CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Lorena Raquel de Sena Miranda
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DE SISTEMAS POLIMÉRICOS DE CARBOIDRATOS NATURAIS PARA
LIBERAÇÃO COLÔNICA DE TRIANCINOLONA
ORIENTADOR: Prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa CO-ORIENTADOR: Prof(a). Dr(a). Waldenice de Alencar Morais
NATAL-RN 2017
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DE SISTEMAS POLIMÉRICOS DE CARBOIDRATOS NATURAIS PARA LIBERAÇÃO COLÔNICA DE
TRIANCINOLONA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção de título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR:
Prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa
CO-ORIENTADOR:
Prof. Dra. Waldenice de Alencar Morais
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Miranda, Lorena Raquel de Sena.
Desenvolvimento e avaliação da atividade antiinflamatória de sistemas poliméricos de carboidratos naturais para liberação
colônica de triancinolona / Lorena Raquel de Sena Miranda. - Natal, 2017.
65f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2018.
Orientador: Prof. Dr. Euzébio Guimarães Barbosa. Coorientador: Prof. Dra. Waldenice de Alencar Morais.
1. Quitosana - Dissertação. 2. Sistemas particulados - Dissertação. 3. Polímeros - Dissertação. 4. Triancinolona -
Dissertação. I. Barbosa, Euzébio Guimarães. II. Morais, Waldenice de Alencar. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 547.995
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
Dedico este trabalho as pessoas mais presentes em minha vida:
Meus pais, Débora e Lenilson, por me incentivaram tanto e sempre acreditarem em mim. É a vocês que devo cada vitória alcançada.
Ao meu amor, Fellipe, que sempre esteve ao meu lado me aconselhando e me dando forças. Vocês são o meu maior presente. Amo vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao nosso pai todo poderoso, Deus, que através de sua infinita
misericórdia, proporcionou que eu conseguisse alcançar mais essa etapa na minha vida.
Aos meus pais, Lenilson Rodrigues de Miranda e Débora de Sena Marinho Miranda
por todo amor, apoio, conselho, só o que posso oferecer-vos é minha imensa gratidão, por
acreditarem em mim e sempre me incentivarem a perseverar nos estudos, por mais difícil que
em alguns momentos parecesse.
Ao meu irmão Lucas que apesar de tudo, sempre que eu precisei me auxiliou.
Ao meu noivo Fellipe Albano, por estar presente em cada momento durante essa
caminhada, pelo seu amor, carinho, compreensão e por estar sempre disposto a me ajudar.
A todos os meus amigos da igreja por compreenderem a minha ausência em alguns
momentos por estar ocupada com o mestrado.
Agradeço a todos os docentes da Faculdade de Farmácia da UFRN por todos os
ensinamentos e contribuições para a minha formação.
A todos do Laboratório de Farmacotécnica, por todo conhecimento compartilhado, por
toda colaboração prestada, por toda amizade, obrigada de coração por tudo.
Ao professor Dr. Euzébio Guimarães Barbosa por sua orientação e incentivo na
execução desse trabalho.
Sou grata principalmente a minha co-orientadora Dr. Waldenice de Alencar Morais que
me ajudou desde o momento que me escreveu a carta de referência para realizar um
intercâmbio em Portugal, até no meu retorno, recebendo-me em seu laboratório para que eu
pudesse desenvolver o trabalho de conclusão de curso e agora o mestrado, por me conduzir ao
“Nunca deixe ninguém dizer que você não pode fazer alguma coisa. Se você tem um sonho, tem que correr atrás dele. As pessoas não conseguem vencer e dizem que você também não vai vencer. Se quer alguma coisa, corra atrás.”
RESUMO
As associações poliméricas de carboidratos na forma de sistemas particulados com quitosana e goma guar apresentam propriedades de degradação enzimática seletiva para a região do cólon, bioadesão, retenção de água e liberação controlada em condições de pH simulando o fluido intestinal (ARGIN; KOFINAS; LO, 2014). Este trabalho teve como objetivo obter, caracterizar e avaliar a ação antinflamatória in vitro e in vivo de novos sistemas particulados (SP) de quitosana e goma guar para a liberação colônica da triancinolona (TRI). Os sistemas foram preparados usando a técnica de coacervação simples com adição de sulfato de sódio seguido pelo método de secagem por spray drying. Após a realização de testes prévios, foram padronizados: a temperatura de entrada de 140° C e de saída de 90° C, blower 6,5 e atomização do ar 0,1 ppm. Diferentes razões fármaco-polímero (1:5, 1:10 e 1:20 p/p) e polímero-polímero (50:50, 25:75 e 75:25 p/p) foram estudadas quanto ao rendimento (%), eficiência de encapsulação, EE (%) e loading (mg TRI / g SP), infravermelho, DSC, TG, cinética, intumescimento e estudo in vivo para otimizar as condições de preparação dos sistemas particulados obtidos. Os sistemas particulados com maior razão de quitosana:goma (75:25 p/p) apresentaram melhores resultados quanto ao rendimento (%), entretanto o sistema particulado (25:75 p/p) apresentou maior eficiência de encapsulação (%) e loading (mg TRI / g SP), além de um menor perda de massa na análise térmica (TG). Porém, devido seu baixo rendimento, optou-se por usar no estudo in vivo a razão polimérica 50:50 p/p com triancinolona 1:10, por causa do seu bom rendimento e razoável eficiência de encapsulação. A caracterização dos sistemas por infravermelho evidenciou as interações entre os componentes da formulação. A análise térmica mostrou que os sistemas com maior quantidade de quitosana apresentaram uma maior estabilidade térmica. O estudo de cinética das três razões poliméricas com TRI 1:10 ocorreu em duas fases, a primeira com uma rápida liberação inicial (efeito burst) em 1 hora e uma segunda fase de liberação, mais controlada. Após 24 horas quase 100% da triancinolona foi liberada. O estudo de intumescimento mostrou diferença estatística de 24h a 48h, com p < 0,05, a razão polimérica 75:25 p/p intumesceu mais que as demais razões. Todos os sistemas particulados intumesceram mais que os placebos. Diante disso, os dados asseguram que um novo sistema tecnológico particulado obtido por spray drying a partir de quitosana e goma guar, foram capazes de modificar a liberação da triancinolona com potencial para aplicação como antiinflamatório na colite ulcerativa.
The polymeric associations of carbohydrates in the form of differential systems with chitosan and guar gum in selective enzymatic degradation properties for the well region, bioadhesion, water retention and controlled release under pH conditions simulating the intestinal fluid (ARGIN, KOFINAS, LO, 2014). This work aimed to obtain, characterize and evaluate an in vitro and in vivo anti-inflammatory action of new specified systems (SP) of chitosan and guar gum for the colonic release of triamcinolone (TRI). Systems employing the simple coacervation technique with the addition of sodium sulfate follow the spray drying drying method. After a previous test, standardized: an inlet temperature of 140° C and outlet of 90° C, blower 6.5 and atomization of air 0.1 ppm. Different drug-polymer ratios (1: 5, 1:10 and 1:20 w / w) and polymer-polymer (50:50, 25:75 and 75:25 w / w) were studied for yield (%), encapsulation efficiency , EE (%) and loading (mg TRI / g SP), infrared, DSC, TG, kinetics, swelling and in vivo study to optimize as preparation conditions of the obtained particulate systems. The systems seem to have a higher chitosan: gum ratio (75:25 w / w) showed better yield (%), between the particulate system (25:75 w / w) showed higher encapsulation efficiency (%) and loading (mg TRI / g SP), as well as a lower mass in the thermal analysis (TG). However, because of its low yield, it was chosen to use without in vivo study the polymer ratio 50:50 w / w with 1:10 triamcinolone, because of its yield and reasonable encapsulation efficiency. A characterization of the infrared systems is evidenced as interactions between the components of the formulation. A thermal analysis shown in systems with greater amount of chitosan presented a greater thermal stability. The kinetics study of the three polymer ratios with TRI 1:10 occurred in two phases, a first time with a rapid initial release (burst effect) in 1 hour and a second, more controlled release phase. After 24 hours almost 100% of triamcinolone was released. The swelling study showed the differential statistic from 24h to 48h, with p <0.05, the polymer ratio 75:25 p / p swelled more than other reasons. All specified systems swelled more than placebos. Therefore, the data ensure that a new technological system specialized by spray-drying from chitosan and guar gum, compresses the ability to modify the release of triamcinolone with potential as an anti-inflammatory application in ulcerative colitis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- a) Aspecto de um cólon normal e de um cólon afetado pela doença (inflamação severa)
16
Figura 2- Estrutura química da triancinolona 18
Figura 3- Modelo simplificado de liberação de fármacos 19
Figura 4- Representação esquemática de nano/microcápsulas e nano/microesferas
20
Figura 5- Estrutura química da quitina e quitosana 21
Figura 6- Estrutura química da goma guar 22
Figura 7- Representação esquemática do funcionamento de um aparelho de spray drying
24
Figura 8- Representação esquemática da preparação dos sistemas particulados de quitosana e goma guar com triancinolona usando o spray drying
31
Figura 9- Esquema do estudo de cinética de liberação in vitro da triancinolona a partir de sistemas particulados de quitosana
35
Figura 10- Curva padrão da triancinolona 41
Figura 11- Espectros obtidos na região do infravermelho: Matérias primas: (a) Goma Guar; (b) Quitosana e (c) Triancinolona
45
Figura 12- Espectros obtidos na região do infravermelho dos placebos preparados: (a) por mistura física (PPM) e (b) seco por spray drying
45
Figura 13- Espectros obtidos na região do infravermelho para os sistemas particulados das diferentes razões QUI-GG 25:75, 50:50 E 75:25 (p/p) encapsulados com triancinolona (1:10)
46
Figura 14- A) Curvas DSC para matérias primas: quitosana, goma guar e triancinolona. B) Curvas DSC dos sistemas particulados nas diferentes razões de QUIT-GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p). C) Curvas DSC do placebo seco por spray drying (PSD) e placebos misturas físicas (PPM) nas diferentes razões de QUIT:GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p).
