Quantificação de PGE 2 e citocinas pró-inflamatórias

O complexo de inclusão ATCHPβCD 0,5 e 1 mg/mL diminuiu significativamente a

liberação de PGE2 nas células HaCaT. Foi observado também uma diminuição

significativa da liberação de IL-8 tanto com os tratamentos de ATC livre e do complexo de inclusão ATCHPβCD quando comparado com o controle positivo (Figura 20). No

entanto, foi revelado um aumento significativo na liberação de IL-6. Não houve diferencia significativa na liberação de PGE2 e IL-8 entre o controle negativo (meio de

Figura 20. Liberação de PGE2 e citocinas pró-inflamatorias (IL-6 e IL-8) nas células

HaCaT. Os gráficos destacam as diferenças significativas (* p<0,05; one-way ANOVA e teste de Tukey) entre os grupos controle positivo (LPS 1 μg/mL) e os

tratamentos com ATC e ATCHPβCD 0,5 e 1 mg/mL (n = 6; media ± DP).

Tanto a ATC livre quanto o complexo de inclusão ATCHPβCD nas concentrações de 0,5 e 1 mg/mL diminuíram significativamente a liberação de PGE2, IL-6 e IL-8 nas

células SCC9 quando comparado com o controle positivo (Figura 21). Não houve diferencia significativa na liberação de PGE2, IL-6 e IL-8 entre o controle negativo

(meio de cultura) e a HPβCD.

Tanto a ATC livre e o complexo de inclusão ATCHPβCD 0,5 e 1 mg/mL diminuíram

significativamente a liberação de PGE2 nas células SCC15. No entanto, apenas as

concentrações de 1 mg/mL de ATC livre e complexada diminuíram de forma significativa a liberação de IL-6. A liberação de IL-8 não foi afetada por nenhum dos tratamentos (Figura 22). Não houve diferença significativa na liberação de PGE2 e IL-

8 entre o controle negativo (meio de cultura) e a HPβCD.

Tanto a ATC livre quanto o complexo de inclusão ATCHPβCD nas concentrações

de 0,5 e 1 mg/mL diminuiram significativamente a liberação de PGE2 nas células

SCC25 quando comparado com o controle positivo. A liberação de IL-8 não foi afetada por nenhum dos tratamentos (Figura 23). Não houve diferença significante na liberação de PGE2 e IL-8 entre o controle negativo (meio de cultura) e a HPβCD.

Figura 21. Liberação de PGE2 e citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e IL-8) nas células

SCC9. Os gráficos destacam as diferenças significativas (* p<0,05; one-way ANOVA e teste de Tukey) entre os grupos controle positivo (LPS 1 μg/mL) e os tratamentos

com ATC e ATCHPβCD 0,5 e 1 mg/mL (n = 6; media ± DP).

Figura 22. Liberação de PGE2 e citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e IL-8) nas células

SCC15. Os gráficos destacam as diferenças significativas (* p<0,05; one-way ANOVA e teste de Tukey) entre os grupos controle negativo (LPS 1 μg/mL) e os

Figura 23. Liberação de PGE2 e das citocinas IL-6 e IL-8 nas células SCC25. Os

gráficos destacam as diferenças significativas (* p<0,05; one-way ANOVA e teste de comparação múltipla de Tukey) entre os grupos controle negativo (LPS 1 μg/mL) e

6 DISCUSSÃO

O carcinoma de células escamosas na língua é a neoplasia maligna mais comum e letal que acomete a cavidade oral. Apesar dos avanços terapêuticos, o prognóstico dos pacientes com essa doença continua a ser desfavorável. O diagnóstico em estágios avançados e os efeitos adversos associados à quimio e radioterapia contribuem a diminuir as chances de sobrevivência, apesar das estratégias terapêuticas.

