Conceito dos Profissionais de Saúde acerca do Consentimento Informado

1.1. Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)

Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton ont été relevés sur les appareils BRUKER CRYOSPEC W 250 MHz, BRUKER AM 360 MHz et VARIAN UNITY 600 MHz. Les déplacements chimiques sont mesurés en ppm par rapport au tétraméthylsilane (TMS) utilisé comme référence interne.

1.2. Spectrométrie de masse électrospray (ESMS)

Les spectres ESMS ont été effectués dans le laboratoire du Pr. A. van Dorsselaer, Université L. Pasteur, Strasbourg. Les tensions des cônes d'extraction valent 65 V et 80 V. Le complexe sous forme de sel de chlorure sont dissous avant injection dans un mélange MeCN/H20 50/50.

1.3. Spectroscopie d'absorption et spectrométrie d'émission atomique

Les spectres d'absorption ont été relevés sur le spectrophotomètre UV/Visible Diode array HP.8452A. Les données sont transférées sur un ordinateur PC-compatible à partir duquel elles sont traitées. Certaines mesures ont été effectuées sur un spectrophotomètre "Cary 219" de Varian.

Les coefficients d'absorption molaire sont déterminés par dosage du Ruthénium au moyen de la technique de spectrométrie d'émission à torche de plasma. Ce dosage est effectué sur un appareil SPECTRAMETRIC SPECTROSPAN IV par comparaison des intensités d'émission du Ruthénium (A. = 732,8 nm) des échantillons inconnus avec celle d'une référence. Donc, 8^ = 8a (A^ Ia)/(Aa I,) où a = [RuCBPYjj]'" et 8a = £452nm = ^40 xl04 M-lcm-l.t5H

1.4. Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

A l'Université de Grenoble, la colonne analytique utilisée par le Dr. M. Demeunynck, au laboratoire du Prof. J. Lhomme, est une Bondapak Cl8, Millipore Waters. L'élution est réalisée par un gradient de concentration méthanol/eau de 0 à 100% à un pH de 2,5 (H3PO4). La détection se fait par spectroscopie d'absortion de 220 à 500 nm.

-Pour purifier les complexes de manière préparative, nous avons utilisé des colonnes semi- préparatives échangeuses de cations (Waters, groupe de J. M. Kelly (Trinity College) et H. Vos (UCD), Dublin, Irlande), avec un éluant composé d'un mélange MeCN:H20 80:20 et de KNO3 0,16 à 0,2 M.

1.5. Spectroscopie d'émission

Les spectres d'émission sont obtenus grâce à l'appareillage Edinburgh FS900CDT (1995). La source d'excitation est constituée d'une lampe au Xénon de 450W (1), le photomultiplicateur de détection sensible dans le rouge (200-870 nm) est un Hamamatsu R955 refroidi à -33°C par effet Peltier. Le monochromateur de la source d'excitation (2) possède 300 mm de distance focale et est utilisable sur une plage de 200-900 nm avec des fentes à réglage micrométrique engendrant une fenêtre spectrale de 1,8 nm/mm (pour le monochromateur de l'ensemble de détection (5): de 300 à 1350 nm; 2,6 nm/mm; rendement optimisé autour de 700-750 nm; un filtre (3) supplémentaire est utilisé). Les paramètres et les données sont contrôlées et traitées par le programme Edinburgh FS900CDT sur un ordinateur PC-compatible.

Figure II.1.: Représentation schématique d'un spectrofluorimètre: (1): lampe au Xénon en régime continu; (2) et (5) monochromateurs; (3) porte-cellule (thermostatisé sur l'appareil Edinburgh, possibilité d'agitation magnétique); (4) filtre; (PM) photomultiplicateur sensible dans le rouge (refroidi à -33°C sur l'appareil Edinburgh); (PC) ordinateur.

Certains spectres d'émission sont obtenus grâce à un spectrofluorimètre 'Shimadzu RF-5001 PC. La source d'excitation est constituée d'une lampe au Xénon, le photomultiplicateur sensible dans le rouge pour la détection est un Hamamatsu R928. Les paramètres et les données sont contrôlées et traitées par un ordinateur PC-compatible.

-Pour les deux spectrofluorimètres, la courbe de correction des spectres d'émission est obtenue par mesure du spectre d'une lampe calibrée (Edinburgh, 10 W, tungstène-halogène, 200-2600 nm).

1.6. Photolyse éclair laser

Les mesures en photolyse éclair laser ont été effectuées au moyen du dispositif expérimental représenté dans la figure suivante;

Figure H.2.: (1) laser; (2) porte-cellule; (3) lentilles; (4) filtre; (5) monochromateur; (6) photomultiplicateur sensible dans le rouge; (7) oscilloscope; (8) ordinateur; (9) lampe au Xénon en régime continu; (10) opturateur mécanique.