48
Figura 15- A) Curvas TG para matérias primas: quitosana, goma guar e triancinolona. B) Curvas TG dos sistemas particulados nas diferentes razões de QUIT-GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p). C) Curvas TG do placebo seco por spray drying (PSD) e placebos misturas físicas (PPM) nas diferentes razões de QUIT:GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p).
49
Figura 16- Estudo in vivo, perfil de perda de peso nos diferentes grupos estudados
50
Figura 17- Exame macroscópico dos diferentes grupos 51
Figura 18- Perfil de liberação in vitro da triancinolona a partir dos sistemas
particulados poliméricos de quitosana e goma guar em 30 h. 53 Figura 19- Grau de intumescimento dos sistemas particulados nas diferentes
razões poliméricas e placebos seco por spray drying e mistura física
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Preparo das formulações com diferentes razões poliméricas 30 Tabela 2- Rendimento (%) dos sistemas particulados de QUIT/GG com
diferentes razões fármaco/polímero e polímero/polímero
39
Tabela 3- Valores de área absoluta obtidos para a curva padrão da triancinolona por espectrofotômetro.
40
Tabela 4- Conteúdo dos sistemas particulados de QUIT/GG com diferentes razões de fármaco-polímero e polímero-polímero
42
Tabela 5- Correlação dos dados experimentais do perfil de liberação da triancinolona com os modelos cinéticos de liberação a partir dos sistemas particulados poliméricos QUIT:GG
52
Tabela 6- Parâmetros cinéticos calculados por regressão não-linear usando modelos matemáticos aos dados experimentais do perfil de liberação da triancinolona a partir dos sistemas particulados poliméricos
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AINES Antiinflamatórios não-esteroidais CEUA Comitê de ética do uso de animais DCII Doenças inflamatórias intestinais
DP Desvio padrão
DPR Desvio padrão relativo
DSC Calorimetria exploratória diferencial EE Eficiência de encapsulação
FT-IR Fourier transform infrared spectroscopy
GG Goma guar QUIT Quitosana R2 Coeficiente de correlação SP TG Sistemas particulados Termogravimetria TGI Trato Gastrointestinal
TRI Triancinolona
UC Colite Ulcerativa UV-VIS Ultravioleta visível 5- ASA Ácido 5-Aminosalicílico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 11
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 14
2.1 TRATO GASTRO INTESTINAL 15
2.1.1 Etiologia das doenças inflamatórias intestinais 15
2.1.2 Colite ulcerativa 16
2.1.3 Triancinolona 18
2.2 SISTEMAS PARTICULADOS POLIMÉRICOS DE
CARBOIDRATOS
19
2.2.1 Quitosana 21
2.2.2 Goma Guar 22
2.3 SULFATO DE SÓDIO 22
2.4 SISTEMAS PARTICULADOS POLIMÉRICOS E FÁRMACOS ANTIINFLAMATÓRIOS
22
2.5 SECAGEM EM APARELHO SPRAY DRYING 23
3 OBJETIVOS 25
3.1 OBJETIVO GERAL 26
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 26
4 JUSTIFICATIVA 27
5 MATERIAIS E MÉTODOS 29
5.1 SISTEMAS PARTICULADOS POLIMÉRICOS 29
5.1.1 Preparação dos sistemas poliméricos 29
5.1.2 Quitosana e Goma Guar (QUIT-GG) 29
5.1.3 Secagem no spray drying 29
5.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS
POLIMÉRICOS
32
5.2.1 Curva padrão da triancinolona 32
5.2.2 Eficiência de encapsulação 32
5.2.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho 33
5.2.4 Análise térmica (DSC e TG) 33
5.2.5 Cinética de liberação in vitro 34
5.2.6 Intumescimento 35
5.2.7 Estudo in vivo 35
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES 37
6.1 PREPARAÇÃO DOS SISTEMAS POLIMÉRICOS 38
6.1.1 Quitosana e Goma Guar (QUIT- GG) 38
6.2 RENDIMENTO 38
6.2.1 Diferentes razões poliméricas QUIT/GG (25:75, 50:50 e 75:25) com TRI (1:5)
39
6.2.2 Diferentes razões poliméricas QUIT/GG (25:75, 50:50 e 75:25) com TRI (1:10)
39
6.4 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO E LOADING 41
6.5 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO
INFRAVERMELHO
43
6.6 ANÁLISE TÉRMICA (DSC E TG) 47
6.7 ESTUDO IN VIVO 51
6.8 CINÉTICA DE LIBERÇÃO IN VITRO 53
6.9 INTUMESCIMENTO 56
7 CONCLUSÕES 58
8 REFERÊNCIAS 60
1 INTRODUÇÃO
Doenças inflamatórias intestinais são um problema de saúde pública em muitos países, sendo causa de morbidade e mortalidade associadas a crises de diarreia e risco de câncer de cólon (BIONDO-SIMÕES et al., 2003). Com isso, a região do trato gastrointestinal (TGI) para a terapia de desordens intestinais passou a se tornar um tópico de grande interesse de estudos científicos e clínicos (LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010).
Muitos polímeros de carboidratos que ocorrem naturalmente, são materiais biodegradáveis com baixa toxicidade e baixo custo tais como celulose, amido, quitosana, pectina, gomas e alginato (LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010). Associações destes polímeros de carboidratos na forma de sistemas particulados mostram-se ser estáveis no TGI superior e são degradados seletivamente por bactérias anaeróbias do cólon, tornando estes dispositivos promissores para a liberação colônica de fármacos. Além disso, quando utilizado apenas um carboidrato este não é tão efetivo para controlar de uma forma desejável a liberação do fármaco quanto a sua forma modificada ou combinada com outro polímero (SHUKLA; TIWARI, 2012).
Estudos mostram que a quitosana, assim como algumas gomas, tal como a goma guar e suas associações apresentam propriedades de degradação enzimática seletiva para a região do cólon, bioadesão, retenção de água, liberação controlada em condições de pH simulando o fluido intestinal, resistência às condições ácidas do TGI superior, as quais são atrativas e complementares quando esses carboidratos são associados para o desenvolvimento de sistemas promissores para a liberação colônica de fármacos (ARGIN; KOFINAS; LO, 2014).
A quitosana é um aminopolissacarídeo linear biodegradável, catiônico, não tóxico e biocompatível (AGNIHOTRI, 2004). A goma guar é um heteropolissacarídeo natural extraído da semente da planta leguminosa, Cyamposis tetragonoloba, é uma galactomanana neutral. Sua estrutura consiste em uma cadeia principal de unidades de β-D-manopirasonil unidas por ligações (1 - 4) a ramificações de uma única unidade de α-D-galactopiranosil, ligadas na posição O-6 (SHAHID et al., 2013).