Na procura de novos agentes adjuvantes no arsenal terapêutico para o tratamento do câncer, alguns anestésicos locais têm sido relacionados com efeitos citotóxicos e anti-inflamatórios sobre diferentes tipos celulares. Durante os últimos anos, têm sido relatados grandes avanços na formulação de novos complexos de inclusão usando HPβCD e anestésicos locais com o objetivo de melhorar o perfil farmacocinético desses medicamentos, especialmente na solubilidade (Araújo et al., 2008; Moraes et al., 2007a; Moraes et al., 2007b; Vermet et al., 2014; Serpe et al., 2014; Cereda et al., 2012; Franco de Lima et al., 2012; Kopecký et al., 2004; Fréville

et al., 1996; Prado et al., 2017). Neste processo de caracterização de novos

complexos tem sido sugerido o uso de diversos ensaios para poder identificar os mecanismos de complexação, como avaliar as alterações dos espectros de absorção por UV e fluorimetria (Misiuk & Zalewska, 2011). No presente estudo, foi observada uma redução da fluorescência da ATC na presença de HPβCD (Figura 5) e que foi muito semelhante em todos os índices molares avaliados, refletindo uma alteração da polaridade do ambiente ou pela colisão do fluoróforo com o complexo de inclusão. Em ambos os casos, isto poderia indicar uma interação molecular entre essas duas substâncias. De forma similar, esta alteração na fluorescência também foi observada com a tetracaína (Moraes et al., 2007a), a oxethazaína (Prado et al., 2017) e outras moléculas hóspedes (Braga et al., 2016) quando complexadas com HPβCD.

De acordo com a análise do job plot (Figura 7), o ponto máximo de interação entre as moléculas de ATC e HPβCD ocorreu quando as concentrações molares de ambas substâncias foram iguais (1 µM cada), pelo que o valor de r foi de 0,5 (Equação 1), o que confirma uma estequiometria de complexação de 1:1 (Connors, 1997). Apesar de que estequiometrias diferentes são possíveis, normalmente uma molécula do agente ativo se associa com uma molécula de ciclodextrina para formar complexos

reversíveis (Bruschi, 2015), como demostrado neste estudo e de forma similar com os resultados obtidos com outros AL como a ropivacaína (Araújo et al., 2008), a tetracaína (Franco de Lima et al., 2012) e a oxethazaína (Prado et al., 2017) quando complexados com HPβCD.

A espectroscopia por RNM é uma das técnicas mais informativas para o estudo de complexos de CDs com vários compostos que fornece evidência direta dos complexos de inclusão. A razão é que a presença da molécula hóspede quando inserida na cavidade interna das CDs, produz alterações no ambiente químico dos hidrogênios internos (H3 e H5), mas não nos hidrogênios externos (H1, H2 e H4). Além

disso, a interação da molécula hóspede com a cavidade do CD pode causar variação na mudança química dos hidrogênios da molécula incorporada na cavidade (Xiliang

et al., 2003; Bratu et al., 2005). Assim, os dados de RNM levaram à determinação da

constante de associação entre a ATC e a HPβCD (Ka = 117,8 M-1_{), o que indica uma}

afinidade estável entre esses compostos. De fato, foi demonstrado que a constante de associação dos complexos fármaco-ciclodextrina deve ser superior a 105 M-1 _para

ter algum efeito sobre a farmacocinética ativa após a administração parenteral (Stella & He, 2008). No presente estudo, a constante de associação determinada para o complexo de inclusão ATCHPβCD foi ainda maior do que outros AL de tipo amida

quando complexados em HPβCD, como S-bupivacaína (Ka = 91 M-1_{) (de Paula et al.,}

2010); S-ropivacaína (Ka = 55 M- 1_{) (Fraceto et al., 2007), e prilocaína (Ka = 41 M}-1₎

(Cabeça et al., 2011) determinadas por este mesmo método. De forma similar, na pesquisa desenvolvida por Prado et al. (2017) mostraram um Ka = 198 M-1 _{entre a}

oxethazaína e HPβCD o que determinou uma afinidade forte e estável entre essas substâncias. Como o Ka está diretamente relacionado à lipofilicidade do fármaco, esperava-se uma alta associação entre a ATC e a HPβCD.

