult females, microscopic analysis of the structure of the ovaries showed significant morphological changes in the structure of II-V oocytes and cells of pedicel, interfering directly in normal embryogenesis, impairing or invalidating the formation of healthy larvae. To ensure safe use in a possible formulation, we evaluated the cytotoxic activity of PAEtOH70% and OE against murine macrophages, yielding IC50 of 210.9 mg/mL and IC50 of 0.04%, respectively. The extract was phytochemically characterized by HPLC-MS and was identified 12 flavonoids O-glycosylated. The oil was phytochemically characterized by GC-MS,
revealing the presence of 55 compounds, the main ones being the 4-vinyl guaiacol and gamma-terpinene. Regarding antimicrobial assays, the extract PAEtOH70% did not inhibit growth of B. bassiana and M. anisopliae (MICs > 1250.0 mg/mL) and showed the best
activity against T. rubrum and T. rubrum (FOC) (312.5 and 468.75 mg/mL, respectively).
Keywords: Tagetes patula; Rhipicephalus sanguineus; flavonoids; entomopathogenic fungi,
1. INTRODUÇÃO
A intensa atividade agropecuária no Brasil, o convívio do homem com animais domésticos e o recente quadro de alterações climáticas no mundo favorecem a disseminação de agentes infecciosos transmitidos por carrapatos, propiciando o surgimento e o ressurgimento de diferentes agentes etiológicos (MASSARD e FONSECA, 2004).
A sub-classe Acari, da classe Arachnida, à qual pertencem os carrapatos e outros ácaros
é um grupo muito heterogêneo apresentando grande diversidade de hábitos e habitats (GUIMARÃES et al, 2001). Os carrapatos pertencem à ordem Ixodida, que pode ser dividida
em três famílias: Argasidae, Nuttalliellidae e Ixodidae. O carrapato Rhipicephalus sanguineus
(Latreille, 1806) é, provavelmente, a espécie de maior disseminação mundial na atualidade (PEGRAM, et al., 1987), pela ampla distribuição de seu hospedeiro natural que é o cão, e por possuir hábitos nidícolas. Originário da região Afrotropical, o ixodídeo foi introduzido no Brasil possivelmente a partir do século XVI, com a chegada dos colonizadores europeus e seus animais domésticos (LABRUNA e PEREIRA, 2001). Está comprovadamente envolvido na transmissão de agentes patogênicos, destacando-se entre estes Babesia canis e Ehrlichia
canis (GOTHE et al.,1989; SMITH et al., 1976). O parasito pode ainda transmitir ao homem
várias espécies de riquétisias, como a Rickettsia rickettsii e a R. conorii, agentes causais,
respectivamente, da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas no México e na América do Sul e da Febre Botonosa na região mediterrânea do sul da Europa e do norte da África (SWANGO et al., 1992).
Os cães são os hospedeiros primários de R. sanguineus e sua presença é possivelmente
uma condição necessária para a manutenção da grande população de carrapatos (ACHA e SZYFRES, 1986). Entretanto, em certas áreas, e sob determinadas condições ecológicas, R.
encontrados em roedores e outros pequenos mamíferos. Formas adultas geralmente parasitam animais grandes, incluindo humanos (ESTRADA-PEÑA e JONGEJAN, 1999).
Recentemente, MILLER et al. (2001) verificaram resistência do carrapato a alguns dos
princípios ativos usados em formulações comerciais de acaricidas. Fipronil, amitraz, carbaril e piretróides (deltametrina, permetrina e cipermetrina) estão entre os acaricidas mais utilizados para seu controle (ALCAÍNO et al., 1995; FRANC e CADIERGUES, 1999; JERNIGAN et al., 2000; OTRANTO et al., 2005; WHO, 2006, ROMA et al., 2010). A utilização exclusiva de carrapaticidas químicos é cada dia menos viável em termos práticos e econômicos, tornando-se necessária a adoção de metodologias alternativas (BARROS e EVANS, 1989). Estes sistemas visam também atenuar os problemas ambientais, uma vez que o uso indiscriminado de carrapaticidas causa poluição ambiental, intoxicação ao homem e aparecimento de resíduos químicos nos produtos de origem animal (PAIÃO et al., 2001). Quando se pensa em controle de carrapatos, deve-se ter em mente que somente 5% deles estão nos cães e os outros 95% estão livres no ambiente. Portanto, a eliminação efetiva da população de carrapatos exigirá uma estratégia de controle integrada, visando tanto a população canina quanto o ambiente (DANTAS-TORRES, 2004; PRETTE, 2007).
Foi demonstrado que o uso de fungos entomopatogênicos, tais como Beauveria
bassiana e Metarhizium anisopliae, tem potencial para controlar populações de certos
espécies de carrapatos, incluindo R. sanguineus (KIRKLAND et al., 2004; SAMISH et al.,
2004; PRETTE, 2007). Garcia et al. (2004) descreveram os eventos envolvidos no mecanismo de adesão, penetração e colonização de fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus por M.
anisopliae. Um estudo recente demonstrou que formulações de B. bassiana e M. anisopliae
foram efetivas contra ninfas alimentadas e adultos não alimentados de R. sanguineus (REIS et
al., 2005). Em outro trabalho, ficou demonstrado que M. anisoplae pode infectar carrapatos
em rebanhos de gado, conferindo uma mortalidade de 30 e 37% para Rhipicephalus
appendiculatus e Amblyomma variegatum, respectivamente (KAAYA et al., 1996).
