Coleta, avaliação e diluição do sêmen 1 Experimento

No documento Diferentes aspectos da fecundidade do sêmen de jumentos e da gestação de éguas submetidas à cruzamentos inter-espécie (páginas 133-136)

FICHAS DE CONTROLE

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.7. Coleta, avaliação e diluição do sêmen 1 Experimento

As coletas de sêmen foram realizadas utilizando-se uma fêmea no cio, devidamente imobilizada em tronco de contenção (figura 4e), localizado em um curral coberto por telha de cerâmica (figura 4c). O tronco era utilizado na fazenda para a realização de montas naturais envolvendo jumentos e éguas, possuindo, portanto, adaptações, como uma rampa de alvenaria, de modo a permitir o posicionamento do jumento em uma altura superior à da égua

(figura 4d), o que facilitava a monta e a coleta do sêmen.

Para a coleta do sêmen, utilizou-se uma vagina artificial modelo Hannover (figura 4f). No interior da vagina utilizou-se uma luva de palpação transretal cortada em sua extremidade (mão), de forma a evitar qualquer contato do sêmen com a mucosa de látex. Na extremidade posterior da vagina era fixada uma mamadeira com tampa larga vazada. No interior da mesma, colocava-se um saquinho plástico estéril (mamadeira descartável de bebê19) graduado, com capacidade de 250 ml. Na tampa da mamadeira acoplava-se um filtro descartável de colheita de sêmen suíno, utilizado para reter a fração gelatinosa do sêmen. Para a coleta, a vagina artificial era preenchida com água à temperatura de 50°C de forma que seu interior atingisse a temperatura de 42°C. Em seguida, era feita lubrificação do interior da vagina com gel a base de água20, utilizando-se para isso um bastão de vidro com 5,0 cm de diâmetro para, dessa maneira, espalhar o gel de forma homogênea e retirar o excesso de água do interior da vagina artificial.

Após a coleta, no laboratório, a mamadeira plástica contendo o sêmen era separada e colocada imediatamente em banho-maria a 37°C, para que se fizesse a avaliação das características físicas do sêmen (coloração, aspecto e volume sem a fração gel).

Para o cálculo da concentração espermática, um volume de 50µl de sêmen era retirado e diluído em 5 ml de solução formol salina tamponada (1:100). Essa solução era homogeneizada e a câmara de Neubauer preenchida. Antes de iniciar a contagem dos espermatozoides, a câmara permanecia por 5 minutos em repouso. Neste intervalo de tempo realizava-se avaliação da motilidade total (%) e do vigor (0-5) ao microscópio óptico, com aumento de 100 a 400 vezes. Para isso uma gota de sêmen fresco era

19 Playtex, Parents Choice – Bottle Liners 20 KY gel lubrificante – Johnson & Johnson

depositada em lâmina previamente aquecida a 37°C em mesa aquecedora, e coberta por uma lamínula na mesma condição. O cálculo do número de células espermáticas era feito a partir da contagem de espermatozoides, nos dois lados da câmara de Neubauer, em microscopia óptica com aumento de 400 vezes. O procedimento era refeito no caso de diferença superior a 10% nas duas contagens. O valor médio das duas contagens era multiplicado por 5 x 106 , para obter-se o número de espermatozoides/ml do ejaculado.

Todos os dados eram anotados em fichas próprias, nas quais eram feitos os cálculos para se determinar o volume da dose inseminante, com concentração fixa de 400 x 106 espermatozoides móveis (Anexo 3). Com pipeta de vidro graduada era realizada a diluição com o volume de sêmen calculado para as doses. Após a diluição eram avaliados a motilidade total (%) e o vigor espermático (0-5). O tempo gasto até o momento da diluição também era registrado nas fichas de cada animal.

Amostras de sêmen a fresco eram retiradas e colocadas em tubos ependorffs contendo solução de formol salina tamponada para posterior avaliação da morfologia espermática.

As doses preparadas para o experimento IIa eram utilizadas imediatamente para as inseminações. No experimento IIb, o sêmen era resfriado e estocado a 5°C em contêiner especial (Palhares, 1997), para ser utilizado após 12 horas de armazenamento.

4.7.2. Experimento III

As coletas eram realizadas utilizando-se manequim artificial proposto por Valle (1997), medindo 1,4 m de altura, em área isolada, protegido por cerca de madeira, ao ar livre (figura 7b). Para estimular os reprodutores, uma jumenta era posicionada próxima ao manequim, e no momento do salto, com auxílio de cabresto, o jumento era

desviado para a posição anterior do mesmo. Todos os animais montaram o manequim já no primeiro dia de coleta.

Em dias de chuva, as coletas eram realizadas utilizando-se uma fêmea imobilizada em tronco de contenção, em local coberto e fechado (figura 7a).