La source excitatrice (1) est un laser Néodinium YAG (Continuum NY 61-10) dont la longueur d'onde fondamentale (1064 nm, 650 mJ) peut être modifiée après passage dans un doubleur de fréquence suivi ou non d'un mixeur de fréquence, afin d'obtenir respectivement les longueur d'onde de 532 (340 mJ) et 355 nm (170 mJ). Le faisceau à 532 nm peut être focalisé dans un laser à colorant (Continuum ND60) qui, grâce au colorant choisi (4-dicyanométhylène- 2-méthyl-6-(p-diméthylaminostyryl)-4H-pyrane: DCM), permet d'obtenir un faisceau de longueur d'onde de 640 nm (66 mJ). Une dernière option (Continuum UVX) permet de mixer la partie résiduelle du rayonnement infra-rouge avec le faisceau à 640 nm. Le faisceau résultant a une longueur d'onde de 400 nm et une puissance de 27 mJ.

-Le faisceau analytique, émis par une lampe au Xénon 300 W (Osram Xm-300-5-H5) (9) faisant partie de l'appareillage APPLIED PHOTOPHYSICS "Laser Kinetic Spectrometer", est focalisé (3) sur la cellule (2) (2x10 mm ou 10x10 mm en quartz) contenant l'échantillon. Un opturateur mécanique (10) contrôlé manuellement via un boitier est placé à la sortie de la lampe. Le faisceau analytique transmis par l'échantillon est focalisé sur la fente d'entrée d'un monochromateur (5) (Applied Photophysics) dont le réseau est entraîné par un moteur pas à pas, contrôlé par l'ordinateur (8) (via un interface "HP-IB, IEEE.488"). Un photomultiplicateur (6) (Hamamatsu R928) permet la mesure de l'intensité lumineuse à la longueur d'onde d'analyse. L'utilisation de filtres (4) permet d'éliminer partiellement les perturbations dues au laser. Le signal est enregistré au cours du temps par un oscilloscope (7) (HP 54200A), déclenché de manière synchrone par le laser. Après accumulation de 4 ou 16 signaux, le signal moyenné est transmis à l'ordinateur (HP 9816S).

Nous avons mis au point un nouveau programme de transfert de données de l'oscilloscope (HP 54200A) vers un PC. Celui-ci permet de sauver les données sous format ASCII, contrairement à l'ordinateur de vielle génération HP 9816S.

7.7. Mesures de durées de vie de luminescence

1.7.1. Par excitation laser

Certaines mesures de durées de vie de luminescence de complexes en solution organique sont réalisées avec la même source excitatrice et le même système de détection que pour les mesures de photolyse éclair laser. La luminescence est mesurée perpenticulairement au faisceau excitateur par l'ensemble (1-8): monochromateur, photomultiplicateur, oscilloscope. Les cinétiques obtenues sont traitées par ordinateur (HP 9816S).

Avec le nouveau programme de transfert de données, les données peuvent être sauvées sous format Edinburgh, et peuvent ainsi être traitées par le même programme que les données SPC.

1.7.2. Par Single Photon Counting résolu dans le temps (TC-SPC)

L'appareillage de Single Photon Counting (Figure 1.3.) (Edinburgh FL900CDT) met en commun de nombreuses composantes avec le fluorimètre décrit précédemment (FS900CDT, (Figure LL). Il est constitué d'une lampe excitatrice à arc (nF900) (1), d'un ensemble optique comprenant deux monochromateurs (2, 5) et un compartiment à échantillon (3), de deux photomultiplicateurs de détection (PM START et STOP) et d'un contrôleur électronique (CD900). Celui-ci contient essentiellement un "trigger" pour la lampe, des discriminateurs, un

-convertisseur temps-amplitude (TAC), un digitaliseur, un analyseur multicanaux (MCA) et un ordinateur PC-compatible.

TAC

Figure II.3.: Représentation schématique du SPC; (I); lampe à arc pulsée; (2) et (5) monochromateurs; (3) porte- cellule thermostatisé avec possibilité d'agitation magnétique et d'apport d'Argon; (4) filtre; (STOP PM) photomultiplicateur sensible dans le rouge (refroidi à -33°C); (START PM) photomultiplicateur; (TAC) convertisseur temps-amplitude; (MCA) analyseur multi-canaux; (PC) ordinateur. (Ne sont pas représentés les discriminateurs placés entre les PM et le TAC, ainsi que le digitaliseur placé entre le TAC et le MCA).