Dentre os diversos fármacos cuja liberação no cólon é desejável, o glicocorticóide triancinolona merece destaque, sendo inclusive de maior potência farmacológica quando comparada a sulfassalazina, o fármaco mais utilizado atualmente para o tratamento de colite ulcerativa e doença de Crohn (LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010). Entretanto, a triancinolona pode causar efeitos secundários indesejáveis característicos de glicocorticóides esteróides associados à sua absorção sistêmica e tratamento prolongado (LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010).
A incorporação da triancinolona em sistemas particulados poliméricos de carboidratos para a sua liberação colônica pode oferecer inúmeras vantagens, como reduzir a dose necessária para a resposta terapêutica desejada, melhorar o controle e a seletividade da liberação, reduzir as flutuações sanguíneas e minimizar efeitos adversos em tratamentos crônicos (BRANNON-PEPPAS, 1995; SAFARI; ZARNEGAR, 2014).
A carência de estudos da avaliação antiinflamatória in vivo da triancinolona em modelo de colite ulcerativa a partir de sistemas poliméricos dos carboidratos quitosana e goma guar para a sua liberação colônica, fez com que houvesse a necessidade de investigar a presente proposta inovadora, que se baseia em combinar as vantagens da tecnologia farmacêutica através da obtenção de sistemas particulados poliméricos, com os benefícios da associação de carboidratos naturais para uma liberação local, seletiva e controlada da triancinolona na região do cólon.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 TRATO GASTRINTESTINAL
O trato gastrintestinal (TGI) é responsável pela digestão, absorção e excreção de compostos ingeridos, tem a função de prover água, eletrólitos e alimentos, sendo de fundamental importância para um bom desempenho das funções do corpo (GUYTON et al., 2006). O TGI controla o maior número de células endócrinas e imunes do organismo (AHLMAN et al., 2001).
O intestino possui uma microbiota com mais de mil espécies, essas são determinadas pelo gene e por características individuais e ambientais, tais como idade, dieta, forma do parto (HUTTENHOWER et al., 2012). Este órgão é formado por células denominadas caliciformes, responsáveis pela produção de muco e peptídeos antimicrobianos fundamentais para proteção do epitélio intestinal (MALOY e POWRIE, 2011).
2.1.1 Etiologia das doenças inflamatórias intestinais
As doenças inflamatórias intestinais (DII) incluem a doença de Chron e a colite ulcerativa (UC), esta última também conhecida como retocolite ulcerativa idiopática. Essas acometem o trato digestório, causando recidivas frequentes e formas clínicas graves (JEWEL, 1998; KRONBLUTH et al., 1998; SOUZA et al., 2002). A causa dessas alterações não são totalmente conhecidas, porém é caracterizada por interação complexa de fatores genéticos, imunológicas e ambientais (FIOCCHI, 1997; POLI et al., 2001). Pacientes acometidos com doenças inflamatórias tem sua qualidade de vida alterada, possuem alta morbidade e grandes chances de desenvolver câncer de cólon. As DII ocorrem em todo o mundo e acometem principalmente jovens de 20 a 40 anos e idosos (JEWELL, 1998). A incidência varia bastante em relação a região geográfica e grupo populacional. Os Estados Unidos, Reino Unido e Austrália têm uma maior prevalência da doença que a América Latina. Contudo, ocorre um aumento na incidência das DII em países com condições econômicas em ascensão (APPLEYARD et al., 2004, EKBOM et al., 1991; IRVINE et al., 2001; SOUZA et al., 2002; STEINWURZ, 1998). O acometimento da doença em relação ao sexo feminino ou masculino não difere nas DII, porém classes econômicas mais elevadas, fumantes, parentes de primeiro grau de indivíduos portadores de DII e moradores de áreas urbanas são mais susceptíveis a vir a ter a doença (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE- OMS, 2002).
A patogenia da doença não é elucidada, porém acredita-se que as DII provém de anormalidades imunológicas celulares, ou seja, da reatividade anormal dos linfócitos T da mucosa gastrintestinal a uma microflora normal não patogênica (MATSUMOTO et al., 2001). Essa resposta imune exacerbada do
intestino para outros tecidos e órgãos gera o desequilíbrio entre a síntese e liberação de mediadores pró- inflamatórios contribuindo para uma resposta inflamatória no intestino (ALGIERI et al., 2013).
Fatores ambientais também podem estar envolvidos, indivíduos que moram em países de baixa incidência e migram a países desenvolvidos antes da adolescência mostram um aumento da incidência da DII (BERNSTEIN et al., 2008). Dentre as causas externas têm-se: uso de tabaco e de antiinflamatórios não esteroidais (AINES), grau de exposição aos patógenos intestinais e composição da dieta e da microbiota intestinal (OLIVEIRA et al., 2010; SHANAHAN, 2002).
Existem estudos que evidenciam que “fast-food” e alimentos ricos em ácidos graxos aumentam o risco de manifestação da doença, porém não existem evidências suficientes que comprovem a relação entre a composição da dieta com o desenvolvimento das DII (KRISHNAN & KORZENIK, 2002; PERSSON, AHLBOL & HELLERS, 1992).
2.1.2 Colite ulcerativa
A colite ulcerativa é caracterizada pela presença de ulcerações, principalmente na mucosa intestinal da região do cólon e reto, resultando em friabilidade difusa e erosões com sangramento, como é demonstrado na figura 1. Ocorrem períodos de exacerbação e remissão da doença, que acometem, geralmente a área anteriormente afetada (BAUMGART et al., 2007). Os sinais clínicos da UC são parecidos com infecções entéricas o que dificulta o diagnóstico rápido da doença, assim como a melhor intervenção (COSNES et al., 2011).
Os sintomas e o tratamento dependem da extensão e grau de severidade da inflamação. Os sintomas mais comuns são: diarreia, sangramento retal, tenesmo, eliminação de muco e dor abdominal (BIONDO-SIMÕES et al., 2003, OLIVEIRA et al., 2010).
Figura 1- a) aspecto de um cólon normal b) aspecto de um cólon afetado pela doença (inflamação severa)
A microbiota intestinal de indivíduos com dietas ricas em lipídeos gera uma reserva de toxina, na qual aumenta a absorção de lipopolissacarídeos (CARISSILI et al., 2011). O muco produzido pelas células caliciformes protege as células da mucosa do ataque antigênico, diretamente relacionado com a etiologia das doenças inflamatórias intestinais (SERIL et al., 2003). Uma hipótese é que uma resposta imune deficiente e uma barreira epitelial inapropriada são fatores que contribuem para a fisiopatologia da UC (ZHANG et al., 2006).
O diagnóstico é feito através do histórico clínico e exames, tais como: fezes, sangue, fígado, rins. Ainda é possível observar regiões ulceradas, hemorragias, pseudopólipos e formação de abscessos por meio de endocospia e análise histopatológica (BAUMGART et al., 2007).
Apesar de não haver um tratamento que leve a cura ou redução considerável da doença, é observado um avanço no tratamento, dado que no século XX usava-se apenas a psicoterapia. A terapêutica atual engloba o tratamento farmacológico, nutricional e em alguns casos cirúrgicos, esta tem como objetivos o controle da atividade da doença, bem como prevenção de recidivas (TRIANTAFILIDIS, 2011).
A primeira linha de tratamento da UC são os 5-aminossalicilatos, disponíveis por via oral e retal (tópica). A sulfassalazina é a combinação de sulfonamida (sulfapiridina) e um salicilato (ácido 5- aminosalicílico, a mesalazina ou 5-ASA) que se apresentam unidos por uma ligação “azo”. Esta é altamente prescrita nas últimas décadas, devido sua eficácia e custo baixo, porém este medicamento causa vários eventos adversos dose-dependentes, incluindo cefaléias, dispepsia, náuseas e alergias (BAUMGART et al., 2007). Pacientes que utilizam os 5-ASA devem ter a função renal monitorada caso haja insuficiência renal pré-existente, comorbidades e uso de outras drogas nefrotóxicas.
