4 MATERIAL E MÉTODOS 1 Material
4.2 Caracterização do complexo de inclusão ATC HPβCD
4.2.1 Prepação do complexo de inclusão ATCHPβCD
O complexo de inclusão foi preparado misturando quantidades apropriadas de ATC e HPβCD em água deionizada pH 6,8. As soluções foram mantidas sob agitação durante 24 h a temperatura ambiente. Após o tempo de equilíbrio a solução foi congelada a -20°C e posteriormente liofilizada por 72 h (Lyo Chamber Guard Christ LCG, Alfa 2-4 LD Plus; Nova Analitica, Germany). Após esse processo, o complexo foi armazenado a -20°C para posterior uso (Dollo et al., 1998; Loftsson & Masson, 2001).
4.2.2 Análise de absorção por UV-Vis
Uma solução padrão de ATC (100 μg/mL) foi preparada por dissolução de 1 mg de ATC em 10 mL de água deionizada pH 6,8. Alíquotas de 100 μL a 600 μL de solução padrão foram transferidas para uma série tubos eppendorf de 1500 μL calibrados e o volume final de 1000 μL foi ajustado com agua deionizada pH 6,8 (modificado de Pradeep et al., 2011). Posteriormente, foi realizada uma leitura da absorção no intervalo de 200 – 400 nm (Beckman DU® Spectrophotometer UV-Vis,
USA) em relação ao veículo (agua deionizada pH 6,8), usando células de quartzo com um comprimento de percurso optimizado de 1 cm. Além disso, a interação entre a HPβCD e a ATC foi também avaliada por esse método, onde os espectros foram
também registados na presença da HPβCD, em diferentes razões molares (1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:75, e 1:100). Todos os experimentos foram realizados em água deionizada, a pH 6,8 e 25°C (de Lima et al., 2012).
4.2.3 Ensaio de fluorimetria
Neste ensaio, os espectros de fluorimetria da ATC e do ATCHPβCD contendo diferentes razões molares diluídas em água deionizada pH 6,8 foram registrados no comprimento de onda de excitação máxima da ATC e de emissão a 320 nm – 420 nm. As leituras foram realizadas utilizando o fluorómetro F-4500 (Hitachi, Japão), a 25°C (de Lima et al., 2012)
4.2.4 Determinação da estequiometria do complexo de inclusão
Considerando a alta solubilidade relativa da ATC a pH 6,8 foi usada a técnica de titulação o que permite monitorar as mudanças no comportamento químico da ATC após a formação do complexo de inclusão. Assim, o valor máximo de emissão de fluorescência da ATC foi avaliado. Neste caso a cavidade da HPβCD funciona como um solvente orgânico e sua adição a uma solução aquosa de ATC irá mudar a fluorescência da molécula hóspede, semelhante a outros compostos hóspedes (Sadlej-Sosnowska, 1997).
Os espectros da emissão de fluorescência da ATC foram registrados usando como veículo água deionizada, e após a adição de concentrações crescentes de HPβCD (razões molares ATC: HPβCD de 1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:75, e 1:100).
Para avaliar a estequiometria de complexação da ATC com a HPβCD, o valor de
r (razão molar ATC/HPβCD) foi determinado por job plot (Connors, 1987) segundo a
formula seguinte:
𝑟 = [𝐴𝑇𝐶]
{[𝐴𝑇𝐶]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙+[HPβCD]𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙} (Equação 1)
Este método de variação contínua, permite que um parâmetro físico diretamente relacionado com a concentração do complexo possa ser medido e representado graficamente em função de r (por exemplo, a intensidade de fluorescência "I" neste experimento). O valor máximo para este parâmetro irá ocorrer
em r = m/(m+n), onde m e n são as proporções de ATC e HPβCD no complexo, respectivamente. Isto quer dizer que, se a estequiometria é 1:1 (m, n = 1) o valor máximo para o parâmetro examinado será observado em r = 0,5. Neste método se observam as mudanças na intensidade de fluorescência (Io/I) por variação da
concentração de ATC e HPβCD.
