Durante as últimas décadas, o interesse público e de profissionais da área de saúde tem se voltado para terapias naturais à base de fitoterápicos, não só em países em desenvolvimento como também nas potências econômicas mundiais, o que tem atraído atenção das multinacionais farmacêuticas, encorajando-as a investir milhões nesta área de pesquisa. Porém, mesmo com toda esta expansão, ainda falta muito no que diz respeito à padronização, regularização e comprovação das atividades farmacológicas da grande maioria dos produtos naturais comercializados. No Brasil, o Ministério da Saúde, através da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), vem instituindo uma série de normas com o objetivo de organizar a produção dos medicamentos fitoterápicos comercializados no país. Para obter os registros de comercialização junto a ANVISA, as empresas produtoras precisam cumprir uma série de procedimentos, indispensáveis para a preparação dos produtos dentro de padrões de qualidade. A legislação que rege o registro destes medicamentos é a RDC 48/04, sendo complementada pelas RE 88, 89, 90 e 91/04 (BRASIL, 2004). No entanto, tal norma foi editada com enfoque predominantemente voltado às boas práticas farmacêuticas e com exigências de controle de qualidade específicas para fármacos sintéticos, geralmente inaplicáveis aos produtos da classe de fitoterápicos (TOBIAS, 2007).
A garantia da qualidade do material vegetal a ser processado é fundamental no preparo de fitoterápicos, considerando-se os aspectos botânicos, químicos, farmacológicos e de pureza. Por esse motivo, além da constituição fitoquímica, teor de substâncias ativas e da intensidade das atividades farmacológica e toxicológica, outros aspectos de qualidade a serem avaliados são a contaminação microbiana, presença de materiais estranhos, pH, teor de extrativos, dentre outros (BRASIL, 2000). Estabelecer estes parâmetros contribui para garantir o uso seguro e racional de extrativos oriundos de drogas vegetais, contrapondo-se à idéia errônea de que o que é natural não faz mal.
A granulometria, que é o grau de divisão do pó, expresso em referência à abertura nominal da malha do tamis utilizado, é um parâmetro importante a ser estabelecido, pois representa uma influência direta sobre a eficiência no processo extrativo. Segundo a literatura (LIST e SCHMIDT, 2000), a droga pulverizada que apresente partículas de tamanho superior à classificação de fino é mais adequada para os processos de extração. Para as amostras utilizadas neste trabalho, obteve-se um pó com granulação moderadamente grossa, o que favoreceu o processo extrativo por percolação.
O teor de cinzas totais é composto pelo resíduo inorgânico não volátil, resultante da calcinação das substâncias orgânicas em condições apropriadas. Originam-se, fundamentalmente, dos constituintes minerais e dos organometálicos integrantes das plantas (cinzas fisiológicas) e de materiais estranhos, especialmente terra e areia aderidos à superfície da droga (cinzas não fisiológicas) (VIGO et al., 2004; SIMÕES et al., 2007). O conteúdo de cinzas totais constitui, dentro de certos limites, um índice individual simultaneamente de identificação e pureza, permitindo a verificação de contaminações na amostra. Há, portanto, a necessidade de se estabelecer um âmbito de variação dentro do qual se considere o teor de cinzas totais aceitável, impedindo possíveis adulterações do material vegetal. Como não há trabalhos na literatura que mencionem determinações prévias do teor de cinzas em amostras de T. patula, o valor de 13,93% aqui apresentado fica como referência.
A determinação da perda por secagem de materiais vegetais se mostra importante, pois impede que o material permaneça úmido devido à secagem ineficiente ou que haja degradação de compostos por secagem excessiva. Este parâmetro também está vinculado à estabilidade microbiológica da droga, como expressão de sua susceptibilidade ao desenvolvimento de fungos e bactérias, e estabilidade química, representada especialmente pelos processos de hidrólise (WHO, 1998). A variabilidade nos valores pode ser reduzida, desde que haja padronização nos parâmetros de plantio, coleta, armazenagem e tratamento prévio da droga
utilizada. A perda por dessecação pode ainda, fornecer dados acerca do rendimento de extração, já que a secagem influi no estado de integridade das estruturas celulares, expondo-as mais ou menos ao contato com solventes (HARBORNE, 1998). Embora não existam dados de referência na literatura para T. patula, os valores encontrados para perda por dessecação em dessecação em estufa, estão abaixo dos limites máximos encontrados no código oficial brasileiro (8 a 14% de umidade), com relação à maioria das drogas vegetais (FARMACOPÉIA, 2000).