A calorimetria diferencial de varredura é uma técnica térmica comumente utilizada na pesquisa de interações de estado sólido entre medicamentos e CDs (Giordano et al., 2001; Mura et al., 2003). A comparação das curvas térmicas de compostos isolados, sua mistura física e do complexo de inclusão aparente fornecem informações sobre as interações entre os componentes como uma consequência do processo utilizado para a preparação do complexo (Mura, 2015). Como observado com o complexo de inclusão entre ropivacaína-HPβCD (Araújo et al., 2008) e

lidocaína-HPβCD (Moraes et al., 2007a), no presente estudo observou-se a perda do pico da temperatura de fusão da ATC quando complexada com HPβCD na curva DSC (Figura 8). O aumento da temperatura de decomposição observada no complexo é um sinal claro do aumento da estabilidade térmica do fármaco devido à inclusão da ATC dentro da cavidade da HPβCD (Yilmaz et al., 1995; Novak et al., 1998; Meier et

al., 2001).

O método in vitro mais amplamente utilizado para avaliar a liberação de um fármaco é através de uma célula de difusão vertical, usando uma membrana permeável de celulose pela qual a liberação de um medicamento é avaliada ao longo do tempo(Shen & Burgess, 2012). A ATC livre mostrou uma taxa de liberação acima de 80% como recomendado anteriormente (Prado et al., 2017) após 4 h. No entanto, as amostras de ATCHPβCD mostraram um perfil de liberação in vitro menor, porém

semelhante à ATC livre. Este fenômeno poderia ser explicado pela alta fração complexada de ATC em HPβCD (41,41%) e a afinidade forte e estável deste complexo de inclusão (Ka = 117,8M-1_{). Curiosamente, o complexo de inclusão ATCHPβCD}

submetido a condições de desafio por 6 meses, mostrou uma curva de liberação semelhante ao complexo original (0 meses) indicando uma boa estabilidade do composto. Estes resultados sugerem o complexo como um sistema estável podendo modificar a permeação do fármaco através da membrana celular e aumentar a biodisponibilidade da molécula original.

Os dados da microscopia eletrônica de varredura (Figura 13) proporcionaram evidências de inserção ATC dentro da cavidade hidrofóbica da ciclodextrina, uma vez que ambos demonstram a perda do padrão cristalino ATC no complexo, mas não na mistura física simples de ATC e HPβCD. Resultados semelhantes foram relatados para a ropivacaína (Araújo et al., 2008) e oxethazaína (Prado et al., 2017) no complexo de inclusão com HPβCD.

Além dos estudos clínicos tradicionais e dos estudos descritivos, os estudos experimentais relacionados ao câncer oral podem ser realizados a partir de linhagens celulares originalmente isoladas de pacientes com carcinoma escamoso e também de modelos animais de carcinogênese química induzida e em animais transgênicos. Algumas das linhas celulares mais utilizadas para o estudo experimental do CCE são as SCCs 4, 9, 15 e 25 e os queratinócitos HaCaT que são utilizados como controle

nos ensaios in vitro, o que representa um modelo adequado para esses propósitos (Rivera, 2015).

Assim, o efeito citotóxico da ATC pelo ensaio MTT, com base na atividade mitocondrial enzimática (Mosmann, 1983), foi variável entre as linhas celulares SCC testadas, conforme expressado pelo IC50 de cada uma delas. Isto pode ser devido a

que essas linhas celulares possuem uma origem diferente. Por exemplo, a SCC9 originou-se em um paciente que desenvolveu esta linhagem e que não recebeu tratamento antes da biópsia ser realizada. A SCC9 comparada com a SCC25, mostra uma maior resistência à cisplatina. Da mesma forma, a SCC25 comparada com a SCC15, possui um maior potencial invasivo (Rheinwald & Beckett, 1981; Rivera, 2015). No entanto, as mesmas linhagens celulares quando tratadas com a mesma concentração de ATC, porém no complexo com HPβCD, mostraram um menor IC50

evidenciando um maior efeito citotóxico da ATC quando complexada. Este efeito poderia ser explicado pelo fato do aumento da solubilidade da ATC quando complexada, já que sabe-se que os complexos de inclusão modificam a cinética das moléculas hóspedes (Stella & He, 2008).

