Determinação do teor de flavonóides totais

O teor de flavonóides totais foi estimado utilizando-se um método colorimétrico baseado na formação de um complexo flavonóide-alumínio (DJERIDANE et al., 2006). Todas as determinações foram feitas em triplicata e os valores foram calculados a partir de uma curva de calibração obtida com concentrações conhecidas do padrão quercetina. Resultados finais foram expressos em concentração de flavonóides totais frente à concentração inicial de leitura das amostras, executadas no comprimento de onda de 430 nm, em espectrofotômetro Shimadzu-UV-1603, utilizando-se cubetas de quartzo de 1,0 cm de caminho óptico.

4.8.1. Curva analítica para quantificação de flavonóides totais

Foram diluídos 1,0 mg de quercetina (95%, Merck®) em 2,0 mL de metanol (MeOH) 80% (v/v) e desta solução, diferentes alíquotas (2,0, 4,0, 8,0, 16,0, 32,0, 64,0 e 128,0 ȝL) foram adicionadas a 2,0 mL de solução de cloreto de alumínio hexahidratado (AlCl3.6H2O)

2% em MeOH (v/v), completando o volume para 4,0 mL com MeOH 80%, obtendo-se as concentrações de leitura 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 4,00, 8,00 e 16,00 ȝg/mL. Como branco do sistema, utilizou-se solução de metanol 80% (v/v). A leitura foi feita após 15 minutos de reação colorimétrica no escuro.

4.8.2. Preparo das soluções-teste a partir dos extratos vegetais

As soluções-teste foram preparadas a partir dos extratos etanólicos 70% de partes aéreas (PA) e flores (Fl) de T. patula. Inicialmente foram preparadas soluções-estoque, diluindo-se

10,0 mg de cada extrato em 20,0 mL de MeOH 80% (v/v). Alíquotas de cada solução-estoque foram adicionadas a 2,0 mL de AlCl3.(6H2O) 2% em MeOH (v/v), completando o volume

final para 4,0 mL em solução de MeOH 80% (v/v). A leitura foi feita em triplicata após 15 minutos de reação colorimétrica no escuro.

4.9. Caracterização e identificação dos constituintes químicos de T. patula

O conjunto de atividades relacionadas à caracterização e identificação dos principais constituintes químicos do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (PAEtOH70%)

foram executados sob a supervisão do Prof. Dr. Wagner Vilegas, no Instituto de Química (IQ) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) de Araraquara (SP).

4.9.1. Fracionamento do extrato bruto de partes aéreas de T. patula

O extrato PAEtOH70% foi fracionado através de Cromatografia de Permeação em Gel

(GPC). A amostra foi preparada diluindo-se 3,0 g de PAEtOH70% em 10,0 mL de MeOH:H2O

(8:2, v/v). Após solubilização, a amostra foi centrifugada e o precipitado descartado. A solução foi injetada em coluna de vidro (80 cm de altura x 20 cm de diâmetro), empacotada com Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech®) e eluída com MeOH:H2O (8:2, v/v). O solvente

foi bombeado para a coluna com o auxílio de uma bomba peristáltica (Pharmacia Biotech®) com fluxo de 2,0 mL/min. As frações foram coletadas em um coletor automático Redifrac (Pharmacia Biotech®), programado para reunir 200 gotas/tubo.

As frações obtidas, além dos padrões rutina (95%, Merck®) e quercetina (95%, Merck®), foram posteriormente analisadas por meio de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), utilizando-se placas de sílica gel 60 F254 (Merck®). As cromatoplacas

foram eluídas em sistema quaternário clorofórmio/metanol/n-propanol/água (5:6:1:4, v/v/v/v) e nebulizadas com anisaldeído sulfúrico (0,5 mL de anisaldeído misturado com 10,0 mL de

ácido acético glacial, 85,0 mL de MeOH e 5,0 mL de ácido sulfúrico concentrado). A revelação das substâncias deu-se em estufa aquecida a 50 °C (Marconi®, modelo MA 033/3), por aproximadamente 3 minutos.

4.9.2. Perfil cromatográfico do extrato bruto por CLAE-UV-DAD

Para o delineamento do perfil cromatográfico, a amostra foi preparada diluindo-se 5,0 mg do extrato PAEtOH70% em 20,0 mL de MeOH:H2O (8:2, v/v). Esta solução foi filtrada em

filtro Millex de 0,45 ȝm e então injetada em cromatógrafo líquido de alta eficiência (analítico, gradiente exploratório 5-100% MeOH, 60 minutos, fluxo 1,0 mL/minuto) modelo PU-2089 Plus (Jasco®), acoplado a um detector de arranjo de foto diodos com faixa de varredura de 195-600 nm e intervalo mínimo de 1 nm, modelo MD-2010 (Jasco®). A aquisição e processamento dos dados foram realizados utilizando-se o software Star Chromatography Workstation versão 5.3.1 (Varian®). Foi utilizada coluna de fase reversa RP C18 imobilizada com octadecilsilano, modelo LUNA 2 (Phenomenex®) de 250 x 4,6 mm de diâmetro interno (i.d.), apresentando partículas com tamanho médio de 5µm. A amostra foi injetada através de um injetor Rheodyne® 7125 com loop de 20 µL.