A dose da sulfassalazina de acordo com a base de dados Micromedex é de inicialmente, 3 a 4 gramas/dia por via oral em doses divididas uniformemente não superior a intervalos de 8 horas; manutenção, 2 gramas/dia por via oral em doses divididas não superior a intervalos de 8 horas. No mercado farmacêutico está disponível nas doses de 500mg. Embora seja um fármaco efetivo, a tomada correta do medicamento é de apenas 40%, o público que não adere ao tratamento são principalmente pacientes do sexo masculino, solteiros e que tomam quatro ou mais medicamentos simultaneamente (KANE, COHEN, AIKENS, 2001). Um estudo realizado por Dewulf e colaboradores observou que 15,4% dos pacientes com UC não tomam a medicação prescrita, e 13,3% não tomam o medicamento na quantidade recomendada. Problemas de esquecimento com horário e não adesão foi de 63%. Esses pacientes tem o risco de recidiva de 61% em contraposição de apenas 11% dos aderentes a terapia. No que concerne ao câncer de colorretal, os não aderentes têm o risco de 31%, enquanto que os aderentes é de apenas 3%. Contudo, a não adesão implica em problemas sérios para os pacientes. Além da mesalazinas, também podem ser usados como tratamento corticosteróides e imunossupressores.
2.1.3 Triancinolona
A triancinolona (figura 2) é um glicocorticoide sintético potente com propriedades antiinflamatórias e imunossupressoras. É um pó branco, cristalino, inodoro, hidrofóbico, possuindo baixa solubilidade em água (14-20 mg/mL), porém solúvel em etanol e metanol, possui massa molar de 394,4 g/mol e ponto de ebulição de 277º C. Diversas formas farmacêuticas estão disponíveis: via oral (comprimidos), via parenteral (intramuscular e intravenosa) e via tópica (solução) (MARTINDALE, 2009; THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF GREAT BRITAIN, 1986; WENG et al., 2014).
Este fármaco tem diversas aplicações terapêuticas, muitas das quais estão associadas a condições clínicas crônicas que envolvem processos inflamatórios, como psoríase, artrite, lúpus e colite ulcerativa (MORRISON et al., 2007; SILVA-JÚNIOR, 2009).
Os glicocorticoides são eficazes para induzir a remissão da colite ulcerativa moderada, porém seu uso sistêmico pode ser associado a efeitos colaterais importantes, mesmo durante o tratamento a curto prazo. Já em tratamento de processos infamatórios locais no cólon, a triancinolona é mais potente que a sulfassalazina. A liberação de fármacos na região do cólon vem merecendo destaque em muitos estudos recentes na terapia local e sistêmica de inflamações. O desenvolvimento de sistemas particulados para liberação da triancinolona na região do cólon representa uma alternativa promissora para o tratamento de inflamações crônicas (LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010).
Figura 2- Representação esquemática da estrutura química da triancinolona.
Fonte: Fonseca, 2015
Interações medicamentosas podem afetar a eficácia do tratamento das doenças inflamatórias intestinais ou de outro tratamento que o paciente possa estar fazendo. Os glicocorticoides têm um grande número de interações (GOODMAN et al., 2003; MICROMEDEX, 2007). Também é necessário ficar atento a interações medicamento-alimento que podem ocorrer.
2.2 SISTEMAS PARTICULADOS POLIMÉRICOS DE CARBOIDRATOS
Os sistemas particulados poliméricos são dispositivos de liberação controlada de fármacos com tamanho variando da escala nanométrica (nanopartículas) a micrométrica (sistemas particulados) capazes de incorporar diferentes agentes terapêuticos, desde fármacos de baixo peso molecular a macromoléculas (BARAT et al., 2008). Em sistemas convencionais de liberação de fármacos, o princípio ativo vai sendo liberado logo após a administração, não sendo possível manter a concentração do fármaco constante dentro da faixa terapêutica, com isso surge a necessidade de várias doses, o que pode gerar toxicidade ou ineficácia do tratamento quando não administrado corretamente. No entanto, os sistemas de liberação modificada ou controlada (figura 3) têm a capacidade de liberar o princípio ativo no local alvo de ação, com liberação progressiva e controlada, além de serem capazes de melhorar aspectos físico-químicos de princípios ativos, tais como: alta dosagem e efeitos colaterais, alta toxicidade, baixa solubilidade aquosa, meia-vida curta, promovendo uma maior eficácia terapêutica, com isso mais vantajosos quando comparados aos sistemas convencionais de administração (EFENTAKIS et al., 2006; SUN et al., 2003).
Figura 3 - Modelo simplificado de liberação de fármacos
Fonte: LYRA, 2007.
Esses sistemas podem ser classificados de acordo com a sua composição e organização estrutural em nanoesferas/microesferas e nanocápsulas/microcápsulas (BERKLAND et al., 2001; MANDAL et al., 2001; SINGH et al., 2001; PETITTI et al., 2008). As nanoesferas e as microesferas (figura 4) são sistemas matriciais ou monolíticos em que o fármaco encontra-se disperso e/ou solubilizado na matriz polimérica, não sendo possível identificar um núcleo diferenciado (LIMAYEM et al., 2004). Por outro lado, as nanocápsulas e microcápsulas são sistemas reservatórios nos quais o fármaco está contido em um núcleo central (de natureza oleosa ou aquosa) com um revestimento polimérico disposto ao redor deste núcleo que atua como um filme protetor (SOPPIMATH et al., 2001).
Fonte: Adaptado de SCHAFFAZICK et al., 2003.
Esses sistemas apresentam uma boa estabilidade físico-química e biológica, sendo utilizados para a encapsulação de diferentes substâncias, como peptídeos, proteínas, DNA/RNA e fármacos (GARBAYO et al., 2008; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008). No mercado farmacêutico existem
produtos contendo sistemas particulados poliméricos (como Lupron®, Depot®, Zoladex®,
Decapeptyl®, Eligard®, Enantone®, Trenantone®, Nutropin Depot®, e Profact®) (HANS; LOWMAN, 2002; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008). Na obtenção de sistemas particulados são utilizados polímeros biocompatíveis e biodegradáveis tanto naturais quanto sintéticos (BRANNON- PEPPAS, 1995). Os polímeros naturais são bastante empregados, pois oferecem numerosas vantagens como carreadores de fármacos, e por serem encontrados em abundância na natureza e serem de baixo custo (BALMAYOR et al., 2009).
Sistemas particulados obtidos a partir de polímeros naturais de carboidratos vêm sendo estudados para a liberação colônica de fármacos uma vez que são estáveis no TGI superior e são ativados seletivamente pela microbiota local do cólon favorecendo uma liberação sítio específica controlada. Sistemas poliméricos para a liberação colônica baseados na associação de carboidratos e suas modificações químicas mostram-se mais eficazes frente a variações fisiológicas (pH, tempo de retenção gástrica) e patológicas de cada doença (KOPEEK, 2010). Os polímeros de carboidratos comumente empregados são goma guar, goma xantana, pectina e quitosana, que dependendo da necessidade do perfil de liberação do fármaco encapsulado, podem ser modificados quimicamente usando agentes reticulantes ou polímeros entéricos derivados de celuloses (SHUKLA; TIWARI, 2012).
Os sistemas poliméricos tem sido utilizados para liberação modificada pelas suas propriedades e por alcançarem sítios específicos de ação farmacológica (BRAGA; OLIVEIRA, 2007). Estas são partículas cujo diâmetro são maiores que 1 µm, enquanto que as nanopartículas tem diâmetro menor que 1 µm (COUVRER et al., 1996).
A quitosana é um biopolímero obtido pela desacetilação parcial da quitina (figura 5) composta por (1 → 4)-2-acetamido-2-desoxi-β-D-glucana (N-acetil-D-glucosamina) e (1 → 4)-2-amino -2- desoxi-D-glucana β (D-glucosamina) unidades, comporta-se como um polieletrólito catiônico (pKa variando de 6,2 a 7,0). O grau de desacetilação da quitina determina quando a mesma é transformada em quitosana que é 50%, no comércio varia de 70 a 95% (CANELLA; GARCIA, 2001; RINAUDO, 2006). A quitina é encontrada em crustáceos, insetos e fungos (AGNIHOTRI, 2004), sendo o segundo polímero natural mais abundante da terra.
Figura 5 - Estruturas químicas da quitina e quitosana
Fonte: Fonseca, 2015.