Resultados semelhantes foram registrados por Samish et al. (2001) que testaram vários
isolados de M. anisoplae contra R. sanguineus, encontrando taxas de mortalidade de 82,6% e
60% contra larvas ingurgitadas e ninfas, respectivamente, e 92-100% de mortalidade nos adultos e em larvas e ninfas não alimentadas.
Ainda que estudos da biologia de R. sanguineus sejam freqüentes, a literatura que trata
de seu controle em condições naturais de infestação é escassa, destacando-se os trabalhos que avaliam a eficácia de colares impregnados com acaricidas (VAN DEN BOS e CURTIS, 2002; ESTRADA-PEÑA e RÈME, 2005) e produtos de uso tópico (JERNIGAN et al., 2000; DRYDEN et al., 2006) em cães infestados experimentalmente com este carrapato. Na literatura, apenas os trabalhos de Labruna e Pereira (2001) e Labruna (2004) abordam aspectos sobre a eco-epidemiologia deste carrapato no Brasil, que são importantes para o direcionamento das medidas de controle de R. sanguineus em ambientes naturalmente
infestados.
fitoterápicos em animais cresceu nos últimos anos, diretamente relacionado ao emergente mercado de “pets”, destacando-se o comércio de shampoos, condicionadores de pêlos e formulações repelentes de insetos. Inseticidas botânicos são relativamente seguros e degradáveis. Ressalta-se também que o uso de fitoterápicos em sistemas convencionais de produção, como parte da estratégia de controle de parasitas, pode elevar a eficácia e o tempo de uso dos produtos químicos sintéticos (VIEIRA et al., 1999). Os mais proeminentes inseticidas botânicos nos últimos anos são derivados das árvores de nim (Azadirachta indica
A. Juss), os quais têm sido estudados nas áreas de entomologia e fitoquímica e têm utilidade em propósitos médicos e cosméticos. Alguns destes parâmetros de bioatividade dos produtos do nim têm sido investigados em algumas espécies de artrópodes de importância médica e veterinária (MULLA-MIR e TIANYUN, 1999; DENARDI et al., 2010). Extratos de plantas podem ser utilizados para o controle de determinadas espécies de carrapatos como Hyalomma
anatolicum excavatum (ABDEL- SHAFY e ZAYED, 2002), Amblyomma americanum e
Dermacentor variabilis (CARROLL et al. 1989) e o próprio R. sanguineus (FERNANDES,
2007; ARNOSTI et al., 2011a,b; DENARDI et al., 2011; DENARDI et al., 2012; SAMPIERI et al., 2012).
dos fitoterápicos que atualmente justificam seu uso estão os efeitos sinérgicos de seus componentes, a associação de mecanismos por compostos agindo em alvos moleculares diferentes, os menores riscos de efeitos colaterais e os menores custos em pesquisas (YUNES et al., 2001).
O gênero Tagetes pertence à família Asteraceae, que é composta de várias espécies
herbáceas, anuais, com características ornamentais, sendo também conhecidas por suas propriedades medicinais e biocida. Têm elevada importância econômica e comercial devido à produção de metabólitos secundários, principalmente tiofenos, que apresentam uma variedade de efeitos, tais como nematicidas, bactericidas, fungicida e inseticida (MASSERA et al., 1998). As espécies T. minuta, T. erecta, T. patula e T. tenuifolia são as mais comuns. Wells
(1993) sugeriu que as espécies de tagetes podem ser usadas como um efetivo inseticida de mosquitos. Incentivados por esta constatação, Dharmagadda et al. (2005) testaram a atividade larvicida do óleo essencial de T. patula contra Aedes aegypti, Anopheles stephensi e Culex
quinquefaciatus, obtendo resultados promissores quando comparado com o inseticida
sintético malation.
As pétalas de Tagetes spp. são ricas em luteína, um componente das xantofilas dos
carotenóides, além de ésteres de ácidos graxos. A luteína dipalmitato é reportada por possuir atividades farmacológicas e é usado como agente oftalmológico no tratamento de catarata (OLMEDILLA et al., 2003). Outras funções promotoras de saúde são referenciadas às espécies de Tagetes, relacionados aos seus outros metabólitos secundários, tais como
efetiva contra muitos agentes microbianos tais como fungos (BII et al., 2000), vírus (ABAD et al., 1999) e bactérias Gram positivas e Gram negativas (TERESCHUK et al., 2003).