Para a coleta do sêmen foi utilizada vagina artificial modelo aberta, adaptada de Tischner et al. (1975), constituída de um cilindro de borracha, com 28 cm de comprimento e 14 cm de diâmetro (figura 5d). O menor tamanho deste tipo de vagina em relação aos modelos utilizados para coleta total do sêmen, permite a exposição da glande do pênis, facilitando a visualização e contagem dos jatos do ejaculado (coleta fracionada). No interior da vagina era introduzida uma mucosa de látex21 com 77 cm de comprimento e 17 cm de largura, e cobrindo-a, um saco plástico descartável22 com medidas de 30x50x0,005 cm, cortado na extremidade fechada de modo a impedir o contato do sêmen com a mucosa de látex. O saco plástico era preso à vagina por meio de tiras de borracha. Após a montagem da vagina artificial preenchia-se seu interior com água aquecida a 50°C, após o que lubrificava-se a mesma com vaselina23.

Para a recepção do sêmen, utilizou-se um copo plástico24 com alça, com capacidade de 2l, revestido com papel pardo (figura 5e), de forma a impedir que o sêmen fosse exposto diretamente à luminosidade. Em seu interior era introduzido um saco plástico descartável22, 25x35x0,005 cm. A extremidade aberta do copo coletor era tampada com papel toalha, fixado com uma tira de borracha, de forma a evitar a contaminação do ambiente até o momento da coleta.

21 Icelvet®

22 Martplas® 23 Sulfal Química Ltda 24 Plasutil®

As coletas eram realizadas em dias fixos, aos domingos, terças e quintas-feiras, sempre após as 14 horas. Eram necessárias duas pessoas para a realização da coleta fracionada, de modo que uma segurava e conduzia a vagina artificial e outra recepcionava o sêmen no copo coletor (figuras 7a e 7b). No momento em que ocorria a dilatação da glande do pênis do reprodutor, a pessoa responsável pelo copo coletor aproximava-se e posicionava o copo à frente da glande, sem encostar na mesma. A fração pré-espermática era descartada, sendo os três primeiros jatos do ejaculado coletados. A identificação de cada jato era feita acompanhando-se as pulsações uretrais e também visualmente. Após o terceiro jato, todo o restante do ejaculado era desprezado, caindo diretamente no chão.

O copo coletor era então coberto com papel toalha até sua chegada ao laboratório, onde o saco plástico contendo o sêmen era imediatamente colocado em banho-maria a 37°C. A hora da coleta era anotada no momento em que se chegava ao laboratório. Enquanto uma pessoa coletava uma amostra de sêmen para avaliação física (motilidade total e vigor), outra mensurava o volume de sêmen coletado utilizando-se uma proveta graduada de vidro. A seguir, 20µl de sêmen eram retirados com uma pipeta de volume fixo, e diluídos em 8 ml de solução formol salina tamponada (1:400), para o cálculo da concentração espermática (figura 5a). Amostras para morfologia eram retiradas, acondicionando-se o sêmen com a solução formol salina tamponada em tubos ependorffs, armazenados em caixas de papel dentro da geladeira.

No experimento IIIa, o volume total de sêmen era dividido em duas mamadeiras estéreis, sendo feita rapidamente uma pré- diluição na proporção de 1:1, ou seja, uma parte de sêmen para uma parte de diluidor lactose-gema de ovo ou de leite em pó desnatado-glicose, de acordo com o tratamento considerado.

O intervalo da coleta do sêmen à primeira diluição era anotado na ficha de coleta. Nova avaliação física do sêmen era realizada após a diluição, anotando-se este dado na ficha de coleta (Anexo 5).

Para o cálculo da concentração espermática, a câmara de Neubauer era preenchida com a solução preparada de sêmen e formol salina. O preenchimento era feito por meio de um capilar de vidro. A câmara permanecia em repouso por cinco minutos, sobre o microscópio óptico. Durante este intervalo realizava-se avaliação física do sêmen, depositando uma gota do mesmo sobre uma lâmina mantida aquecida sobre placa aquecedora a 37°C (figura 5f), coberta com uma lamínula na mesma condição. Para a avaliação utilizou-se microscópio óptico com aumento de 100 e 400X, expressando a motilidade em percentual de células móveis por campo (0 a 100%). O vigor espermático era avaliado utilizando-se uma escala de 0 a 5, recebendo 0 as células imóveis e 5 as que apresentavam grande rapidez de movimentação.

Após os cinco minutos de repouso, a concentração espermática era calculada pela contagem do número de espermatozoides nos dois lados da câmara de Neubauer, por microscopia óptica com aumento de 400X. No caso de diferença superior a 10% nas duas contagens, uma nova câmara de Neubauer era montada, e o procedimento refeito.

O valor médio das duas contagens era multiplicado por 20 x 106, obtendo-se o número de espermatozoides/ml do ejaculado.

4.8. Preparo das doses inseminantes e

No documento Diferentes aspectos da fecundidade do sêmen de jumentos e da gestação de éguas submetidas à cruzamentos inter-espécie (páginas 133-136)