Uma das importâncias do pH nos vegetais está no mecanismo de formação de ATP, que é impulsionado por uma força próton-motriz durante processo de quimiosmose na fotofosforilação nos cloroplastos (STRAYER, 1996). O ATP é uma molécula de alta energia, que acopla reações não favoráveis no interior das células. Entre essas reações, estão aquelas que fazem parte da biossíntese de enzimas importantes no metabolismo secundário (STRAYER, 1996). As alterações metabólicas provocadas por reações de óxido-redução podem modificar o pH das células vegetais, promovendo desvio das rotas metabólicas normais (STRAYER, 1996). Encontram-se nas plantas, diversos ácidos minerais pertencentes a diversos grupos, em geral, combinados sob a forma de sais, ésteres, lactonas, nos lipídeos, essências, resinas, proteínas, dentre outros. Uma parte destes ácidos encontra-se também no estado livre, solubilizados no citoplasma, portanto, podem ser doseados e caracterizar determinada droga vegetal como possuidora de caráter ácido ou básico.
O ensaio do teor de extrativos indica a quantidade de substâncias extraíveis, ou seja, solúveis em determinado sistema solvente. É um método empregado como indicativo para o ajuste da quantidade de matéria-prima a ser utilizada visando uma concentração final determinada de substância de interesse no produto da extração. Neste estudo, o teor de extrativos da droga vegetal foi empregado exclusivamente como um ensaio auxiliar na caracterização físico-química, visto que se trata de um parâmetro importante no controle de
qualidade da matéria-prima vegetal. Oliveira et al. (2001), determinaram o teor de extrativos para Achyrocline satureioides (Asteraceae), tendo encontrado um valor médio de 15,60%, menos da metade do valor determinado neste trabalho para Tagetes patula (Asteraceae) (TE = 44,83%).
Além dos aspectos físico-químicos, o controle microbiológico é indispensável para a garantia da qualidade de extratos vegetais com finalidades terapêuticas. Em geral, os materiais vegetais contêm um grande número de fungos e bactérias pertencentes à sua microbiota natural ou que são introduzidos durante o seu processamento (ABOU-ARAB et al., 1999; DE SMET, 2004; FENNELL et al., 2004; MANDEEL, 2005). Condições inadequadas de manipulação, estocagem, transporte e/ou irrigação com água contaminada são parâmetros importantes a serem considerados no controle de produtos naturais. A qualidade microbiológica não só de fitoterápicos, mas de medicamentos e cosméticos é definida por padrões microbianos descritos em compêndios oficiais e normas regulamentadoras, tais como a Farmacopéia Brasileira (1988), a Farmacopéia Britânica (BRITISH PHARMACOPEIA, 2001), a Farmacopéia dos Estados Unidos (USP, 2003), dentre outras. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estipula em seu documento intitulado “Quality Control Method For
Medicinal Plant Materials” os limites máximos de contaminação para produtos de origem
natural (WHO, 1998). No caso da droga vegetal os resultados indicaram o crescimento microbiano acima do aceitável na contagem total de micro-organismos e também nos testes específicos para E. coli, Salmonella sp., S. aureus e P. aeruginosa. Por se tratar do material bruto, sem ter passado por nenhum processo de tratamento, esperava-se algum nível de contaminação, porém, os resultados obtidos estão muito acima do tolerável. Ao repetirem-se os testes, desta vez com os extratos etanólicos 70% de partes aéreas (PAEtOH70%) e flores
pelas normas da OMS, constatando-se que o solvente empregado na extração mostrou-se um eficiente agente antimicrobiano.