A quitosana é uma base fraca, insolúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos, porém solúvel em ácidos fracos diluídos, sendo o ácido acético o mais comumente utilizado (LARANJEIRAS et. al., 2009). O polissacarídeo é convertido em polieletrólito em meio ácido (pKa variando entre 6,2 e 7,0), quando solubilizado ocorre a protonação do –NH2 no carbono C2, posição em que a D- glucosamina se repete (RINAUDO, 2006).
Este biopolímero tem a capacidade de se reticular física ou quimicamente devido os grupamentos amino que os tornam bastante versátil e reativo, uma vez que influenciam em suas propriedades físico-químicas. Além de muitas possibilidades de modificações, tais como, N-acetilação, N-alquilação, N-carboxilação, N-sulfonação e formação de bases de Schiff com aldeídos e cetonas (GONSALVES, 2011; LARANJEIRA; FÁVERE, 2009).
Aminopolissacarídeo linear biodegradável, hidrófilo, catiônico, polímero cristalino, não tóxico e biocompatível, com capacidade de formar película e gelificação. Este biopolímero é bastante usado no desenvolvimento de produtos no campo farmacêutico devido suas características biocompatível, biodegradável, não tóxica, antimicrobiana e natureza não alérgica (CROISIER, JÉRÔME, 2013; SENEL, MCCLURE, 2004; YANG ET AL, 2010).
As propriedades de absorção e de bioadesão da quitosana melhoram a penetração de fármacos pelas barreiras intestinais e aumentam o tempo de residência no TGI contribuindo para a liberação colônica, conferindo lhe uma vantagem em relação aos sistemas convencionais (AGNIHOTRI, 2004).
2.2.2 Goma Guar
A goma guar (figura 6) é um heteropolissacarídeo natural extraído da semente da planta leguminosa, Cyamposis tetragonoloba, é uma galactomanana neutral. Sua estrutura consiste em uma cadeia principal de unidades de β-D-manopirasonil unidas por ligações (1-4) a ramificações de uma única unidade de α-D-galactopiranosil, ligadas na posição O-6. A goma guar é hidrofílica, não-tóxica, facilmente disponível e biodegradável, é utilizado em diversas aplicações farmacêuticas como aglutinante, desintegrante, agente suspensor e estabilizante, também é usado na indústria alimentícia como agente espessante (SHAHID et al., 2013).
Figura 6 - Estrutura química da goma guar.
Fonte: MISHRA; SEN, 2011.
A goma guar em concentrações baixas forma soluções viscosas, pouco afetadas pelo pH (4-9), pela presença de íons e processamentos térmico (CAVALLIERI, 2007).
De modo a melhorar as propriedades de degradação enzimática e o intumescimento, produtos modificados estão sendo produzidos. Ao testar a gelificação da goma guar a mesma retarda a liberação do fármaco e é susceptível a degradação na região colônica (SHUKLA; TIWARI, 2012).
2.3 SULFATO DE SÓDIO
Para prevenir a liberação precoce do fármaco foi utilizado um composto reticulante, o sulfato de sódio à mistura polimérica, que irá interagir através do método de coacervação/precipitação, este causa um decréscimo na solubilidade da quitosana, levando à precipitação do polímero como um derivado pouco solúvel (SHUKLA; TIWARI, 2012).
2.4 SISTEMAS PARTICULADOS POLIMÉRICOS E FÁRMACOS ANTIINFLAMATÓRIOS
Sistemas de liberação poliméricos contendo fármacos antiinflamatórios demonstram ser capazes de resolver problemas de farmacocinética e de efeitos adversos (LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010). Muitas moléculas antiinflamatórias apresentam a incidência de efeitos adversos típicos inviabilizando o seu uso prolongado apesar da sua importante potência
farmacológica. O encapsulamento destes fármacos em sistemas poliméricos pode potencializar o seu efeito terapêutico ou diminuir efeitos tóxicos, possibilitando o seu uso em doenças inflamatórias crônicas.
Estudos mostram que a quitosana, assim como a goma guar apresentam propriedades de degradação enzimática seletiva para a região do cólon, bioadesão, de retenção de água ou de resistência às condições ácidas do TGI superior, as quais são atrativas e complementares quando esses carboidratos são associados para o desenvolvimento de sistemas promissores para a liberação colônica de fármacos (ARGIN; KOFINAS; LO, 2014).
Porém, poucos medicamentos à base de carboidratos estão comercialmente disponíveis para
a liberação colônica, dentre eles estão TIME Rx and Syncro DoseTM a base de goma xantana da
empresa Patterson (NY, US) e ENCODE-PhloralTM obtido a partir de amido e Eudragit S da empresa ENCAP drug delivery (UK) (SHUKLA; TIWARI, 2012). A obtenção de sistemas particulados de polímeros de carboidratos naturais é uma estratégia promissora para aumentar a eficiência terapêutica de fármacos para o tratamento de condições clínicas crônicas que acometem o cólon e obtenção de um novo produto tecnológico promissor.
A potencialidade da aplicação na nanotecnologia farmacêutica em sistemas poliméricos contendo o antiinflamatório triancinolona já está descrita na literatura (SILVA-JÚNIOR, 2009). Estudo com microcápsulas de quitosana-alginato contendo triancinolona preparadas pelo método de coacervação/gelificação ionotrópica obteve sistemas úteis para a liberação colônica, entretanto o perfil de liberação in vitro apresentado (praticamente 100% de liberação após 6 h) demonstrou que os sistemas necessitam de modificações para uma liberação mais controlada (LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010). Sistemas multiparticulados de quitosana associada à pectina e polímeros entéricos derivados de celulose mostraram-se promissores para liberação colônica. Entretanto carreadores com a associação de quitosana com goma guar ainda não foram propostos para liberação da triancinolona no cólon.
2.5 SECAGEM EM APARELHO SPRAY DRYING
Diversas técnicas podem ser usadas para formação de sistemas particulados, sendo uma das principais a secagem por spray drying (LEE et al., 2013; LI et al., 2013). Esta consiste em uma operação contínua que envolve a transformação de um sistema líquido em um sistema seco.
O processo de secagem por atomização consiste em três etapas fundamentais. Na primeira, o fluido é disperso como gotículas, produzindo uma área grande superficial. Na segunda, ocorre contato destas com uma corrente de ar aquecido, havendo transferência de calor. Na terceira etapa acontece a evaporação do solvente e a formação da partícula sólida (CELIK & WENDEL, 2005; FILKOVÁ, 2006; OLIVEIRA & PETROVICK, 2010). Durante a última fase, as partículas secas devem ser separadas do gás de secagem por dispositivo adequado e serem recolhidas por recipiente (CAL & SOLLOHUB, 2010).
atomização ocorre pela força do ar comprimido, transformando o líquido em pequenas gotículas. As gotículas em conjunto com ar quente, são sopradas para dentro de uma câmara onde o solvente nas gotículas evapora e descarrega para fora através de um tubo de escape, resultando em um pó seco coletado em um tubo coletor.
Os parâmetros do equipamento (figura 7) podem ser ajustados, temperatura de entrada e saída, blower, de modo a proporcionar uma melhor característica dos sistemas particulados, sendo importantes para controlar a velocidade e uniformidade de liberação do fármaco (SILVA-JÚNIOR, 2008).
Figura 7- Representação esquemática do funcionamento de um aparelho de spray drying
Fonte: SILVA-JÚNIOR, 2005; 2008; FU et al., 2002)
Essa técnica apresenta vantagens como rapidez de produção e pode possibilitar a modulação das características físico-químicas dos pós, além de ser amplamente aplicada na preparação de sistemas de liberação de sistemas particulados poliméricas como a base de quitosana (KASPAR; JAKUBEC; STEPANEK, 2013; STULZER et al., 2009).