Tem sido reportado na literatura que os AL induzem apoptose dependente da concentração e, portanto, citotoxicidade (Werdehausen et al., 2012; Perez-Castro et

al., 2009). Em um estudo foi analizado o efeito citotóxico sobre células Jurkat (células

tumorais de linfoma T) tratadas com diferentes AL por 24 h (Werdehausen et al., 2012). Nesse estudo, a concentração de ATC que induziu 50% de morte celular (LC50)

foi de 5,3 mM (1,7 mg/mL), sendo um valor inferior aos achados no presente estudo para células SCC, porém semelhante ao IC50 das células HaCaT. Isto sugere que a

sensibilidade das células cancerígenas aos AL dependería também da origem celular. No presente estudo foi demostrado que tanto a ATC livre quanto a ATCHPβCD

induziram apoptose tardia e necrose, de forma similar a outros estudos (Werdehausen

et al., 2012; Perez-Castro et al., 2009). É importante destacar que a morte celular

induzida em células HaCaT foi principalmente por apoptose tardia, em quanto a morte induzida nas células SCC15 e SCC25 foi por apoptose tardia e necrose, sendo em ambos os casos dose-dependente (Figura 18). A indução da apoptose pela ATC e/o complexo de inclusão ATCHPβCD poderia constituir uma ferramenta terapêutica

medicamento poderia induzir a morte de possíveis células cancerígenas remanecescentes sem promover um efeito inflamatório, aliás de um baixo risco de toxicidade sistêmica devido a sua rápida biotransformação no plasma sanguíneo (Snoeck, 2012; Mojumdar & Lyubartsev, 2010; Vree & Gielen, 2005). Observou-se também uma alteração na arquitetura da membrana das células HaCaT e SCC25, o que poderia determinar a sua maior sensibilidade à apoptose tardia induzida pelo complexo ATCHPβCD (Figura 19). No entanto, o estudo realizado por Kobayashi et al., (2012) demonstraram que a dibucaína induziu a ativação da caspase-3 em células HL-60 (células de leucemia promielocítica humana), mas não em células de carcinoma escamoso oral (HSC-2, HSC-3, HSC-4, NA, Ca9-22), sugerindo a existência de outros mecanismos citotóxicos dos AL.

Existe evidência emergente de que os AL locais aplicados no perioperatório são capazes de prevenir a proliferação de tumores durante a cirurgia do câncer (Gottschalk et al., 2010). Como mencionado anteriormente, o tratamento cirúrgico representa o padrão ouro no manejo do CCE. No entanto, a resposta ao estresse cirúrgico pode proporcionar condições ideais para a persistência da doença maligna mínima residual após a cirurgia. A cirurgia tem sido sugerida para acelerar o desenvolvimento de micrometástases preexistentes e para promover o estabelecimento de novas metástases (Ben-Eliyahu, 2003; Melamed et al., 2005). Acredita-se que o pós-operatório seja o período mais vulnerável para metástases potenciais após a cirurgia. Esta vulnerabilidade é principalmente atribuída à supressão da imunidade mediada por células, o mecanismo de defesa de primeira linha contra o câncer (Ben-Eliyahu, 2003). A depressão do sistema imunológico ocorre às primeiras horas da cirurgia, dura vários dias e é proporcional à extensão do trauma cirúrgico (Page, 2005). Por exemplo, os pacientes com baixos níveis de atividade das células natural killer (NK) submetidos à cirurgia primária de câncer demonstraram ter uma maior taxa de morbidade e mortalidade relacionadas ao câncer. Esta associação foi demonstrada em pacientes com câncer colorretal (Tartter et al., 1987; Koda et al., 1997), gástrico (Takeuchi et al., 2001), pulmões (Fujisawa et al., 1997) bem como câncer de cabeça e pescoço (Brittenden et al., 1996; Schantz et al., 1989).