Entre os fungos dermatófitos que mais freqüentemente infectam os animais estão
Microsporum sp e Trichophyton sp. Esses gêneros podem ser divididos em três grupos com
base no habitat natural: geofílico, zoofílico e antropofílico. Em cães e gatos, dermatófitos zoofílicos como Microsporum canis e Trichophyton sp. e dermatófitos geofílicos como
Microsporum gypseum são os mais comuns (WILLEMSE, 1998). O gênero Trichophyton é
composto por diversas espécies, destacando-se T. rubrum, que pode produzir praticamente
todos os quadros clínicos de dermatofitose, tendo como características principais tendência para cronicidade e a resistência aos tratamentos convencionais (LACAZ et al., 1998). A dermatofitose é uma doença extremamente contagiosa, não apenas entre os animais, mas também dos animais para o homem. O contato direto com os artrósporos e hifas é o modo de transmissão (WILLEMSE, 1998). Os dermatófitos são transmitidos pelo contato com pêlo ou derme infectada, ou ainda, por elementos fúngicos no ambiente ou fômites (MULLER e KIRK,1996). As dermatofitoses dos cães e gatos constituem zoonoses de importância, uma vez que estes são, dentre os animais domésticos, os que mantêm contato mais estreito com as crianças, altamente susceptíveis a esses processos (COSTA et al., 1994). Estudos de incidência de dermatófitos no Brasil têm apontado T. rubrum, M.canis e T. mentagrophytes,
respectivamente, como as espécies mais prevalentes de dermatófitos isolados. M.canis
contribui com uma percentagem que varia de aproximadamente 25-30% na Região Sudeste e 5-10% na Região Nordeste (SIDRIM e ROCHA, 2004), sendo o agente mais freqüente de
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Tagetes patula L. (Asteraceae)
Tagetes patula L. (Asteraceae), popularmente conhecido como anão,
cravo-francês ou apenas cravo, é uma planta anual, de 20-30 cm de altura, nativa da América do Norte e amplamente disseminada pelo mundo todo (GILMAN, 1999). Suas flores apresentam coloração variada, podendo apresentar pétalas amarelas, laranjas ou uma mescla destas duas tonalidades (Figura 1). Justamente por ser anual, apresenta muita facilidade para o cultivo e propagação, pois produz flores e sementes o ano todo, com altas taxas de germinação.
FIGURA 1. Vista aérea de canteiro cultivado com Tagetes patula L. (Fonte:
http://www.zahradnictvifous.cz/zahradnictvi-fous.php?s=kvetiny-na-hroby)
A investigação fitoquímica de diferentes partes de T. patula tem resultado no
isolamento de diversos constituintes químicos das mais variadas classes de metabólitos secundários, tais como tiofenos, flavonóides, benzofuranos e carotenóides, destacando-se o trabalho de Bano et al. (2002) que a partir de diferentes partes de T. patula (raízes, folhas e
terpenóides, a saber: 5ƍ- hidroximetil-5-(3-buteno-1-enil)-2,2ƍ-bitiofeno (1); metil-5-[4-(3- metil-1- oxobutoxi)-1-butinil]-2,2’ bitiofeno (2); colesterol (3); ȕ-sitosterol (24-R-estigmast-5-ene-3ȕ-ol) (4); estigmasterol [24-(S)-estigmast-5,22E-dien-3ȕ-ol] (5) e lupeol (6). Flavonóides, tais como o canferol e quercetina foram reportados por Ivancheva e Zdravkova (1993). Tarpo (1967, 1968 e 1969) e Bhardwaj et al. (1980), registraram a presença de
patuletina-7-O-glucosídeo (patulitrina) e de patuletina, quercetagetina, quercetagetina-7-O
-glucosídeo e luteolina em pétalas de T. patula. Trabalhos prévios descreveram a presença de
flavonóides O- glicosilados em diversas espécies de Tagetes: quercetagetina, quercetagetina
3-arabino-galactosídeo, patuletina, patuletina-7-glicosídeo, quercetina e quercetina-5-glicosídeo em partes aéreas de T. minuta (ABDALA e SEELIGMANN, 1995); patuletina,
isoramnetina, quercetagetina-3-O-arabinosil galactosídeo e isoramnetina-7-O-glicosídeo em
partes aéreas de T. lucida (ABDALA, 1999); quercetagetina, patuletina,
patuletina-7-glicosídeo, isoramnetina, isoramnetina-3-galactosídeo e isoramnetina-7-glicosídeo em partes aéreas de T. stenophylla (ABDALA, 2000); canferol, canferol-7-O-glicosídeo, quercetina,
quercetina-3-O-ramnosídeo, quercetina-3-O-glicosídeo em partes aéreas de T. tenuifolia e
quercetagetina (ABDALA, 2001); quercetagetina-7-O-glucosídeo, quercetagetina-3-O
-glucosídeo e quercetina-7-O-glucosídeo em partes aéreas de T. gracilis (ABDALA, 2003).
Parejo et al. (2004) identificaram em T. maxima 51 compostos fenólicos, incluindo
flavonóides-O-glicosilados acilados com grupos galoil, protocatecoil, cumaril ou cafeoil,
flavonóides metoxilados, ácido hidroxicinâmico e derivados de ácidos fenólicos. Romagnoli
et al. (2005), a partir do óleo essencial extraído do capítulo de flores de T. patula,
conseguiram, através de análises por cromatografia gasosa e cromatografia gasosa acoplada à espectroscopia de massas, identificar e caracterizar 30 componentes, dentre os quais os principais foram: piperitona, terpinoleno, diidro tagetona, cis-tagetona, limoneno e
partir de análises por GC/MS identificaram 13 compostos, sendo os majoritários a piperitona, trans-ȕ-ocimeno, terpinoleno e ȕ-cariofileno. No mesmo trabalho, foi testada a atividade antibacteriana do óleo essencial, obtendo excelentes resultados tanto para bactérias patogênicas Gram positivas quanto Gram negativas.