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Obter, caracterizar e avaliar a ação antinflamatória in vitro e in vivo de novos sistemas particulados de quitosana e goma guar para a liberação colônica da triancinolona.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver sistemas particulados poliméricos de carboidratos naturais contendo triancinolona;
Preparar os sistemas particulados de quitosana-goma-sulfato variando a razão polimérica (p/p) de quitosana-goma (25:75, 50:50 e 75:25) contendo triancinolona através da técnica de spray drying;
Preparar os sistemas particulados de quitosana-goma-sulfato variando a razão fármaco/polímero
(1:5), (1:10) e (1:20) p/p através da técnica de spray drying;
Otimizar parâmetros e caracterizar fisico-quimicamente os sistemas particulados poliméricos obtidos por técnica de spray drying;
Caracterizar fisico-quimicamente os sistemas particulados poliméricos quanto à taxa de encapsulação da triancinolona por espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta, por análise de espectrofotometria de absorção na região do infravermelho e análise térmica (DSC) e (TG);
Avaliar o perfil de liberação in vitro da triancinolona a partir dos sistemas particulados poliméricos;
Avaliar atividade antiinflamatória in vivo dos sistemas poliméricos em modelo de colite ulcerativa.
4 JUSTIFICATIVA
A carência de estudos sobre colite ulcerativa por meio da liberação colônica de triancinolona através de sistemas poliméricos de carboidratos de modo a testar sua atividade antiinflamatória, faz com que haja a necessidade de investir nessa área, que se baseia no uso de tecnologia através do uso de carboidratos naturais e de baixo custo como a quitosana e goma guar.
A potencialidade do uso do antiinflamatório triancinolona usando tecnologia farmacêutica a partir de sistemas poliméricos de quitosana-alginato aplicados à liberação na região do cólon já está descrita na literatura científica. No entanto, os sistemas mostraram ter a necessidade de adequações para um melhor controle da cinética de liberação, e também no estudo não foi avaliada a atividade antiinflamatória in vivo da triancinolona ou dos sistemas obtidos contendo o fármaco.
Na presente proposta, um dos aspectos inovadores recai primeiramente: (a) em se fazer a associação dos polímeros de carboidratos quitosana-goma guar através da obtenção de sistemas particulados poliméricos pela técnica de coacervação simples por adição do sulfato de sódio para fins de liberação colônica da triancinolona, (b) em segundo lugar com avaliação da atividade antiinflamatória in vivo tanto do fármaco livre como dos sistemas obtidos em um modelo de colite ulcerativa induzida por ácido acético em ratos.
A escolha estratégica da quitosana combinada a goma guar foi feita para otimizar a cinética de liberação em relação aos dispositivos já disponíveis na literatura e, justifica-se pelo potencial de sinergismo das propriedades de bioadesão e de retenção de água que ambos os polímeros apresentam.
A associação é favorável para uma liberação mais controlada em condições de pH simulando o fluido intestinal, pela proteção conferida às condições ácidas do TGI superior, bem como pela obtenção de sistemas de liberação colônica mais seletivos, uma vez que ambos os polímeros também são degradados seletivamente por enzimas na região do cólon.
Assim, esse projeto proporciona a obtenção de resultados científicos inovadores do uso da triancinolona aplicada à liberação colônica in vivo, ampliando sua aplicação farmacológica usando ferramentas de nanotecnologia farmacêutica em benefício de uma terapia mais eficaz e segura para o paciente. O projetou conta com a colaboração de outros grupos de estudo que apresentam conhecimento técnico-científico na padronização e uso do modelo de colite ulcerativa induzida por ácido acético em ratos com protocolo aprovado no Comitê de Ética do Uso de animais (CEUA) da UFRN, com o número de protocolo nº 002/ 2014. A nossa equipe foi responsável por obter e caracterizar os sistemas poliméricos de quitosana e goma guar obtidos por coacervação simples/gelificação ionotrópica através da secagem por spray drying.
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 DESENVOLVIMENTO DOS SISTEMAS PARTICULADOS POLIMÉRICOS
5.1.1 Preparação dos sistemas poliméricos sem fármaco
Os sistemas particulados foram preparadas sob agitação mecânica (Nova Ética, modelo 103, Brasil) a partir da associação de dois polímeros, cujas concentrações foram escolhidas de modo a se obter uma viscosidade desejada para realizar o processo de secagem no equipamento spray drying.
Foram preparadas dispersões de quitosana e goma guar, separadamente. Sendo solubilizadas em ácido acético a 2% e água destilada, respectivamente. A quitosana foi adicionada a fase da goma guar após 12 horas de agitação. A mistura permaneceu mais 12 horas sob agitação constante no agitador mecânico (15 rpm).
Diferentes razões poliméricas (p/p) (25:75, 50:50 e 75:25) de quitosana (QUIT) e goma guar (GG) e razões fármaco/polímero (1:5), (1:10) e (1:15) p/p foram avaliadas nestas condições experimentais.
Tabela 1: Preparo das formulações com diferentes razões poliméricas
Fonte: Dados da pesquisa
5.1.2. Preparação dos sistemas poliméricos com fármaco
Após 23 horas de agitação da solução de quitosana e goma guar em agitador mecânico, foi vertido a solução de triancinolona preparada com os solventes etanol e propilenoglicol, sob aquecimento no agitador magnético à 100° C (modelo DT3110H, Diag Tech). Após 30 minutos, foi adicionado o complexante sulfato de sódio (0,3%), permanecendo por mais 30 minutos sob agitação.
Diferentes razões percentuais (25:75, 50:50 e 75:25) de QUIT e GG e razões fármaco/polímero (1:5), (1:10) e (1:20) foram avaliadas nestas condições experimentais.
3.1.1 Secagem no spray drying
Após o preparo, os sistemas particulados foram submetidos à secagem por spray drying (Büchi- 191) usando blower 6,5, atomização do ar 0,1 ppm e diferentes temperaturas de entrada foram testadas:
FORMULAÇÕES POLÍMEROS FÁRMACO QUI:GG P/P TRI:POLÍMEROS p/p 25:75 1:5 50:50 1:10 75:25 1:20
O rendimento é calculado através do peso do produto obtido e a quantidade de sólidos antes da secagem (equação 1), a partir desse foram escolhidos as temperaturas de secagem: entrada 140° C e saída 90° C para os demais testes.
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (%) = 𝑄𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑜
𝑄𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑛𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢çã𝑜 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎𝑔𝑒𝑚 𝑥 100
(Eq. 1)
A representação esquemática do procedimento de preparo para os sistemas particulados carreadas com triancinolona (TRI) estão apresentadas na Figura 8. As amostras foram preparadas em triplicata. O spray drying utilizado tem o modelo Adl311s da Yamato Scientific com bico dosador de 0,4mm.
Fig. 8 - Representação esquemática da preparação dos sistemas particulados de quitosana e goma guar com TRI usando o spray-drying
Fonte: Dados da pesquisa
5.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS POLIMÉRICOS
5.2.1 Curva padrão da triancinolona
Foi preparada uma solução estoque de triancinolona em álcool puro ( etanol P.A., dinâmica) , na concentração de 200 µg/mL. Soluções de concentrações equivalentes a 4, 8, 12, 16 e 20 µg/mL foram preparadas a partir da solução estoque em triplicata. A leitura das amostras foram realizadas em 242 nm. A curva padrão foi obtida a partir dos valores das áreas dos picos em função de sua concentração nas soluções correspondentes. Os parâmetros estatísticos média, desvio padrão (D.P), desvio padrão relativo (D.P.R%) e coeficiente de correlação (R2) foram avaliados de acordo com recomendações da RE nº 899 de 29 de maio de 2003 para validação de metodologias analíticas.
5.2.2 Eficiência de encapsulação
Inicialmente os sistemas particulados poliméricos contendo a molécula terapêutica foram submetidos a uma etapa de centrifugação para a separação da fração encapsulada da não-encapsulada.
Sistemas particulados de Quitosana e Goma Guar
Agitação 12 horas Solução de Quitosana
Mistura polimérica
Solução de Goma Guar
Triancinolona Agitação 30 minutos
Sulfato de sódio Agitação 30 minutos
pela medida do conteúdo da molécula terapêutica nos sistemas particulados usando técnica analítica de espectrofotometria no UV-Vis através da análise univariada com a preparação de curvas de calibração. Quando não for possível a medida direta do conteúdo do fármaco nos sistemas particulados, a taxa de encapsulação será determinada pela diferença entre a quantidade de molécula ativa adicionada no início do processo e a quantidade de molécula ativa medida no sobrenadante (SANTOS-MAGALHÃES, 2000). Os sistemas particulados poliméricos (não contendo as moléculas terapêuticas) foram submetidos ao mesmo método analítico para demonstrar a ausência de interferência dos constituintes da formulação.
