4 MATERIAL E MÉTODOS 1 Material
4.6 Testes in vitro
4.6.1 Avaliação da citotoxicidade pelo método do MTT
O ensaio MTT baseia-se na conversão de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium brometo) em cristais de formazana por células vivas, o que determina a atividade mitocondrial (Mosman, 1983). Sendo que na maioria das populações de células a atividade mitocondrial total é relacionada com o número de células viáveis, este ensaio é largamente utilizado para medir a efeitos citotóxicos in
vitro de fármacos sobre linhagens de células primárias, imortalizadas ou de células
doentes.
Uma vez em confluência, as células SCC e HaCaT foram transferidas para placas de cultura celular de 96 poços na concentração de 5x104 células/mL (exceto as
SCC15, cuja concentração foi de 2x104 células/mL), em 200 μL do meio DMEM/F12
ou DMEM contendo SFB 10%. Após 24 h de incubação a 37°C e 5% de CO2, foram
colocados os tratamentos de ATC livre e complexada em HPβCD nas concentrações acima mencionadas por 24 h. Logo após esse tempo, os poços foram esgotados, lavados duas vezes com PBS 1X (pH=7,4), sendo então adicionados 200 µL da solução de MTT a 0,3 mg/mL em meio DMEM ou DMEM/F12. As placas foram incubadas por três horas em atmosfera de 5% de CO2 a 37°C. Posteriormente os
poços foram lavados duas vezes com PBS e preenchidos com 200 µL de etanol PA. Finalmente, as absorbâncias foram obtidas através de um microespectrofotômetro (ASYS UVM340, Biochrom Ltd, Cambridge, England) a 570 nm.
4.6.2 Análise da proliferação celular
Já em crescimento e confluência, tanto as células SCC quanto as HaCaT foram transferidas para placas de cultura de celular de 96 poços numa concentração de 5x104 células/mL (exceto as SCC15, cuja concentração foi de 2x104 células/mL), em
um volume de 100 µL de meio DMEM/F12 ou DMEM contendo 10% de FBS. Após 24 h de incubação a 37°C e 5% de CO2, foram adicionados os tratamentos de ATC livre
e complexada em HPβCD nas concentrações de 500 µg/mL, 1000 µg/mL e 2000 µg/mL (concentrações determinadas pelo ensaio anterior descrito no item 4.6.1). As células do grupo controle tempo zero (T0) foram fixadas com 10% de ácido
tricloroacético (TCA) a 4°C por uma hora, após quatro horas de serem colocadas nas placas de 96 poços com a finalidade de garantir a sua aderência inicial. As outras placas foram incubadas por 48 h a 37°C, sendo na sequencia fixadas com 10% TCA 4°C por uma hora, secadas completamente e coradas com 0,4% de SRB em 1% de ácido acético por 15 – 30 minutos. Em seguida, as placas foram lavadas quatro vezes com ácido acético 1% e secadas completamente batendo sobre papel toalha até eliminar vestígios do corante sobre o papel. O SRB ligado às células foi solubilizado com 10 mM de Tris (Trizma base, Sigma®) com pH ajustado para 10,5. Por fim, foi
realizada a leitura espectrofotométrica da absorbância a 540 nm. Como a SRB liga-se aos aminoácidos básicos das proteínas das células viáveis no momento da fixação, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao compartimento, menor a atividade citotóxica da amostra em teste (Skehan et al., 1990; Rubistein et al., 1990; Monks et
al., 1991).
As médias das absorbâncias foram calculadas descontando o valor de seus respectivos brancos e através das fórmulas a seguir. Foi determinada a inibição de crescimento (IC) de cada amostra testada da forma seguinte:
Se T > C a droga estimulou a proliferação, não apresentou IC. Se T ≥ T0 e < C, a droga foi citostática e a fórmula utilizada foi:
100 𝑥 [𝑇 − 𝑇0 𝐶 − 𝑇0
]
Se T < T0 a droga foi citocida e a formulação utilizada foi:
100 𝑥 [𝑇 − 𝑇0 𝑇0 ]
Sendo T a média da absorbância das células tratadas, C o controle de células e T0 o controle das células no dia da adição dos tratamentos, o resultado obtido foi
subtraído de 100%, obtendo-se então a porcentagem de proliferação. Os dados de absorbância foram analisados e compilados na elaboração de gráficos relacionando à porcentagem de inibição ou morte celular com concentração do tratamento. As amostras foram consideradas ativas quando apresentaram inibição de proliferação maior que 50% e ainda de forma concentração dependente, preferencialmente apresentando seletividade para os tipos celulares (Monks et al., 1991).