Os processos de prospecção fitoquímica são de extrema importância, pois permitem identificar quais classes de metabólitos secundários e/ou princípios ativos estão presentes em determinada amostra vegetal e, a partir daí, orientar a extração e/ou fracionamento de extratos para isolamento de compostos de maior interesse. Muitas substâncias, quando tratadas com determinados reativos, apresentam reações de coloração e/ou precipitação características, que permitem a identificação das amostras que as contêm. As plantas produzem diferentes substâncias químicas e o fazem em diferentes proporções, dependendo do hábitat, do regime de chuvas, da insolação, do solo, enfim, das características edafoclimáticas. Entretanto, algumas substâncias químicas são bastantes características para um determinado vegetal, e desta forma podem servir como parâmetro para sua caracterização e identificação. Assim, a triagem fitoquímica preliminar revelou os flavonóides e as saponinas como grupos de substâncias químicas constituintes da droga vegetal. Os resultados obtidos com testes simples de reações colorimétricas e/ou formação de precipitados corroboram as informações contidas na literatura que atestam a presença de flavonóides e outros derivados fenólicos em diversas espécies de Tagetes.
Tendo em vista que o ensaio da constituição fitoquímica apontou a presença preponderante de flavonóides no extrato de T. patula, foi realizada a quantificação desta importante classe de metabólitos secundários. A maneira mais precisa e recomendável de se identificar e quantificar flavonóides em produtos naturais é a análise por cromatografia líquida de alta eficiência. Porém, quando se trata de controle de qualidade, é conveniente a utilização de alternativas analíticas mais simples e acessíveis, pois nesses casos se requer procedimentos que permitam a análise rápida e reprodutível de amostras numerosas e em laboratórios geralmente modestos no que se refere ao instrumental disponível. Uma das
técnicas que se enquadram bem nesse contexto e que foi utilizada neste estudo é o ensaio colorimétrico de complexação do cloreto de alumínio com o núcleo flavonoídico dos compostos presentes na amostra (WOISKY e SALATINO, 1998). Trata-se de um método preciso e reprodutível, fornecendo desvios muito pequenos ou nulos entre um ensaio e outro com a mesma amostra. Outros compostos fenólicos, que comumente acompanham os flavonóides nos tecidos vegetais, mesmo formando complexos com AlCl3, absorvem em comprimentos de onda inferiores aos utilizados na leitura, minimizando interferências nas medidas de absorvância (MARKHAM, 1982). No entanto, o valor fornecido pode ser ligeiramente diferente em relação à quantidade de flavonóides totais realmente presente na amostra analisada. De maneira geral, o valor medido e o valor real são tanto mais próximos entre si quanto maior a proporção de flavonóis na amostra, e tanto mais distantes quanto maior a proporção de flavonas, já que complexos derivados destes compostos absorvem em comprimentos de onda inferiores a 425 nm (WOISKY e SALATINO, 1998). Em nosso trabalho, os resultados obtidos com o extrato etanólico 70% de partes aéreas (CFT = 72,74 mgEQ/g) e extrato etanólico 70% de flores (CFT = 124,59 mgEQ/g) de Tagetes patula, estão na média do encontrado em outros trabalhos com plantas do mesmo gênero. Gong et al. (2012), utilizando extrato etanólico 70% de Tagetes erecta encontraram um teor de flavonóides totais de 109,38 mgER/g (miligramas de equivalentes de rutina por grama de extrato seco). Estes resultados estão bem acima da média dos encontrados para plantas de outras espécies, por exemplo, o valor de teor de flavonóides totais de 31,15 mgC/g (miligramas de catequina por grama de extrato seco) estabelecido por Hajimahmoodi et al. (2008) para Punica granatum (Punicaceae).