Triancinolona
A eficiência de encapsulação da triancinolona nos sistemas particulados de quitosana foi determinada pelo método de extração do fármaco usando espectrofotometria UV-Vis para a sua quantificação. Sistemas particulados foram dispersos em 50 mL de uma mistura de etanol:água (1:5), ultrasonicadas por 15 min, e submetidos a agitação magnética (3 h). A amostra foi centrifugada (3.000 rpm por 15 min) e a concentração de triancinolona determinada em 242 nm no sobrenadante, usando curva de padrão do fármaco na faixa de concentração de 4 a 28 µg/mL. A eficiência de encapsulação (EE) foi calculada através da Equação 2.
EE= Massa da triancinolona nos sistemas particulados x 100 (Eq. 2) Massa inicial teórica da triancinolona
A partir dos experimentos realizados, tais como: infravermelho, análise térmica, cinética e intumescimento foram realizadas as caracterizações quanto a eficiência de encapsulação das amostras nas diferentes razões poliméricas percentuais (25:75, 50:50 e 75:25 p/p).
5.2.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho
Espectros de absorção na região do infravermelho (4000 a 500 cm-1) das matérias-primas triancinolona, quitosana e goma guar, e dos sistemas particulados poliméricos preparados por spray-dryer com fármaco nas diferentes razões de CHI-GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p) na razão fármaco-polímero 1:10 (p/p), foram obtidos usando espectrofotometro Jasco FT-IR 4100 (JascoLecco, Itália). Amostras na razão 50:50 (p/p) sem fármaco obtidas nas mesmas condições dos sistemas (placebo obtido por spray dryer, PSD) e pela simples mistura física dos componentes puros (placebo por mistura física, PPM) também foram analisados. As pastilhas de brometo de potássio (KBr) foram preparadas a partir da mistura de 2 mg de amostra e 300 mg de KBr (previamente triturado e dessecado em estufa a 115ºC até peso constante).
5.2.4 Análise térmica (DSC e TG)
Os termogramas de calorimetria exploratória diferencial (DSC) das matérias-primas triancinolona, quitosana e goma guar, dos sistemas particulados poliméricos contendo triancinolona na razão fármaco-polímero 1:10 (p/p) e nas diferentes razões CHI-GG 25:75, 50:50 e 75:25 (p/p) foram obtidos no DSC-60 A (Shimadzu, Brasil). Placebos preparados por mistura física nas mesmas razões poliméricas e, por spray dryer na razão 50:50 (p/p) também foram analisados.
Amostras (3 mg) foram inseridas em cadinhos de alumínio e, em seguida hermeticamente selados com tampas de alumínio. As análises térmicas foram realizadas de 25 a 250 ºC com atmosfera de nitrogênio (100 mL/min) e uma razão de aquecimento de 10 °C/min.
As medidas termogravimétricas (TG) foram realizadas com TGA-60-AH (Shimadzu, Brasil). As amostras (6 mg) foram pesadas com precisão em cadinhos de platina, aquecidas de 25 a 900 °C a uma taxa de aquecimento de 10 °C/min, sob uma taxa de fluxo de azoto de 50 mL/min.
5.2.5 Cinética de liberação in vitro
A avaliação da cinética de liberação in vitro foi efetuada simulando condições fisiológicas a 37±1° C e garantindo condições sink. A técnica de diálise foi feita para os sistemas particulados com triancinolona em um agitador (Marconi, MA093/1, Brasil) a 75 rpm. Tanto nos estudos de cinética e intumescimento foram utilizados apenas os sistemas particulados nas diferentes razões poliméricas 25:75, 50:50 e 75:25 p/p, utilizando a triancinolona na razão p/p fármaco:polímero 1:10, já que apresentaram resultados satisfatórios de encapsulação (EE e loading).
Como mostra o esquema da figura 9, foi pesada uma massa de 31 mg do sistema particulado, em seguida foi disperso em 2 gotas do tween 20 (0,5%) e 1 mL de água destilada sob agitação magnética e transferida para uma membrana de diálise de 25 mm (Sigma-aldrich, São Paulo), que foi devidamente selada, e colocada em 100 mL de tampão fosfato pH 6,8.
A liberação foi determinada a partir da coleta de 1 mL do meio durante 4 dias de acordo com os seguintes intervalos: 1º dia (T15min, T30min, T1h, T2h, T3h, T4h, T5h, T6h, T8h, T9h), 2º dia (T24h, T26h, T28h, T30h, T32h), 3º dia (T48h, 50h, 52h, 54h, 56h) e 4º dia (72h). A cada coleta, o volume do meio foi reconstituído pelo mesmo volume de solução estoque de tampão fosfato. As concentrações de fármaco nas alíquotas foram determinadas usando curva padrão (4 a 20 μg/mL) de triancinolona em espectrofotômetro usando curva padrão. A porcentagem de liberação foi calculada e o perfil de liberação do sistema particulado polimérico determinado (SANTOS-MAGALHÃES, 2000).
Os dados experimentais da cinética de liberação in vitro foram avaliados em relação a modelos matemáticos teóricos de liberação por regressão não-linear para determinar o mecanismo de liberação e calcular parâmetros de velocidade (MORAIS et al. 2008). Dentre os modelos teóricos foi utilizado o uni-exponencial baseado na lei de Fick pela equação:
𝑀 𝑡 ⁄ 𝑀 ∞ = (1 – b𝑒− 𝑘
𝑡 )
Onde Mt e M∞ são as quantidades de fármaco liberado em um tempo t determinado e o total de fármaco liberado a partir do sistema, respectivamente; e a constante de velocidade k está associada ao coeficiente de difusão do fármaco na matriz polimérica (Klose et al., 2008).
O modelo de Korsmeyer-Peppas também foi aplicado o qual deriva uma relação simples da liberação de fármaco a partir de uma equação do sistema polimérico.
Mt / M∞ = Ktn
Em que Mt / M∞ é uma fração de fármaco liberado no tempo t, k é a constante de velocidade de liberação e n é o expoente de liberação. O valor n é usado para caracterizar diferentes liberações para matrizes de forma cilíndrica. Neste modelo, o valor de n caracteriza o mecanismo de liberação do fármaco. Onde 0,45 ≤ n corresponde a um mecanismo de difusão de Fick. Para estudar a cinética de liberação, os dados obtidos a partir dos estudos de liberação de fármacos in vitro foram representados graficamente como percentagem cumulativa de liberação de fármaco em relação ao tempo de registro.
Figura 9 – Esquema do estudo de cinética de liberação in vitro da triancinolona a partir dos sistemas particulados de quitosana.
Fonte: Dados da pesquisa.
5.2.6 Intumescimento
A capacidade de intumescimento dos sistemas particulados (SP), do placebo seco por spray drying (PSS) e do placebo feito por mistura física (PMF) foram avaliadas pela capacidade de entrada de água por osmose em uma quantidade de amostra (0,093 g) inserida dentro de uma membrana de diálise (cut- off = 14,000). O placebo feito através da mistura física utilizou apenas a homogeneização dos polímeros em gral e pistilo, sem o fármaco.
No ensaio especificado a membrana de 25 mm (Sigma-aldrich, São Paulo) contendo as partículas foi submersa dentro de uma proveta contendo 20 mL de meio. O meio escolhido foi tampão fosfato pH
dias (T24h) e 3 dias (T48h), o sistema foi retirado e pesado em balança analítica (Radwag, modelo AS 220/C/2, Brasil) após secagem em papel absorvente. As medidas foram realizadas em triplicata e representadas em porcentagem relativa em relação ao peso do sistema no tempo inicial (sem intumescimento) e expressas como média ± desvio padrão.
5.2.7 Estudo in vivo
O estudo in vivo foi feito em colaboração com um outro grupo de pesquisa, do departamento de morfologia da UFRN, o qual avaliou a atividade dos sistemas particulados com triancinolona (SP) na razão polímero/polímero 50:50 com triancinolona 1:10 utilizando um modelo experimental de inflamação aguda, a colite ulcerativa. O experimento teve duração de oito dias e possibilitou a observação in vivo de parâmetros relacionados à atividade farmacológica dos tratamentos correlacionando-os com a farmacocinética e efeitos adversos. Neste estudo, foram utilizados 42 ratos machos Wistar divididos em seis grupos: Controle Negativo, Colite (Controle Positivo), Sufassalazina (SSZ) 500mg, Triancinolona 15mg (TRI), Sistema particulado 15mg (SP) e Placebo mistura física (PMF). Para indução da colite aguda foi utilizado o método proposto por MacPherson e Pfeiffer (1978), e modificado por Millar et al (1996).