Neste ponto, a anestesia regional, incluindo a anestesia espinal e peridural, reduz a resposta ao estresse causada pela cirurgia, que se acredita ser um mediador

da imunossupressão pós-operatória (Liu et al., 2004; Tonnesen & Wahlgreenet, 1988). A anestesia regional atenua a resposta ao estresse cirúrgico bloqueando a transmissão neural aferente. Isso evita que a entrada aferente nociva atinja o sistema nervoso central. A adição de anestesia regional à anestesia geral também resulta em menor uso geral de opióides e anestésicos voláteis. Esta associação pode ser benéfica para pacientes submetidos a cirurgia de câncer, pois teoricamente resultará em menor imunossupressão. Em uma análise retrospectiva de pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer de mama, Exadaktylos et al., (2006) demonstraram que o uso do bloqueio do nervo paravertebral em associação com anestesia geral foi associado a um intervalo mais longo sem câncer e menor incidência de recorrência. Resultados semelhantes foram mostrados em outros estudos retrospectivos do uso de anestesia local peridural em câncer de próstata e cirurgia de câncer de cólon (Biki

et al., 2008; Christopherson et al., 2008).

Na presente pesquisa foi demonstrado que a ATC em doses de 0,5 a 2mg/mL não produz um efeito antiproliferativo significativo, porém quando complexado em HPβCD o efeito antiproliferativo aumenta significativamente (Figura 16) pelo que, além do efeito anestésico local da ATC livre, o complexo diminuiria o espalhamento celular no pós-operatório em uma situação clínica. Como mencionado anteriormente, este efeito poderia ser explicado pelo fato do aumento da solubilidade da ATC, o que produz um incremento da sua biodisponibilidade quando complexada (Stella & He, 2008). No entanto, Lucchinetti et al., (2012) demonstraram que a lidocaína, ropivacaina e bupivacaina de doses maiores a 100 μM reduziram a proliferação de células mesenquimais, diminuíram a cicatrização de feridas in vitro e a respiração mitocondrial e as concentrações de ATP foram reduzidas. Isto poderia ter um impacto negativo na regeneração tecidual pós-operatória.

Para uma abordagem eficaz do câncer, ele deve ser considerado como uma doença que envolve interações complexas entre uma comunidade de células heterotípicas, caracterizada pelo tecido canceroso original, o tecido recém-formado e células que o cercam. O microambiente tumoral do CCE inclui fibroblastos associados ao câncer, células imunes e outras células de suporte (Rivera & Venegas, 2014).

Nesse microambiente tumoral encontra-se uma maquinaria de cascatas malignas altamente sofisticadas, onde vários produtos do sistema inflamatório, como

citocinas, quimiocinas, prostaglandinas (PGs) e ciclooxigenase (COX), promovem a progressão do câncer através da imunossupressão, resistência à apoptose e promoção de angiogênese (Kundu & Surh, 2008). Isso acontece na inflamação crônica para certas formas de câncer, mas não está claro se a inflamação aguda, como ocorre no período perioperatório, resulta nos mesmos efeitos. No entanto, Goldfarb & Ben- Eliyahu, (2006) sugeriram que um aumento no nível de citocinas (interleucinas, IL-6 e IL-8) e PGE2 em combinação com uma diminuição da produção de citocinas induzidas

por células T helper tipo 1(IL-2, interferão ), poderia explicar a supressão profunda da atividade citotóxica NK no período perioperatório.

Como mencionado anteriormente, os efeitos anti-inflamatórios dos AL ocorrem em intervalos de concentrações que não afetam a viabilidade celular. Apesar dos avanços, o mecanismo anti-inflamatório desses fármacos não está totalmente elucidado. Os efeitos inibitórios da lidocaína contra várias citocinas e quimiocinas sugerem um efeito sobre uma via celular comum (Henkel et al., 1993; Brown et al., 1995). Uma das principais vias de transdução de sinalização é através do fator nuclear κB (NF-κ B), correspondente a um fator de transcrição onipresente que usa genes direcionados para induzir a produção de proteínas que são capazes de responder contra o estresse, dano do DNA e tumorigênese do crescimento (Srivastava & Ramana, 2009). Assim, NF-κB regula os principais processos de inflamação, apoptose, resposta ao estresse, cicatrização de feridas, angiogênese e angiogênese linfática.