O acoplamento entre o cromatógrafo líquido e o espectrômetro de massas (CLAE-EM) é uma técnica muito valiosa na caracterização dos constituintes químicos de extratos naturais. O espectrômetro de massas é um detector universal e, portanto, esse acoplamento traz uma
economia de tempo na análise de um extrato vegetal, pois evita o isolamento dos constituintes químicos. Além da separação cromatográfica e de informações do peso molecular das substâncias, também são obtidos fragmentos das moléculas em análise, que são importantes para a elucidação estrutural de diferentes classes de metabólitos secundários (XING et al., 2007). Devido à sua grande sensibilidade, este sistema muitas vezes consegue detectar compostos minoritários difíceis de serem isolados por técnicas clássicas de fitoquímica (ZHOU et al, 1996). A técnica de injeção em fluxo (FIA) fornece-nos informações espectrais sobre a constituição das matrizes avaliadas de forma rápida e direta, sem a necessidade de etapas de pré-tratamento e/ou de separações cromatográficas.
A fragmentação de segunda ordem (MS/MS) para cada um dos íons mais representativos levou à identificação de metabólitos secundários, observando a presença de flavonóides O-glicosilados. Nos flavonóide O-glicosilados a ligação O–C é mais susceptível a clivagens. A quebra e o concomitante rearranjo do hidrogênio da hidroxila levam à eliminação de resíduos de monossacarídeos, com perdas de 176u (ácido urônico), 162u (hexose), 146u (deoxihexose) ou 132u (pentose), permitindo a determinação da seqüência de carboidratos presentes nas agliconas (WOLFENDER et al., 1992).
Quando comparado ao modo positivo, o modo negativo conduziu a resultados mais elucidativos para a obtenção da composição química do extrato de T. patula. Desta forma, embora o modo positivo tenha sido avaliado, somente os resultados em modo negativo foram apresentados, fornecendo-nos um total de 12 possíveis compostos na constituição do extrato etanólico 70% de partes aéreas de T. patula (canferol, patuletina, quercetina-3-O-xilose, isoquercitrina ou quercetina-3-O-galactosídeo, patulitrina ou 6-O-metil-quercetina-3-O- glicosídeo, quercetina-3-O-raminosil-O-xilosídeo, quercetina-3-O-di-raminosídeo, quercetina- 3-O-glicosil-7-O-raminosil, quercetina-3-O-raminosil-7-O-glicosil, canferol-3-O-di- hexosídeo, quercetina-3-O-hexosídeo-galoil e canferol-3-O-raminosídeo-galoil).
A composição do óleo mostra uma grande variabilidade no gênero Tagetes e sua diversidade química, que é geneticamente determinada e estritamente relacionada à espécie, pode representar uma alternativa para sua identificação taxonômica (LAWRENCE, 1985). Muitos fatores tais como a localização dos canteiros onde a espécie é cultivada, estágio de desenvolvimento, diferentes partes utilizadas do vegetal (CHALCHAT et al., 1995; SZARKA et al., 2006), bem como a composição e fertilização do solo (STOJANOVA et al., 2000) podem influenciar a constituição e a razão quantitativa dos principais componentes do óleo dentro de uma mesma espécie (MAROTTI et al, 1994).
Neste trabalho, foram identificados 55 compostos no óleo essencial de partes aéreas de
T. patula, representando 82,08% do total. Os majoritários foram 4-vinil-guaiacol (8,55%),
gama-terpineno (8,40%), limoneno (6,32%), 3,9-epoxi-para-menta-1,8(10)-Dieno (6,21%), (E)-tagetona (5,32%), rotundifolona (4,64%), 1,3,8-para-mentatrieno (3,93%), alfa-ocimeno (3,44%), óxido de cariofileno (3,66%), nerolidol (3,23%), cis-epoxi-ocimeno (2,71%), dihidrotagetona (2,31%) e trans-beta-ocimeno (2,27%). Os demais compostos são citados em outros trabalhos com o óleo essencial de T. patula (DHARMAGADDA et al., 2005; ROMAGNOLI et al., 2005; SZARKA et el., 2006; SZARKA et el. 2008; RESTELLO et al., 2009) ou com o óleo essencial de outras espécies do gênero Tagetes (GILLIJ et al., 2008; CHAMORRO et al., 2011; MESHKATALSADAT et al., 2010; VÁZQUEZ et al., 2011).