A análise estatística foi realizada com o auxílio do Software BioEstat versão 5.3, que permitiu analisar os dados possibilitando transformar as informações obtidas em números que geram a interpretação. Para criação e análise dos gráficos foi utilizado o Software GraphPad Prism versão 5, que possibilitou a interpretação visual das análises. Na avaliação dos critérios de normalidade dos dados obtidos, foi realizado o teste Shapiro-wilk. Seguindo critérios de normalidade e homocedasticidade, as diferenças entre as médias dos grupos foram avaliadas pelo teste de análise de variância (ANOVA One Way), seguida do pós-teste Tukey. Em todos os testes foi considerado o grau de significância de 5% (P<0,05).
6.1 PREPARAÇÃO DOS SISTEMAS POLIMÉRICOS
6.1.1 Quitosana e Goma Guar (QUIT-GG)
Os parâmetros do equipamento spray drying influenciam nas características dos sistemas particulados de quitosana e goma guar com TRI, tais como a temperatura de entrada, o blower e a quantidade de calor, de modo a controlar a eficiência térmica da secagem, alterando o rendimento (HE; DAVIS; ILLUM, 1999).
Estudos preliminares foram realizados com os sistemas particulados poliméricos de quitosana e goma guar na razão percentual 50:50 p/p (nas concentrações de 0,25% e 0,25%) secas no spray drying, com a temperatura de entrada 120° e a de saída 70°, porém essas formaram um pó muito úmido, amarelado, com alguns grumos e ao microscópio óptico observou-se uma forma bastante irregular.
Para formar um pó seco aumentou-se a temperatura de entrada para 140° e a de saída para 90°, corroborando com um estudo feito por Nascimento (2015), o qual usou esses parâmetros para obtenção de micropartículas formada apenas por quitosana apresentando um rendimento razoavelmente satisfatório com valores 56,49 ± 0,06% e para as amostras compostas por quitosana e o fármaco propranolol (2:1) rendeu 57,29 ± 0,06%. Com base nesse estudo, foi preparada uma amostra com 1% de cada polímero, porém a mesma ficou extremamente viscosa, devido ao grande aumento da massa de cada componente, dessa forma impossibilitando a secagem no spray drying, devido uma possível obstrução no bico de aspersão.
Então, foram preparadas amostras poliméricas quitosana:goma guar 50:50 p/p (nas concentrações 0,5% e 0,5%) para serem secas com e sem triancinolona, estas formaram um pó fino, com aspecto heterogêneo, ao microscópio óptico apresentou uma morfologia esférica, com rendimento de 30% e 60%, respectivamente. Ou seja, quando ocorre a secagem com fármaco este causa algum tipo de interação o qual o rendimento diminui.
6.2 RENDIMENTO
Sistemas particulados com diferentes razões percentuais de quitosana:goma guar (25:75, 50:50 e 75:25) alterando a quantidade de triancinolona (1:5, 1:10 e 1:20) foram avaliadas, a tabela 1 mostra os rendimentos dos sistemas particulados com diferentes razões polímero/polímero e fármaco/polímero.
Tabela 2 - Rendimento dos sistemas particulados de QUIT/GG com diferentes razões de fármaco/polímero e polímero/polímero Razão fármaco:polímero TR:(QUIT/GG) Rendimento ± DP (%) Razão polímero:polímero QUIT:GG 25:75 50:50 75:25 1:5 11,35 ± 3,95 19,36 ± 4,77 20,88 ± 0,45 1:10 8,31 21,44 ± 4,79 23,49 ± 3,68 1:20 --- 20,66 ---
Fonte: Dados da pesquisa.
6.2.1 Diferentes razões poliméricas QUIT/GG (25:75, 50:50 e 75:25) com TRI (1:5)
As razões poliméricas de quitosana e goma guar (75:25 p/p) foram secas por spray drying apresentando um rendimento de 20,88 ± 0,45. A proporção de QUIT/GG (50:50 p/p) rendeu 19,36 ± 4,77 %. E por fim, as QUIT/GG (25:75 p/p) renderam 11,35 ± 3,95 %.
As amostras com maior quantidade de goma guar apresentam um menor rendimento, visto que após as 24h de agitação, a goma forma um precipitado na hélice do agitador mecânico, havendo perda de amostra antes da secagem, além disso essas amostras são mais viscosas e causam mais problemas no processo de secagem, causando recorrentes obstruções da cânula do bico de aspersão do equipamento spray drying.
Devido a sua estrutura molecular pouco ramificada, a goma guar tem a propriedade de formar soluções bastante viscosas, uma vez que a proporção de galactopiranose da molécula ligada à cadeia principal dificulta a aproximação das moléculas de polissacarídeos, evitando que se agreguem e tornando, desse modo, as soluções bastante estáveis (BOBBIO; BOBBIO, 1992).
As razões poliméricas (75:25 e 50:50 p/p) de QUIT/GG com TRI (1:5 p/p) apresentaram valores de rendimentos bem próximos, não havendo uma diferença significativa. Contudo, ao realizar análise no microscópio óptico as amostras com a razão 50:50 p/p formaram partículas com melhores aspectos, porém na razão de triancinolona (1:5 p/p) ficou muito fármaco livre, podendo interferir na liberação controlada pretendida pelo sistema.
6.2.2 Diferentes razões poliméricas QUIT/GG (25:75, 50:50 e 75:25) com TRI (1:10)
Os sistemas particulados com diferentes proporções (25:75, 50:50 e 75:25 p/p) com triancinolona (1:10 p/p) foram feitos de maneira que as amostras apresentaram rendimentos 8,31%, 21,44 ± 4,79%, e 23,49 ± 3,68%, respectivamente.
Esses resultados corroboram com um estudo feito por Santos e colaboradores (2003), onde os rendimentos dos sistemas particulados formados apenas por quitosana variaram de 16,21 a 44,71%.
próximo a proporção 50:50 p/p, sendo esta última a razão escolhida devido seu valor satisfatório de rendimento, e por formarem partículas com melhores aspectos macroscópicos, mais arredondadas e com uma quantidade razoável de fármaco livre suficiente para o efeito inicial.
Com a proporção de TRI (1:10) p/p esses sistemas particulados exibiram uma quantidade de triancinolona livre. Esse fármaco disperso no meio é algo importante devido ao efeito burst no qual ocorre liberação do glicocorticoide para início da sua ação terapêutica e posteriormente a liberação prolongada. Com isso, foi escolhida a proporção de razão polimérica (50:50) para o teste in vivo com triancinolona (1:10).
6.2.3 Sistema polimérico (50:50) com razão fármaco/polímero (1:20)
Após realizar as análises e chegar a razão polimérica ideal (50:50) p/p, esta foi preparada com proporção de triancinolona (1:20), apresentando um rendimento de 20,66%, ao analisar no microscópio óptico praticamente não havia triancinolona livre, sendo essa quantidade livre importante para o início de ação do fármaco.
6.3 CURVA PADRÃO DA TRIANCINOLONA
Para a quantificação da triancinolona nos sistemas particulados poliméricos foi necessária a preparação de uma curva padrão.
Foi construída uma curva padrão a partir de soluções de triancinolona nas concentrações de 4, 8, 12, 16 e 20 µg/mL em etanol.
A tabela 2 apresenta os valores de absorbância e concentração μg/mL em 242 nm obtidos para cada concentração da curva padrão.
Tabela 3: Valores de área absoluta e concentração obtidos para a curva padrão da triancinolona por espectrofotômetro. Concentração Teórica (μg/mL) Absorbância Média ± DP DPR Concentração (μg/mL) 4 0,129 ± 0,01 7,39 3,76 8 0,278 ± 0,004 1,30 7,71 12 0,439 ± 0,009 2,10 11,98 16 0,591 ± 0,010 1,74 15,99 20 0,748 ± 0,019 2,55 20,15 *DP- Desvio padrão
*DPR- Desvio padrão relativo
A curva padrão para o método foi construída a partir de cinco concentrações e está representada na figura 10 juntamente com a equação da reta e o coeficiente de correlação (R2).