O microambiente tumoral é fundamental para o processo de metástase no CCE. Vários estudos têm relacionado o aumento das citocinas IL-6, IL-8, TNF- e da PGE2 nesse microambiente como mediadores químicos importantes nesse processo.

No presente estudo, tanto a ATC livre quanto a ATCHPβCD reduziram significativamente a liberação de IL-6 das células SCCs. A IL-6 é produzida por uma grande variedade de tipos celulares, incluindo células imunes (macrófagos, células dendríticas e células B), células endoteliais e células tumorais. Níveis marcadamente elevados de IL-6 nas amostras de sangue de pacientes com câncer, incluindo o câncer de cabeça e pescoso, preveem recorrência tumoral, sobrevivência fraca e metástase tumoral. Além disso, a IL-6 é um potente indutor de transição epitelial-mesenquimal nas linhas celulares de câncer de cabeça e pescoço, caracterizada pela perda de

junções intercelulares e polaridade celular, resultando na aquisição de propriedades migratórias e invasivas a nodos linfáticos e pulmões (Choudhary et al., 2016). O controle ou a diminuição na produção/liberação da IL-6 poderia representar um alvo de interés no CCE, considerando a correlação direta entre os níveis elevados de IL-6 e a invasão celular (metástase). Esse conceito é ainda mais fortalecido pela redução dos níveis de IL-6 após o tratamento em pacientes com câncer de cabeça e pescoso (Allen et al., 2007).

Uma redução significativa na liberação de IL-8 foi observada no grupo de células SCC9, SCC25 e HaCaT quando tratadas com ATC e o complexo de inclusão

ATCHPβCD. Esta redução na liberação de IL-8 poderia constituir um outro alvo no

tratamento pós-cirurgico do CCE, devido a que o aumento de esta citocina contribui na invasão do carcinoma através da regulação da expressão da MMP-7 (metaloproteinase 7) que degrada o colágeno da lámina basal (Watanabe et al., 2002). Recentemente, Jayatilaka et al. (2017)demonstraram que a IL-6 e IL-8 em conjunto induziram a migração celular melhorada numa pesquisa realizada com células HT1080 (células de fibrosarcoma) em uma matriz 3D. O interessante deste estudo foi que individualmente tanto a IL-6 quanto a IL-8 não tiveram efeito sobre a migração celular, mesmo em altas concentrações. Em contraste, quando combinados na proporção estequiométrica de 5:2, induziram as células com baixa densidade a se moverem à alta velocidade, a qual é observada em células de alta densidade. Surpreendentemente, outras proporções estequiométricas de IL-6 e IL-8 não induziram um aumento da migração celular.

Tanto a ATC livre quanto a ATCHPβCD reduziram significativamente a liberação de PGE2 em todas as linhagens celulares SCC e as HaCaT. Apesar de que a produção

de PGE2 pelas células do CCE são dependentes da COX-2 (Minter et al., 2003), o

efeito anti-inflamatório da ATC ou do complexo ATCHPβCD é desconhecido. O bloqueio

da liberação de PGE2 nas células de câncer oral poderia ser utilizado como alvo no

tratamento adjuvante, o que reduziria a vasodilatação, a angiogênese e a consequente proliferação celular.

No inicio até estágios intermediários da historia natural do CCE existe um número limitado de queratinócitos com evidente alteração genética. Neste ponto, o diagnóstico e o tratamento precoce são muito importantes para melhorar a

sobrevivência dos pacientes (Mehrotra & Gupta, 2011). Assim, em um cenário clínico, o tratamento tópico coadjuvante com o complexo de inclusão ATCHPβCD poderia

contribuir a limitar a proliferação de células cancerígenas através do efeito citotóxico e anti-inflamatório no microambiente tumoral, apesar da citotoxicidade observada nas