Alguns dos constituintes do óleo essencial descritos neste trabalho possuem uma gama de atividades biológicas já descritas na literatura, por exemplo, as ocimenonas, que mostram atividade antifúngica e larvicida (ZYGADLO et al., 1994) e dihidrotagetona, tagetonas e limoneno, que possuem ação inibidora do crescimento de bactérias Gram positivas e Gram negativas (HÉTHÉLYI et al., 1986; RONDON et al., 2006).
Nos organismos vivos, o estresse oxidativo leva à formação de compostos potencialmente tóxicos, denominados radicais livres, que contribuem para o envelhecimento
precoce de células, aumentando o risco do aparecimento de doenças cardíacas e degenerativas. Este processo está relacionado à ação de espécies reativas de oxigênio em componentes metabólicos vitais, como lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos. Estas espécies reativas incluem o oxigênio singlete, o ânion superóxido, o ânion peróxido e ao radical hidroxila, que podem ser gerados durante a respiração celular, pela ativação de leucócitos ou por oxidação exógena, causada em resposta a fatores ambientais tais como poluição atmosférica, fumaça de cigarros, radiações ionizantes, fármacos, xenobióticos, infecções microbianas, etc (BECKER et al., 2004).
Existe um interesse crescente na descoberta de novos antioxidantes de origem natural, que substituam antioxidantes sintéticos como o butilhidroxianisol (BHA) e o butil- hidroxitolueno (BHT), utilizados na preservação da qualidade e segurança de alimentos, cosméticos e medicamentos. Esta procura deve-se ao fato destes antioxidantes sintéticos possuírem uma grande volatilidade e instabilidade a temperaturas elevadas, por apresentarem alguma toxicidade e por serem menos potentes que os agentes antioxidantes naturais (SHI et al., 2001; SEABRA et al., 2006).
Dentre os métodos espectrofotométricos in vitro mais utilizados atualmente para a determinação do potencial antioxidante de determinado composto puro ou extrato complexo, destaca-se o ensaio do DPPH (ROBARDS, 2003). O DPPH é um radical livre estável, para o qual as substâncias antioxidantes transferem elétrons ou átomos de hidrogênio, neutralizando seu caráter radicalar (NAIK et al., 2003). Quando o processo antioxidante ocorre, a coloração da solução metanólica de DPPH muda sua coloração de violeta para amarelo e a absorvância, a 517 nm, diminui (BANERJEE et al., 2005).
Neste trabalho, a análise de variância demonstrou que os extratos testados apresentaram valores semelhantes de atividade anti-radicalar quando comparados entre si e também quando comparados com os padrões (ácido gálico, vitamina C, quercetina e rutina), destacando-se o
extrato etalólico 70% de flores de T. patula (FlEtOH70%), o qual apresentou atividade anti-
radicalar de 93,35%, superior à dos padrões ácido gálico, quercetina e rutina (93,15%, 92,32% e 91,07%, respectivamente). Para efeito de comparação, Li et al. (2007) obtiveram com extrato etanólico de T. erecta o valor de 93,00% de atividade anti-radicalar para o cultivar
Xinhong, porém, para os demais cultivares, a média da atividade foi de 75,59%. O grande
potencial anti-radicalar apresentado pelos extratos está relacionado ao seus teores elevados de flavonóides. É geralmente assumido que a atividade antioxidante ou anti-radicalar máxima dos flavonóides é devida principalmente à ocorrência da dupla ligação 2,3 em combinação com o grupo 4-ceto no anel C, e à presença adicional de grupos hidroxila nas posições 3’, 4’ no anel B e grupo hidroxila na posição 7 do anel B (RICE-EVANS et al., 1995). Tais interações são observadas nos compostos identificados neste trabalho (Figura 29).