2.2. Flavonóides
Atualmente mais de 6000 diferentes flavonóides já foram descritos (HARBORNE e
WILLIAMS, 2000). Basicamente, caracterizam-se por apresentar dois núcleos fenólicos ligados
por uma cadeia de três carbonos. São formados por uma série de reações de condensação entre o ácido hidroxicinâmico (anel B e átomos de carbono 2, 3 e 4 do anel C) e resíduos de malonil (anel A), formando a estrutura básica C6-C3-C6.
O ácido cinâmico forma-se da fenilalanina por desaminação catalisada pela enzima fenilalanina amônia liase. Três unidades de malonil-CoA ligam-se aos ésteres da coenzima-A do ácido cinâmico gerando, após mais algumas reações, anéis aromáticos, dando inicialmente estilbenos ou chalconas, que posteriormente funcionarão como precursores de um vasto número de flavonóides (CUNHA, 2009) (Figura 2). Apresentam ligações conjugadas, que garante intensa absorção na luz ultravioleta, ou mesmo na luz visível.
FIGURA 2. Esquema da biossíntese de flavonóides (Fonte: Adaptado de Cuyckens e Clayes, 2004).
Os flavonóides podem ocorrer em diversas formas modificadas, correspondentes às hidroxilações, metilações e, sobretudo, glicosilações. Ocasionalmente, ácidos aromáticos e alifáticos, sulfato, grupos prenil, metilenodioxil ou isoprenil também podem se fixar em sua estrutura (IWASHINA, 2000). Basicamente, quaisquer dos grupos hidroxila podem ser glicosilados, porém, certas posições são mais favoráveis, por exemplo, o grupo 7-hidroxil em flavonas, flavanonas e isoflavonas, 3- e 7-hidroxil em flavonols e 3- e 5-hidroxil em antocianidinas. A glicose é o açúcar mais comumente encontrado nestas ligações, seguido por galactose, ramnose, xilose e arabinose (MARKHAM, 1982; IWANSHINA, 2000). Dissacarídeos também podem ser encontrados em associação com os flavonóides sendo os mais comuns, a rutinose (ramnosil-(Į1-6)-glicose) e a neohesperidose (ramnosil-(Į 1-2)-glicose) (MARKHAM, 1982; IWANSHINA, 2004).
FIGURA 3. Estruturas básicas das principais classes de flavonóides e compostos relacionados. As setas indicam posições comuns de O- e C- glicosilações (Fonte:
Adaptado de Harborne, 1984).
Os flavonóis são encontrados como co-pigmentos das antocianidinas nas pétalas e folhas de plantas superiores. Caracterizam-se por apresentar uma hidroxila ligada na posição 3 e uma dupla ligação entre C2-C3. Embora seja uma classe de flavonóides bastante rica, canferol, quercetina e miricetina são as agliconas mais comumente encontradas. A maioria dos outros flavonóis são variações destas três estruturas, podendo ainda, apresentar glicosídeos ligados à sua estrutura, sendo o mais comum a quercetina-3-rutinosídeo, mais conhecido como rutina (HAHLBROCK, 1981; HARBORNE, 1984).
diméricos ligados através de ligação carbono-carbono ou ligação carbono-oxigênio. Ocorrem especialmente nas gimnospermas (HAHLBROCK, 1981; HARBORNE e MABRY, 1982; HARBORNE, 1984).
As isoflavonas são isômeros das flavonas, porém de ocorrência muito mais restrita (subfamília Papilonoidea – Fabaceae). Em relação à atividade fisiológica, são subdivididas em três grupos: fitoestrógenos, compostos com atividade inseticida e fitoalexinas (HAHLBROCK, 1981; HARBORNE e MABRY, 1982; HARBORNE, 1984).
As chalconas e auronas são grupos pequenos de metabólitos que ocorrem especialmente na família Asteraceae. Possuem coloração amarelada, a qual se torna vermelha quando exposta a vapores alcalinos. Chalconas não apresentam anel central (anel C), enquanto que nas auronas há um, formado por 5 membros (HAHLBROCK, 1981; HARBORNE e MABRY, 1982; HARBORNE, 1984).
As flavanonas são intermediários biossintéticos da maioria das classes de flavonóides, sendo bastante comuns nos frutos cítricos. São caracterizadas pela ausência da dupla ligação entre os carbonos C2-C3 e pela ausência da hidroxila na posição 3, destacando-se a naringenina e hesperidina como as mais comuns (HAHLBROCK, 1981; HARBORNE e MABRY, 1982; HARBORNE, 1984).
As antocianinas são glicosídeos que apresentam em sua estrutura química um resíduo de açúcar na posição 3, facilmente hidrolizado por aquecimento com ácido clorídrico. Como produtos desta hidrólise, são obtidos o componente glicídico e a aglicona, denominadas antocianidinas (HARBORNE, 1984). As antocianidinas têm como estrutura básica o cátion 2-fenilbenzopirilium, também denominado flavilium, possuindo geralmente hidroxilas nas
2.3. Rhipicephalus sanguineus
Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806), carrapato pertencente à família Ixodidae,
subfamília Rhipicephalineae, grupo Metastriata, é provavelmente a espécie de ixodídeo mais disseminada em todo o mundo, sendo encontrada nas Américas do Norte, Central e do Sul, nas regiões leste e oeste da Índia, China, Austrália, Micronésia, Sudeste da Europa, Madagascar e África (SOULSBY, 1966).