4.2.5 Calorimetria diferencial de varredura (CDV)
O ensaio de CDV foi realizado utilizando um calorímetro DSC-Q100 (TA Instruments Waters, USA). Este processo determina a temperatura e fluxo de calor associado com a transição de materiais em função do tempo e da temperatura. As amostras (5 mg) foram colocadas em pequenos recipientes de alumínio crimpados em uma atmosfera inerte, e submetidas a um aumento gradual da temperatura (15 °C/min, entre 0 °C e 200 °C). A escala de temperatura foi calibrada tomando como referência ao elemento índio de elevado grau de pureza (>99,9%). As amostras que foram avaliadas por este processo são os compostos puros (ATC e HPβCD) e o complexo de inclusão (ATCHPβCD) em fracções molares equivalentes (de Lima et al., 2012).
4.2.6 Ressonância nuclear magnética (RNM)
Os espectros de 1H-RMN de uma e duas dimensões foram registrados a 20 °C
com um espectrômetro Varian Inova 500 MHz (11,75 T) no Laboratório Nacional de Luz Synchrotron (LNLS, em Campinas, Brasil). As amostras de concentrações equivalentes (10 mM) de ATC e HPβCD foram preparadas em D2O a pH 7,4 (ajustado
com soluções de NaOH e HCl), homogeneizadas durante 6 h e transferidos para tubos de 5 mm para aquisição de espectro. O pico da água residual (4,78 ppm) foi utilizado como referência interna (Matsui & Tokunaga, 1996).
Os experimentos de 1D-1H de espectroscopia nuclear de efeito Overhauser
(ROESY) foram realizados com pulsos seletivos de 180° e não seletivos de 90°, com um tempo de mistura de 300 ms. Os experimentos de 2D-ROESY foram realizados no modo de fase sensitivo (States et al., 1982), e a sequência de pulso foi também com um tempo de mistura de 300 ms.
Os experimentos de difusão (DOSY) foram conduzidos para ATC (5 mM), HPβCD (5 mM) e 1:1 (ATCHPβCD) a 25°C. A sequência utilizada foi o Dbppste. A
duração total do pulso de gradiente foi de 2 ms, o tempo de espera de difusão foi de 0,05 s e a força do gradiente mínimo foi 0,3 Gauss/cm (Braga et al., 2016; Laverde et
al., 2002). Para todas as experiências, foram coletados 30 espectros (64 transientes
cada) com pulsos gradientes com amplitudes variando de 0,68x10-3 até 3,4x10-3 T/cm,
em que foi observado aproximadamente 100% de decomposição na intensidade da ressonância encontrada na maior amplitude de gradiente.
4.2.8 Determinação da fração complexada
A fração complexada (f) da ATC em HPβCD foi determinada como descrito anteriormente segundo a equação seguinte (Braga et al., 2016):
𝑓 =𝐷𝐴𝑇𝐶 − 𝐷𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑥𝑜
𝐷𝐴𝑇𝐶 − 𝐷𝐻𝑃𝛽𝐶𝐷 (Equação 2)
Onde: DATC = Coeficiente de difusão de ATC livre; DComplexo = coeficiente de
difusão do complexo de inclusão ATCHPβCD; e DHPβCD = coeficiente de difusão de
HPβCD livre.
4.2.9 Determinação da constante de associação
A constante de associação (Ka) foi calculada a partir da última equação deduzida
da constante de equilíbrio para a estequiometria 1:1 ATC: HPβCD, como descrito anteriormente por Arantes et al (2009).
𝐾𝑎=
𝑓
(1−𝑓)([𝐻𝑃𝛽𝐶𝐷]−𝑓[𝐴𝑇𝐶] (Equação 3)
Onde f é a fração do complexo ATC, [ATC] = concentração ATC inicial (M); [HPβCD] = concentração inicial de HPβCD (M).
4.2.10 Análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A análise morfológica das amostras de ATC, HPβCD, misturas físicas de ATC/HPβCD e do ATCHPβCD (1:1) foram analisadas no MEV Jeol JSM – 5600LV
(Japão). As amostras foram montadas em stubs de alumínio, usando fita dupla face e cobertas com ouro sob vácuo por 120 s, para tornarem-se eletricamente condutivas, segundo a técnica adaptada de Araujo et al (2008).