Uma vez demonstrado o potencial antioxidante dos extratos etanólicos de partes aéreas e de flores de T. patula, tornou-se imperativo conhecer a citotoxicidade que eles poderiam apresentar. Para tanto, utilizou-se metodologia para determinação de morte celular segundo Ahmed et al. (1994). Neste método, o ensaio é feito sobre monocamada de cultura de células de mamíferos (macrófagos da linhagem J774). A cultura em monocamada, inclusive de outras linhagens celulares, é uma das alternativas mais amplamente utilizadas entre os testes de citotoxicidade, pois oferece flexibilidade quanto ao tempo de exposição e quantificação do efeito da amostra. O ensaio requer um reduzido número de células, sendo facilmente manipulado utilizando-se microplacas de 96 poços, as quais permitem análise de ampla faixa de concentrações, com baixo custo e sem adição de compostos radioativos. Para a leitura dos resultados (verificação e quantificação de células vivas e mortas) utilizou-se o corante denominado resazurina, comercialmente conhecido como alamar Blue®. A forma oxidada da resazurina apresenta coloração azul não fluorescente. Em presença de células vivas, esta forma oxidada do corante torna-se reduzida à forma fluorescente de coloração rosa,
denominada resorufina, por ação de enzimas mitocondriais, absorvendo luz em 590 nm. Os resultados apresentados neste trabalho indicam que o extrato hexânico de flores de T. patula (FlHexano) apresentou o maior IC50 (750,0 µg/mL), porém, na maior concentração testada (2000
µg/mL), foi tão citotóxico quanto os demais. Ainda sobre essa concentração, com exceção do extrato metanólico de flores (FlMeOH) e do extrato etanólico 70% de flores (FlEtOH70%), que
proporcionaram considerável índice de viabilidade celular (33,48% e 23,18%, respectivamente), todos os extratos foram quase que totalmente letais às células de macrófagos. Na média, até a concentração de 250 µg/mL, o único extrato que apresentou índice de citotoxicidade superior a 50% foi o extrato etanólico 70% de partes aéreas de T.
patula (PAEtOH70%) (57,96% de lise celular), sendo também o extrato que apresentou o menor
IC50. Por ter sido utilizado nos ensaios carrapaticidas, seria interessante a realização de novas
análises citotóxicas, utilizando-se outras linhagens celulares, a fim de se garantir a segurança dos animais que eventualmente venham a receber a aplicação de um possível produto final. É bom lembrar que entre as concentrações de 15,625 µg/mL e 125,0 µg/mL, todos os extratos apresentaram valores de viabilidade celular aceitável (mínimo de 66,59% para PAEtOH70% e
máximo de 100% para FlHexano, PAEtOH70% e FlEtOH70%). O teste de Tukey (p < 0,05) revelou
que os extratos preparados com flores apresentaram índices de citotoxicidade inferiores aos apresentados por extratos preparados com partes aéreas de T. patula. Em relação ao óleo essencial ele apresentou elevados índices de citotoxicidade mesmo nas concentrações mais baixas, atingindo quase 100% de letalidade a 1,5% (10,95 mg/mL). Se formos imaginar o uso de um produto à base do óleo de T. patula como inseticida, ou mesmo como carrapaticida, para ser aspergido no ambiente, poderiam ser obtidos resultados excelentes, como os mencionados no trabalho de Dharmagadda et al. (2005), porém, se formos imaginar uma formulação de uso tópico em animais domésticos, seriam necessários novos estudos de citotoxicidade a fim de garantir a segurança de sua aplicação.
Os micro-organismos patogênicos que causam doenças oportunistas em humanos merecem cuidadosa atenção, como os fungos dermatófitos do gênero Trichophyton, que infectam indivíduos saudáveis, causando infecções de estruturas queratinizadas, incluindo pele, cabelos e unhas (RICHARDSON, 1993). Trychophyton rubrum e Trychophyton
metagrophytes são distribuídos mundialmente, sendo disseminados pelo contato direto com