O gênero Rhipicephalus engloba várias espécies que se apresentam morfologicamente
semelhantes e cuja posição taxonômica ainda é incerta, sendo elas R. turanicus, R. camicasi e
R. (Boophilus) microplus, além do próprio R. sanguineus. Existem relatos destas espécies
parasitando diversos mamíferos e até aves rasteiras, mas como sua diferenciação muitas vezes não é possível, não existe um consenso entre os pesquisadores sobre a especificidade parasitária das mesmas (SOULSBY, 1966; USPENSKY et al., 1997; BARROS-BATTESTI et al., 2006).
No Brasil, onde é popularmente conhecido como carrapato vermelho, o seu hospedeiro preferencial é o cão doméstico, sendo encontrado parasitando outros animais, como eqüinos, bovinos e o homem (DANTAS TORRES, 2006; LOULY et al., 2007). Por ser encontrado ocasionalmente parasitando seres humanos, este ixodídeo apresenta importância médica, sendo o principal vetor da Rickettsia conori, agente causador da Febre Botonosa, que ocorre
em várias regiões da Europa e África (MERLE et al., 1998). Nas Américas, já foi relatado como vetor da Rickettsia rickettsi, agente causador da Febre Maculosa das Montanhas
(DEMMA et al., 2005). No Brasil é indicado como vetor em potencial da borreliose ou “Lyme símile”, causada pela Borrelia sp. (YOSHINARI et al., 1997). Apresenta grande
importância veterinária podendo causar anemia devido à grande espoliação sanguínea, além da transmissão de doenças aos cães como a babesiose pela Babesia canis (WOLDEHIWET e
ou erliquiose, causada pela Erlichia canis, hepatozoonose causada pelo Hepatozoon canis, a
trombocitopenia cíclica canina causada pelo Anaplasma platys e a hemobartonelose pelo
Mycoplasma haemocanis (WOLDEHIWET e RISTIC, 1993).
O ixodídeo R. sanguineus possui três hospedeiros em seu ciclo de vida (trioxeno), e
FIGURA 4. Formas de vida do carrapato vermelho dos cães Rhipicephalus sanguineus. (A)
visão dorsal da larva; (B) visão ventral da larva; (C) visão dorsal da fêmea adulta; (D) visão ventral da fêmea adulta; (E); visão dorsal do macho adulto (F) visão ventral do macho adulto; (G) visão dorsal da fêmea parcialmente ingurgitada; (H) visão ventral da fêmea parcialmente ingurgitada; (I) visão dorsal da fêmea ingurgitada; (J) visão ventral da fêmea ingurgitada (Fonte: Adaptado de http://www.tickencounter.org/tick_identification).
Quanto ao ciclo de vida, fêmeas adultas de R. sanguineus se alimentam no hospedeiro
num período que varia de 5 a 21 dias (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; PEGRAM et al., 1987). Uma vez que o ingurgitamento está completo, ela se desprende do hospedeiro e se lança ao ambiente para digerir o sangue e pôr seus ovos em um lugar seguro. A oviposição é precedida por um período de pré-oviposição que se estende de 3 a 14 dias (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; KOCH, 1982; PEGRAM et al., 1987; JITTAPALAPONG et al., 2000). O período médio de oviposição é de 16 a 18 dias (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; KOCH, 1982). As fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus usualmente depositam em
torno de 4000 ovos (KOCH, 1982). Depois do fim da postura, a fêmea morre. O período de incubação dos ovos varia de 6 a 23 dias (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; KOCH, 1982; PEGRAM et al., 1987; JITTAPALAPONG et al., 2000). Depois desta etapa, pequenas larvas eclodem dos ovos e imediatamente começam a busca por um hospedeiro. As larvas se
A C E G I
alimentam por 3 a 10 dias, antes de destacarem-se do hospedeiro para se transformar em ninfas (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; PEGRAM et al., 1987). O período de ecdise das larvas em ninfas varia de 5 a 15 dias (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; PEGRAM et al., 1987). As ninfas se assemelham aos adultos na forma e alimentam-se durante 3-11 dias antes de se desprenderem voluntariamente dos hospedeiros para desenvolverem-se (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; PEGRAM et al., 1987). O período de ecdise das ninfas varia de 9 a 47 dias (PETROVA-PIONTKOVSKAYA, 1947; PEGRAM et al.,1987). Em condições favoráveis, o ciclo de vida pode ser completado entre 63-91 dias (GODDARD, 1987; BECHARA et al., 1995; LOULY et al., 2007) (Figura 5). No Brasil, onde as condições ambientais são bem favoráveis, R. sanguineus está apto a completar mais do que quatro
gerações por ano (DANTES TORRES et al., 2006; LOULY et al., 2007).