Foi utilizado como controle positivo a doxorrubicina em concentrações crescentes de 0,025 µg/mL; 0,25 µg/mL; 2,5 µg/mL e 25 µg/mL (Pascoal et al., 2014), desde que este medicamento é padrão nos ensaios de proliferação in vitro.
4.6.3 Análise da Apoptose por Citometria de Fluxo
Uma suspensão de 3 mL contendo 4x105 células/mL das células SCC e HaCaT
(exceto as SCC15, cuja concentração foi de 2x105 células/mL) foi colocada em placas
de 6 poços. Após 24 h de incubação a 37°C e 5% de CO2, os poços foram lavados e
esgotados sendo colocado depois meio de cultura carenciado (sem SFB) por 24 h. Posteriormente, foram adicionados os tratamentos de ATC livre e complexada em HPβCD nas concentrações de 0,5 mg/mL e 1 mg/mL (concentrações determinadas pelo ensaio anterior descrito no item 4.6.1).
Após os tratamentos, as células foram tratadas com 1 mL de tripsina por 3 minutos, em seguida colocadas em tubos de 15 mL contendo 5 mL de meio de cultura com 10% de FBS. As células do grupo controle foram divididas em dois tubos, um deles corresponde ao back (não marcado) e o outro o controle (marcado). Também foi realizado um controle positivo utilizando staurosporina.
As células foram centrifugadas e ressuspendidas em 100 μL de tampão de ligação. Em seguida, foram transferidos para tubos eppendorfs onde foram adicionados 1 μL de Anexina V-FITC e 0,5 μL de 7-AAD em cada amostra, com exceção do tubo back. Os tubos foram agitados em vórtex suavemente e incubados por 15 minutos, à temperatura ambiente e protegidos da luz. Finalmente, foi adicionado 400 μL de tampão de ligação contendo paraformaldeído 0,1% e analisados no citômetro de fluxo.
A apoptose foi determinada pela marcação da membrana com Anexina V-FITC (BD Pharmingen™), responsável por identificar células nos estágios iniciais da apoptose. A dupla marcação com 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD) serve para marcar as células necróticas. Estas avaliações foram realizadas utilizando um citometro de fluxo (BD FAC ScaliburTM, CA, USA) no laboratório de cultura de células do
Departamento de Diagnóstico Oral da FOP/UNICAMP.
4.6.4 Análise da citotoxicidade por microscopia de fluorescência
Tanto as células SCC e HaCaT foram cultivadas como descritas anteriormente e transferidas para as placas de cultura de células de 96 poços. As placas foram incubadas por 24 h e em seguida foram aplicados os tratamentos. Terminados os períodos de incubação a citotoxicidade das formulações foi verificada através da marcação pelos reagentes de viabilidade/citotoxicidade para células mamíferas Live/Dead® (Invitrogen Life Technologies, USA).
As células vivas convertem a calceína permeável (calceína-AM) não fluorescente em calceína impermeável fluorescente verde, ao qual se distribui uniformemente pelo citoplasma da célula, por meio da atividade de esterases. As células mortas ou com a membrana danificada são marcadas com o homodímero-1 de Etídio (EthD-1) pela ligação a ácidos nucléicos, emitindo uma fluorescência vermelha. Este marcador é excluído pelas membranas das células intactas.
Foi preparada uma solução contendo uma concentração final de 2 μM de calceína-AM e 4 μM de EthD-1 (Live/Dead®). Aproximadamente 300 μL dessa solução
foram adicionados às placas de cultura de células. As células foram incubadas por 30 a 45 minutos a temperatura ambiente, protegidas da luz.
Posteriormente, as imagens foram obtidas através do microscópio invertido Zeiss Axiovert 40 CFL acoplado a uma câmera AxioCam MEC (Carl Zeiss, Alemanha). A calceína foi visualizada utilizando filtro na faixa de comprimento de onda 450-490 nm (Ex)/ 515-565 (Em). Já as células marcadas em vermelho foram visualizadas na faixa de comprimento de onda de 528-546 nm (Ex)/ 590-617 nm (Em).