4.9.3. Espectrometria de massas

Os espectros de massas do extrato PAEtOH70% foram obtidos em um espectrômetro de

massas LCQ Fleet (Thermo Scientific®), equipado com um dispositivo de inserção direta da amostra via análise por injeção em fluxo (FIA). A matriz estudada foi analisada no modo de ionização por eletrospray (ESI) e as fragmentações em múltiplos estágios (MS2, MS3, MSn) realizadas numa interface do tipo íon-trap (IT). O modo negativo foi escolhido para a geração e análise dos espectros de massas em primeira ordem (MS), bem como para os demais experimentos em múltiplos estágios (MSn), sob as seguintes condições: voltagem do capilar -

25 V, voltagem do spray - 5 kV, temperatura do capilar 275 ºC, gás de arraste nitrogênio (N2)

com fluxo de 8 unidades arbitrárias (u.a.), gás de colisão hélio (He). A faixa de aquisição foi 100-2000 m/z. O software Xcalibur versão 1.3 (Thermo Finigan®) foi utilizado para a aquisição e processamento dos dados.

O preparo da amostra consistiu na solubilização do extrato PAEtOH70% em MeOH

(Baker®, grau HPLC), obtendo-se uma solução de concentração 1,0 mg/mL, o qual foi filtrada em uma membrana de politetrafluoretileno expandido (PTFE) com poros de 0,45 ȝm. A solução final foi introduzida diretamente na fonte de ESI por meio de uma seringa de vidro impulsionada por um sistema de bombeamento em fluxo de 20,0 ȝL/min.

4.10. Identificação dos constituintes químicos do óleo essencial por CG-EM

A constituição química do óleo essencial de partes aéreas de Tagetes patula foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), utilizando-se aparelho Shimadzu QP2010 Plus (Shimadzu Corporation®), equipado com injetor automático AOC-20i, fonte de ionização por elétrons (EI-EM) e analisador quadrupolar, com supervisão da Profa. Dra. Ana Helena Januário, da Universidade de Franca (UNIFRAN). Para a dissolução da amostra foi utilizado hexano grau HPLC (Mallinkrodt®).

A separação cromatográfica foi realizada em coluna capilar Rtx-5 (Restek®) de sílica fundida (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 de filme), composta de 5% de difenilsiloxano e 95% de dimetilpolisiloxano, semelhante a uma coluna DB-5 (Agilent J&W®). Como gás de arraste, foi utilizado hélio (99,999 %) a um fluxo constante de 1,0 mL.min-1. A temperatura do injetor foi de 240 oC e o volume de injeção foi de 0,1 µL. A temperatura do forno foi programada de 60 oC a 240 oC, com velocidade de 3 oC.min-1.

Para a padronização dos tempos de retenção foi adicionada a cada amostra uma mistura de hidrocarbonetos alifáticos (C8 a C26). Os índices de retenção de Kovats (IK) foram

calculados de acordo com a Equação 2:

Equação 2: IK = 100Z + 100[(log t’R X) - (log t’R Z)] / [(log t’R Z+1) - (log t’R Z)]

Onde:

X = composto de interesse; t’R X = tempo de retenção ajustado de X; Z = número de

átomos de carbono do hidrocarboneto com tempo de retenção imediatamente anterior ao tempo de retenção de X; log t’R Z = tempo de retenção ajustado de Z; t’R Z+1 = tempo de

retenção ajustado do hidrocarboneto com tempo de retenção imediatamente posterior ao tempo de retenção de X.

A amostra eluída da coluna cromatográfica foi direcionada pelo divisor de fluxo para a fonte de ionização, na razão de 1:20. A temperatura da fonte foi ajustada em 280 oC e a energia do feixe de elétrons foi de 70 eV. O analisador foi controlado para separar íons de m/z entre 40 e 600. Os espectros de massas obtidos foram comparados com os das bibliotecas Wiley 7, NIST 08 e FFNSC 1.2 através do software GC-MS Solution (Shimadzu®), que forneceu o índice de similaridade (IS), expresso em porcentagem. A identificação final de cada constituinte químico presente no óleo essencial foi feita com base na comparação entre os valores do índice de similaridade (IS) e do índice de Kovats (IK) com os dados disponíveis na literatura.