FIGURA 5. Ciclo de vida do ixodídeo Rhipicephalus sanguineus. (Ilustração:
Sob condições laboratoriais, os parâmetros biológicos oviposição e período das mudas
de R. sanguineus variam amplamente com a temperatura, umidade relativa (UR) e tipo de
hospedeiro (BELLATO e DAEMON, 1997). Foi demonstrado recentemente que R.
sanguineus são menos dependentes de habitats ricos em umidade para sobrevivência, o que
facilita seu estabelecimento em regiões que são desfavoráveis para a manutenção do balanço hídrico (YODER et al., 2006). O máximo de sobrevivência de ninfas ocorre a 20 °C e 85% de UR e a temperatura mínima para ocorrência de muda está entre 10-15 °C. Além disso, adultos em jejum são mais resistentes do que ninfas em jejum a condições extremas, isto é, 35 °C e 35% UR (KOCH e TUCK, 1986).
Esta espécie busca ativamente o hospedeiro, porém, em situações especiais pode utilizar a estratégia de emboscada na localização do mesmo (USPENSKY, 2002). Os carrapatos, de forma geral, utilizam vários estímulos térmicos, sonoros, olfativos, gustativos e táteis na busca pelo hospedeiro (WALLADE e RICE, 1977). Quanto ao R. sanguineus, sabe-se
somente que é largamente atraído por gás carbônico (STELLA et al., 1988; LOULY, 2003), e pelo latido do cão (SONENSHINE, 1993).
2.4. Fungos entomopatogênicos
Estes fungos penetram seus hospedeiros por meio da cutícula, a partir da produção de uma série de enzimas proteolíticas, quitinolíticas e lipolíticas, alcançando a hemolinfa, rica em nutrientes (ROBERTS et al., 1992). Além disso, produzem também metabólitos secundários tóxicos ou antibióticos, do grupo dos ciclopeptídeos, eliminando a competição e favorecendo seu estabelecimento e patogênese (HSIAO e KO, 2001). Garcia et al. (2004)
relataram os eventos envolvidos no mecanismo de adesão, penetração e colonização de fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus por M. anisopliae, descrevendo as lesões infringidas
nos órgãos internos do carrapato.
Pesquisas com fungos entomopatogênicos como controladores biológicos têm sido feitas visando auxiliar o estabelecimento de estratégias racionais e eficazes contra artrópodes de interesse comercial ou patogênicos (ALVES, 1998, CHANDLER et al., 2000). Destacam-se os trabalhos com Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana no controle de diferentes
espécies de carrapatos, tais como Amblyomma cajennense (SOUZA et al., 1999a; SOUZA et
al., 1999b; REIS et al., 2001; REIS et al., 2004), A. cooperi (REIS et al., 2003), A. dubitatum
(REIS et al., 2003), A. variegatum (KAAYA et al., 1996; KAAYA, 2000; MARANGA et al.,
2005), Rhipicephalus sanguineus (BARBOSA et al., 1997; SAMISH et al., 2001; GARCIA et
al., 2004; PRETTE et al., 2005) e R. (Boophilus) microplus (BITTENCOURT et al., 1996;
BITTENCOURT et al., 1997; CORREIA et al., 1998; BITTENCOURT et al., 1999; FRAZZON et al., 2000; BAHIENSE e BITTENCOURT, 2004).
Metarhizium anisopliae (METSCHNIKOFF, 1879; SOROKIN, 1883) é o fungo
entomopatogênico melhor caracterizado, sendo por esse motivo utilizado no controle de grande número de insetos-praga, entre os quais, a cigarrinha da cana-de-açúcar, a cigarrinha das pastagens (THOMAS et al., 1995; 1999; ALVES, 1998; BATISTA-FILHO e SANTOS,
GARCIA et al., 2004; BASSO et al., 2005; PRETTE et al., 2005), entre outros. Os insetos colonizados por Metarhizium tornam-se duros e cobertos por uma camada pulverulenta de
conídios, caracterizando a doença denominada “muscardina verde” (WANG et al., 2002). Alves (1998) relatou que os sintomas causados por esta patologia sobre o hospedeiro incluem inquietação, perda de sensibilidade ao toque e descoordenação dos movimentos. Segundo o mesmo autor, o ciclo de interação se completa entre 8-10 dias, dependendo das condições ambientais, condições nutricionais e susceptibilidade do hospedeiro (HALLWORTH e MAGAN, 1999).
FIGURA 6. (A) Observação microscópica (x20) das hifas septadas de
Metarhizium anisopliae; (B) Colônia simples de M. anisopliae em ágar Sabouraud
enriquecido com dextrose, após três semanas de crescimento; (C) Vista aproximada da colônia mostrada em (A), detalhando colunas de conídios; (D) Fotomicrografia (x920) de cadeias de conídios em M. anisopliae (Fontes: (A)
http://www.beedata.com/apis-uk/newsletters08/apis-uk1008.htm; (B-D) Sutton, D. A., Fothergill, A. W. and Rinaldi, M. G. Guide to clinically significant fungi,
Williams & Wilkins, Baltimore, 1998, p. 238–239).
Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (1912) é um fungo entomopatogênico de
distribuição cosmopolita, amplamente aplicado no controle de pragas (BELL e HAMALLE, 1970). Este fungo tornou-se conhecido internacionalmente pelo produto Boverin®, formulado e utilizado em grande escala pela ex- União Soviética em 1970, para o controle do besouro do Colorado, Leptinotarsa decemlineata (IGNOFFO, 1975). No Brasil, o fungo B. bassiana
ocorre em mais de 30 espécies de insetos. Já foi estudado para o controle de Diatraea
saccharalis (LECUONA e ALVES, 1988); de hemípteros, como o percevejo do
colmo-do-arroz, Tibraca limbativentris (MARTINS e LIMA, 1994); para Triatoma infestans, vetor da
A
C
B
doença-de-Chagas (LUZ et al., 1998); para o mosquito Anopheles stephensi, vetor da malária
(PRASAD e VEEWAL, 2010); Nezara viridula, Piezodorus guildinii e Euschistus heros
(pragas da soja) (SOSA-GÓMEZ e MOSCARDI, 1998) e recentemente, para o controle de carrapatos (BITTENCOURT et al., 1996; KAAYA et al., 1996; MONTEIRO et al., 1998; BITTENCOURT et al., 1999; BITTENCOURT et al., 2000; PAIÃO et al., 2001; REIS et al., 2003; REIS et al., 2004; PRETTE et al., 2005; KAENG-IN et al., 2007; BARCI et al., 2009). Em outros países foi estudado visando ao controle do hemíptero Riptortus linearis (praga da
soja) (HU et al., 1996), Leptoglossus zonatus (Coreidae) e Pachycoris klugii (Scutelleridae)
(pragas da nogueira) (GRIMM e GUHARAY, 1998). A capacidade de produção e obtenção de formulados a partir da associação deste fungo com diferentes compostos o tornou um dos mais comercializados no mundo (JIN et al., 2008). Segundo FARIA e WRAIGHT (2007), os produtos formulados com B. bassiana compreendem 33,9% do total de micoinsecticidas
desenvolvidos em nível mundial visando o controle de insetos, distribuídos entre Coleoptera, Hemiptera, Isoptera, Lepidoptera e Thysanoptera. Uma das formulações comerciais mais conhecidas recebe o nome de Mycotrol®, e é vendida tanto nos Estados Unidos quanto na Europa (GLARE, 2004).
Causador da epizootia denominada “muscardina branca”, este fungo caracteriza-se pela alta taxa de crescimento, produção elevada de unidades infectivas, capacidade de sobrevivência no ambiente, facilidade de penetração pelo tegumento e alcance da hemolinfa do hospedeiro, reafirmando sua alta patogenicidade (FUXA, 1987; ALVES, 1998). A relação patógeno/hospedeiro depende das espécies de insetos e das condições ambientais durante a ocorrência da doença (BARSON, 1977).
Em cultura, B. bassiana cresce geralmente rápido, cerca de 1 semana, com diâmetro da
Microscopicamente, as hifas são hialinas, septadas e estreitas. Os conídios são unicelulares e de formato globoso, com diâmetro variando de 2 a 4 µm. Células conidiogênicas são agrupadas em verticilos ao redor do conidióforo, formando densos cachos, os quais aparecem como pequenas bolas pulverulentas quando vistas em microscópio (LARONE, 1995; ST-GERMAIN e SUMMERBELL, 1996) (Figura 7B).
FIGURA 7. (A) Colônia simples de Beauveria bassiana em ágar Saboraud; (B)
Observação microscópica (x40) de três células conidiogênicas em hifa de B.
bassiana, detalhando-se os conídios localizados em estruturas agregadas nas
suas extremidades (Fontes: (A) http://phil.cdc.gov/phil/details.asp; (B) http://www.uoguelph.ca/~gbarron/MISCELLANEOUS/nov01.htm.
2.5. Fungos dermatófitos
Os dermatófitos são um grupo de fungos septados, algumas vezes artroconidiados, que têm a capacidade de invadir tecidos queratinizados (pele, cabelo, pêlo e unhas) de humanos e outros animais, para produzir uma infecção denominada dermatofitose ou micose superficial (TORTORA et al., 2012). A dermatofitose é uma doença extremamente contagiosa, cuja colonização se inicia na camada córnea da epiderme, crescendo dicotomicamente, de maneira circular e centrífuga, resultando, ao final de alguns dias, em uma lesão macroscópica denominada tinea ou “tinha”, classificadas de acordo com sua localização (SIDRIM e
MOREIRA, 1999; LACAZ et al., 1991). Os dermatófitos são transmitidos por contato com
pêlo e/ou caspa de animais infectados ou com o contato direto com elementos fúngicos, tais como artroconídios ou clamidósporos (MULLER e KIRK,1996).
Estes fungos apresentam uma predileção ecológica no que diz respeito à sua adaptação no meio ambiente. Dessa forma, podem ser divididos em três grandes grupos, de acordo com seu hábitat: geofílicos, zoofílicos e antropofílicos (FERNÀNDEZ-TORRES et al., 2003).
O grupo dos dermatófitos geofílicos apresenta como característica primária a habilidade de manter sua viabilidade em solos geralmente ricos em resíduos de queratina humana e/ou animal. Os zoofílicos se adaptaram à relação de parasitismo com animais que mantém um contato próximo com o solo e os dermatófitos antropofílicos parasitam apenas o homem (BRILHANTE et al., 2005).
Os dermatófitos são classificados em três gêneros: Trichophyton, Epidermophyton e
Microsporum. Para sua identificação deve-se observar o aspecto macroscópico das colônias,
bem como suas características microscópicas (GUPTA et al., 2006; JESSUP et al., 2000).
