CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS POLIMÉRICOS

5.2.1 Curva padrão da triancinolona

Foi preparada uma solução estoque de triancinolona em álcool puro ( etanol P.A., dinâmica) , na concentração de 200 µg/mL. Soluções de concentrações equivalentes a 4, 8, 12, 16 e 20 µg/mL foram preparadas a partir da solução estoque em triplicata. A leitura das amostras foram realizadas em 242 nm. A curva padrão foi obtida a partir dos valores das áreas dos picos em função de sua concentração nas soluções correspondentes. Os parâmetros estatísticos média, desvio padrão (D.P), desvio padrão relativo (D.P.R%) e coeficiente de correlação (R2_{) foram avaliados de acordo com recomendações da} RE nº 899 de 29 de maio de 2003 para validação de metodologias analíticas.

5.2.2 Eficiência de encapsulação

Inicialmente os sistemas particulados poliméricos contendo a molécula terapêutica foram submetidos a uma etapa de centrifugação para a separação da fração encapsulada da não-encapsulada.

Sistemas particulados de Quitosana e Goma Guar

Agitação 12 horas Solução de Quitosana

Mistura polimérica

Solução de Goma Guar

Triancinolona Agitação 30 minutos

Sulfato de sódio Agitação 30 minutos

pela medida do conteúdo da molécula terapêutica nos sistemas particulados usando técnica analítica de espectrofotometria no UV-Vis através da análise univariada com a preparação de curvas de calibração. Quando não for possível a medida direta do conteúdo do fármaco nos sistemas particulados, a taxa de encapsulação será determinada pela diferença entre a quantidade de molécula ativa adicionada no início do processo e a quantidade de molécula ativa medida no sobrenadante (SANTOS-MAGALHÃES, 2000). Os sistemas particulados poliméricos (não contendo as moléculas terapêuticas) foram submetidos ao mesmo método analítico para demonstrar a ausência de interferência dos constituintes da formulação.

Triancinolona

A eficiência de encapsulação da triancinolona nos sistemas particulados de quitosana foi determinada pelo método de extração do fármaco usando espectrofotometria UV-Vis para a sua quantificação. Sistemas particulados foram dispersos em 50 mL de uma mistura de etanol:água (1:5), ultrasonicadas por 15 min, e submetidos a agitação magnética (3 h). A amostra foi centrifugada (3.000 rpm por 15 min) e a concentração de triancinolona determinada em 242 nm no sobrenadante, usando curva de padrão do fármaco na faixa de concentração de 4 a 28 µg/mL. A eficiência de encapsulação (EE) foi calculada através da Equação 2.

EE= Massa da triancinolona nos sistemas particulados x 100 (Eq. 2) Massa inicial teórica da triancinolona

A partir dos experimentos realizados, tais como: infravermelho, análise térmica, cinética e intumescimento foram realizadas as caracterizações quanto a eficiência de encapsulação das amostras nas diferentes razões poliméricas percentuais (25:75, 50:50 e 75:25 p/p).

5.2.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho

Espectros de absorção na região do infravermelho (4000 a 500 cm-1) das matérias-primas triancinolona, quitosana e goma guar, e dos sistemas particulados poliméricos preparados por spray- dryer com fármaco nas diferentes razões de CHI-GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p) na razão fármaco- polímero 1:10 (p/p), foram obtidos usando espectrofotometro Jasco FT-IR 4100 (JascoLecco, Itália). Amostras na razão 50:50 (p/p) sem fármaco obtidas nas mesmas condições dos sistemas (placebo obtido por spray dryer, PSD) e pela simples mistura física dos componentes puros (placebo por mistura física, PPM) também foram analisados. As pastilhas de brometo de potássio (KBr) foram preparadas a partir da mistura de 2 mg de amostra e 300 mg de KBr (previamente triturado e dessecado em estufa a 115ºC até peso constante).

5.2.4 Análise térmica (DSC e TG)

Os termogramas de calorimetria exploratória diferencial (DSC) das matérias-primas triancinolona, quitosana e goma guar, dos sistemas particulados poliméricos contendo triancinolona na razão fármaco-polímero 1:10 (p/p) e nas diferentes razões CHI-GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p) foram obtidos no DSC-60 A (Shimadzu, Brasil). Placebos preparados por mistura física nas mesmas razões poliméricas e, por spray dryer na razão 50:50 (p/p) também foram analisados.

Amostras (3 mg) foram inseridas em cadinhos de alumínio e, em seguida hermeticamente selados com tampas de alumínio. As análises térmicas foram realizadas de 25 a 250 ºC com atmosfera de nitrogênio (100 mL/min) e uma razão de aquecimento de 10 °C/min.

As medidas termogravimétricas (TG) foram realizadas com TGA-60-AH (Shimadzu, Brasil). As amostras (6 mg) foram pesadas com precisão em cadinhos de platina, aquecidas de 25 a 900 °C a uma taxa de aquecimento de 10 °C/min, sob uma taxa de fluxo de azoto de 50 mL/min.

5.2.5 Cinética de liberação in vitro

A avaliação da cinética de liberação in vitro foi efetuada simulando condições fisiológicas a 37±1° C e garantindo condições sink. A técnica de diálise foi feita para os sistemas particulados com triancinolona em um agitador (Marconi, MA093/1, Brasil) a 75 rpm. Tanto nos estudos de cinética e intumescimento foram utilizados apenas os sistemas particulados nas diferentes razões poliméricas 25:75, 50:50 e 75:25 p/p, utilizando a triancinolona na razão p/p fármaco:polímero 1:10, já que apresentaram resultados satisfatórios de encapsulação (EE e loading).