4.6.5 Quantificação de citocinas pro-inflamatórias
Uma vez atingida a confluência, tanto as células SCC quanto as HaCaT foram transferidas para placas de cultura de celular de 24 poços numa concentração de 5x105 células/mL (exceto as SCC15, cuja concentração foi de 2x105 células/mL), em
meio DMEM/F12 ou DMEM contendo 10% de FBS. Após 24 h de incubação a 37°C e 5% de CO2, as células foram lavadas duas vezes com PBS 1X pH 7,4. Logo depois,
foram tratadas com meio de cultura DMEM/F12 ou DMEM sem FBS por 24 h com o objetivo de estabilizar o ciclo celular. Posteriormente, foram adicionados os tratamentos de ATC livre e complexada em HPβCD nas concentrações de 0,5 mg/mL e 1 mg/mL (concentrações determinadas pelo ensaio anteriormente descrito no item 4.6.1). Os sobrenadantes das células tratadas e do controle foram coletados e armazenados a -80 °C para os analises posteriores.
Para a quantificação da liberação das citocinas IL-6 e IL-8 foi utilizado o imunoensaio de ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems, Inc., USA):
a. Cada um dos poços das placas de 96 poços foi coberto com 100 µL de anticorpos de captura respectivo para cada citocina. As placas foram seladas com um adesivo e colocadas à temperatura ambiente, overnigth. b. Depois as placas foram lavadas com 400 μL de tampão de lavagem (Tween
20 0,05% diluído em PBS 1X pH 7,4) três vezes, utilizando uma máquina de lavagem automática (Biochrom Asys Atlantis, UK). Logo depois, a remoção completa do líquido foi completada invertendo as placas e batendo contra papel toalha limpo. Este último processo foi repetido antes de cada etapa. c. Logo após, foram adicionados 300 µL de tampão de bloqueio (BSA 1% em
PBS 1X pH 7,4) em cada poço. As placas foram incubadas por 1 h, e posteriormente lavadas e secadas como indicado no item b.
d. Foi adicionado 100 μL das amostras e os padrões (diluído em tampão de bloqueio). As placas foram cobertas com um adesivo e incubadas por 2 h à temperatura ambiente e posteriormente lavadas e secadas (item b).
e. Foi adicionado 100 μL do anticorpo de detecção (diluído em tampão de bloqueio) especifico para cada citocina. As placas foram cobertas com um adesivo e incubadas por 2 h à temperatura ambiente e depois lavadas e secadas (item b).
f. Posteriormente, foi adicionado 100 μL da diluição de Streptavidin-HRP a cada poço por 20 minutos, protegido da luz. Logo, as placas foram lavadas e secadas (item b).
g. Neste ponto foi adicionado 100 μL da solução substrato [mistura 1:1 do reagente de cor A (H2O2) e reagente de cor B (Tetrametilbenzidina)] em
cada poço por 20 minutos, protegido da luz.
h. Por fim, e sem lavar as placas, foi adicionado 50 μL da solução stop (H2SO4
2N). A reação colorimétrica de cada poço foi determinada antes dos 30 minutos, usando um leitor de microplacas ajustado para 450 nm com a correção do comprimento de onda ajustada para 540 nm e 570 nm.
A concentração das citocinas IL-6 e IL-8 foi estabelecida através de uma correlação entre os dados das absorbâncias e a curva de calibração determinada pelo fabricante.
4.6.6 Quantificação da PGE2
Para este ensaio foram utilizadas as amostras congeladas (como previamente descritas no item 4.6.5) dos sobrenadantes das diferentes amostras dos grupos testados. Para a quantificação das PGE2 foi realizado utilizando uma reação de
imunoabsorbância ligado à enzima (R&D Systems Inc., USA). O teste realizado seguindo o protocolo do fabricante, onde as amostras foram diluídas 3 vezes antes de serem aplicadas nas placas de 96 poços. As leituras das absorbâncias que determina a quantidade de PGE2 foram realizadas num leitor de microplaca com comprimento