O gênero Trichophyton caracteriza-se pela presença de uma grande quantidade de
microconídios, de forma arredondada ou claviforme, associada a poucos macroconídios de forma clavada, dividido por septos finos e transversais, com superfície externa lisa (PEREA et al., 2001; FAVRE et al., 2003) (Figura 8A). Macroscopicamente a colônia é pulverulenta,
FIGURA 8. (A) Macroconídio e alguns microconídios de Trichophyton rubrum
var. rodhaini (x40); (B) Colônia de T. rubrum em ágar Saboraud (Fontes: (A)
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a2/Trichophyton_rubrum_var_ rodhaini.jpg; (B) http://provlab.ab.ca).
O gênero Microsporum caracteriza-se pela presença de estruturas de frutificação
conhecidas como macroconídios: conídios grandes, geralmente de forma navicular, divididos por septos transversais de espessura variável, com uma grande quantidade de protuberâncias em sua superfície que lhes conferem um aspecto verrucoso; e microconídeos: observados em menor número, bem menores e claviformes. Tanto os macroconídios quanto os microconídios ficam distribuídos ao longo das hifas (Figura 9A) (SIDRIM e ROCHA, 2004). Em cultura, formam colônias planas, aveludadas ou cotonosas, brancas ou amareladas, com reverso amarelo-ouro ou marrom claro. Exame microscópio revela abundantes macroconídios fusiformes de parede grossa, verrugosa e extremidades afiladas (Figura 9B) (LACAZ, 1998).
A maioria das espécies deste gênero é amplamente distribuída por todo o mundo, porém algumas possuem distribuição geográfica restrita (BRILHANTE et al., 2005). São numerosas
as espécies de Microsporum envolvidas em processos infecciosos humanos e animais tendo
sido mais frequentemente isoladas as espécies M. canis, M. gypseum, M. audouinii, M.
ferrugineum e M. nanum, prevalecendo as duas primeiras (FERNÁNDEZ-TORRES et al.,
2005; GUPTA et al., 2005; CARVALHAES, 1999).
FIGURA 9. (A) Observação microscópica (x40) dos macroconídeos de
Microsporum canis; (B) Colônia de M. canis em ágar Sabouraud (Fontes: (A)
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b0/Macroconidia_Microspor um_canis.JPG; (B) http://www.eol.org/pages/6551034).
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos Principais
Estudar a ação carrapaticida in vitro do extrato etanólico 70% de partes aéreas de
Tagetes patula contra diversas fases do ciclo de vida do ixodídeo Rhipicephalus sanguineus e
ainda, verificar a ação do extrato sobre o crescimento de fungos entomopatogênicos diretamente relacionados ao controle biológico deste carrapato, como M.etarhizium anisopliae
e Beauveria bassiana, bem como em fungos patogênicos intimamente associados com
animais domésticos, sobretudo cães.
3.2. Objetivos Secundários
Executar controle de qualidade farmacognóstico e microbiológico da droga vegetal; Executar a caracterização fitoquímica de extrato etanólico 70% e óleo essencial de
partes aéreas de T. patula;
Determinar a atividade anti-radicalar de extratos e óleo essencial de partes aéreas de T.
patula;
Determinar o potencial citotóxico de extratos e óleo essencial de partes aéreas de T.
patula em macrófagos J744;
Analisar microscopicamente ovários de fêmeas adultas ingurgitadas de R. sanguineus
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Solventes, reagentes e meios de cultura
2,2-Difenil-1-Picrilhidrazila – Vetec Caldo Peptonado – Himedia Acetato de Chumbo – Reagen Caldo Selenito Cistina – Himedia Acetona – Labsynth Caldo Tetrationato – Himedia Ácido 3-5 Dinitrobenzóico – Vetec Carbonato de Cálcio – Reagen Ácido Acético – Labsynth Cloreto de Alumínio – Reagen
Ácido Bórico – Labsynth Cloreto de Alumínio Hexahidratado – Vetec Ácido Clorídrico – Labsynth Cloreto Férrico – Reagen
Ácido Gálico - Merck Clorofórmio – Labsynth Ácido Oxálico - Labsynth Dimetilsulfóxido – Labsynth Ácido Propanóico – Labsynth Éter Etílico - Labsynth
Ácido Sulfúrico – Vetec Glicose – Leica
Ágar Bismuto Sulfito – Himedia Hexano – Labsynth
Ágar Cetrimida – Himedia Hexano Grau HPLC – Mallinkrodt Ágar Eosina-Azul de Metileno – Himedia Hidróxido de Sódio – Labsynth Ágar Mac Conkey – Himedia Meio RPMI-1640 – Sigma Aldrich Ágar Saboraud – Acumedia Nitroprussiato de Sódio – Reagen Ágar Tioglicolato – Himedia Quercetina – Merck
Ágar Tríplice Açúcar Ferro – Himedia Reagente de Dragendorff – Merk Ágar Verde Brilhante – Himedia Resazurina – Invitrogen
Ágar Vögel-Johnson – Himedia Sephadex LH-20 – Pharmacia Biotech Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato – Himedia Soro Bovino Fetal – Invitrogen