Como mostra o esquema da figura 9, foi pesada uma massa de 31 mg do sistema particulado, em seguida foi disperso em 2 gotas do tween 20 (0,5%) e 1 mL de água destilada sob agitação magnética e transferida para uma membrana de diálise de 25 mm (Sigma-aldrich, São Paulo), que foi devidamente selada, e colocada em 100 mL de tampão fosfato pH 6,8.

A liberação foi determinada a partir da coleta de 1 mL do meio durante 4 dias de acordo com os seguintes intervalos: 1º dia (T15min, T30min, T1h, T2h, T3h, T4h, T5h, T6h, T8h, T9h), 2º dia (T24h, T26h, T28h, T30h, T32h), 3º dia (T48h, 50h, 52h, 54h, 56h) e 4º dia (72h). A cada coleta, o volume do meio foi reconstituído pelo mesmo volume de solução estoque de tampão fosfato. As concentrações de fármaco nas alíquotas foram determinadas usando curva padrão (4 a 20 μg/mL) de triancinolona em espectrofotômetro usando curva padrão. A porcentagem de liberação foi calculada e o perfil de liberação do sistema particulado polimérico determinado (SANTOS-MAGALHÃES, 2000).

Os dados experimentais da cinética de liberação in vitro foram avaliados em relação a modelos matemáticos teóricos de liberação por regressão não-linear para determinar o mecanismo de liberação e calcular parâmetros de velocidade (MORAIS et al. 2008). Dentre os modelos teóricos foi utilizado o uni-exponencial baseado na lei de Fick pela equação:

𝑀 𝑡 ⁄ 𝑀 ∞ = (1 – b𝑒− 𝑘

𝑡 )

Onde Mt e M∞ são as quantidades de fármaco liberado em um tempo t determinado e o total de fármaco liberado a partir do sistema, respectivamente; e a constante de velocidade k está associada ao coeficiente de difusão do fármaco na matriz polimérica (Klose et al., 2008).

O modelo de Korsmeyer-Peppas também foi aplicado o qual deriva uma relação simples da liberação de fármaco a partir de uma equação do sistema polimérico.

Mt / M∞ = Ktn

Em que Mt / M∞ é uma fração de fármaco liberado no tempo t, k é a constante de velocidade de liberação e n é o expoente de liberação. O valor n é usado para caracterizar diferentes liberações para matrizes de forma cilíndrica. Neste modelo, o valor de n caracteriza o mecanismo de liberação do fármaco. Onde 0,45 ≤ n corresponde a um mecanismo de difusão de Fick. Para estudar a cinética de liberação, os dados obtidos a partir dos estudos de liberação de fármacos in vitro foram representados graficamente como percentagem cumulativa de liberação de fármaco em relação ao tempo de registro.

Figura 9 – Esquema do estudo de cinética de liberação in vitro da triancinolona a partir dos sistemas particulados de quitosana.

Fonte: Dados da pesquisa.

5.2.6 Intumescimento

A capacidade de intumescimento dos sistemas particulados (SP), do placebo seco por spray drying (PSS) e do placebo feito por mistura física (PMF) foram avaliadas pela capacidade de entrada de água por osmose em uma quantidade de amostra (0,093 g) inserida dentro de uma membrana de diálise (cut- off = 14,000). O placebo feito através da mistura física utilizou apenas a homogeneização dos polímeros em gral e pistilo, sem o fármaco.

No ensaio especificado a membrana de 25 mm (Sigma-aldrich, São Paulo) contendo as partículas foi submersa dentro de uma proveta contendo 20 mL de meio. O meio escolhido foi tampão fosfato pH

dias (T24h) e 3 dias (T48h), o sistema foi retirado e pesado em balança analítica (Radwag, modelo AS 220/C/2, Brasil) após secagem em papel absorvente. As medidas foram realizadas em triplicata e representadas em porcentagem relativa em relação ao peso do sistema no tempo inicial (sem intumescimento) e expressas como média ± desvio padrão.

5.2.7 Estudo in vivo

O estudo in vivo foi feito em colaboração com um outro grupo de pesquisa, do departamento de morfologia da UFRN, o qual avaliou a atividade dos sistemas particulados com triancinolona (SP) na razão polímero/polímero 50:50 com triancinolona 1:10 utilizando um modelo experimental de inflamação aguda, a colite ulcerativa. O experimento teve duração de oito dias e possibilitou a observação in vivo de parâmetros relacionados à atividade farmacológica dos tratamentos correlacionando-os com a farmacocinética e efeitos adversos. Neste estudo, foram utilizados 42 ratos machos Wistar divididos em seis grupos: Controle Negativo, Colite (Controle Positivo), Sufassalazina (SSZ) 500mg, Triancinolona 15mg (TRI), Sistema particulado 15mg (SP) e Placebo mistura física (PMF). Para indução da colite aguda foi utilizado o método proposto por MacPherson e Pfeiffer (1978), e modificado por Millar et al (1996).

A análise estatística foi realizada com o auxílio do Software BioEstat versão 5.3, que permitiu analisar os dados possibilitando transformar as informações obtidas em números que geram a interpretação. Para criação e análise dos gráficos foi utilizado o Software GraphPad Prism versão 5, que possibilitou a interpretação visual das análises. Na avaliação dos critérios de normalidade dos dados obtidos, foi realizado o teste Shapiro-wilk. Seguindo critérios de normalidade e homocedasticidade, as diferenças entre as médias dos grupos foram avaliadas pelo teste de análise de variância (ANOVA One Way), seguida do pós-teste Tukey. Em todos os testes foi considerado o grau de significância de 5% (P<0,05).