Le principe de la détermination de durées de vie par SPC peut se résumer comme suit;l^’^^l L'éclair d'une lampe à arc pulsée est filtré grâce à un monochromateur et est envoyée sur l'échantillon. Cette même impulsion lumineuse est directement détectée par le photomultiplicateur START, ce qui déclenche une rampe de potentiel électronique dans le TAC (Time to Amplitude Converter). La lumière émise par l'échantillon est filtrée de façon à ce qu'un seul et unique photon au maximum atteigne le photomultiplicateur STOP. Le photon détecté arrête ainsi la rampe du TAC. Le potentiel obtenu est digitalisé (résolution typique de 511 à 4095 valeurs = canaux) et une unité (= un coup) est ajoutée dans le canal du MCA (MultiChannel Analyser) correspondant à ce potentiel. Cette expérience est répétée un grand nombre de fois (typiquement 10^-10^ x) et le MCA additionne et rassemble le nombre de fois qu'un photon a été détecté après un certain potentiel, donc un certain temps. Si cette expérience de "chronométrage" est répétée un nombre de fois statistiquement suffisant, il a été montré que les valeurs du MCA correspondent aux probabilités de détecter un photon dans un interval de temps t ± ôt. Ceci équivaut à établir une courbe identique à celle de l'intensité d'émission en fonction du temps. L'analyse de celle-ci est effectuée par la procédure habituelle, en tenant compte de la distribution de Poisson de l'erreur pour chaque point.

-Mise au point des conditions expérimentales

La lampe excitatrice peut être remplie de différents gaz (0,2 à 2 atm) et peut fonctionner à des fréquences de 20 à 40 kHz. A la livraison, l'ensemble résistance-capacités est optimisé pour obtenir des impulsions courtes et reproductibles. Ces conditions "d'usine" ne nous convenaient pas, puisque les intensités n'étaient pas assez élevées et le profil temporel présentait une émission d'espèces gazeuses à longue durée de vie (=post-combustion) qui rend l'analyse des déclins difficile (voir Figure II.4.). Nous avons donc optimisé la lampe, essentiellement afin d'obtenir des intensités totales plus élevées et d'adapter la post-combustion à nos besoins. Les meilleurs résultats d'analyse sont obtenus avec une post-combustion faible et à profil exponentiel. Ces intensités et profils ont été obtenues au détriment de la brièveté du puise, puisque nous avons dii enlever la résistance de "gap" de 5(X) Q.

Le Tableau suivant rassemble les conditions de lampe les plus intéressantes:

Gaz Pression Tension Fréquence (atm) (kV) (kHz) Gap (mm) Résistance FWHM Intensité (^) (ns) post- ^ combustion Longévité (jours) H2 0,40 6,8 40 1,0 500 1,3 faible exp. b 4-5 N2 1,30 5,2 30 0,3 500 _1,1 + non exp. ^ 1 air 0,60 6,0 25 0,7 500 2,5 + exp. _% N2 0,40 4,9 30-35 1,3 0 8 +-1-1- exp. c 1 air 0,25 6,8 35 1,0 0 3,5 ■f+ exp. _V2

a; exp. = profil temporel quasi-exponentiel.; b: conditions idéales pour la mesure de durées de vie courtes, c: conditions utilisées dans la majorité des expériences présentées dans notre thèse.

La lampe à H2 émet avec un spectre continu UV-Vis sur une gamme de longueur d'ondes décroissante en intensité jusqu'à =450 nm. Les raies d'émission les plus bathochromes des lampes à N2 ou à air se trouvent à 337 nm (la plus intense), 359 nm et 379 nm (la moins intense, profil temporel légèrement différent des deux raies précédentes). Le profil de la lampe à air change avec le temps suite à la production d'oxydes émettant également avec des durées de vie plus élevées. Ceci conduit à des problèmes au niveau de l'analyse des données après quelques heures (5 à 6 h.) d'utilisation. Les électrodes se dégradent également très rapidement sous ces conditions, avec la formation de dépôts d'oxydes.

En règle générale, nous pouvons retenir que:

- des intensités plus élevées sont obtenues en enlevant la résistance de "gap", en augmentant l'écartement des électrodes ("gap") et la tension entre les électrodes et en diminuant la pression en gaz (N2 majoritaire);

-- la queue d'émission du N2 peut être limitée par l'utilisation d'une tension plus faible, d'un "quencheur" (c'est-à-dire l'02 dans l'air, éventuellement de l'Ar) ou par du self-quenching (pressions de N2 plus élevées).

Un bon compromis doit évidemment être recherché. Il faut également noter que les conditions utilisées rendent la lampe moins stable que celle optimisée en "usine". Ces conditions sont donc évidemment à éviter pour la détermination de durées de vie dans des échelles de temps très courtes.

Notons que l'intensité totale intégrée sur un laps de temps augmente avec la fréquence des décharges, mais pas directement proportionnellement, puisque l'intensité d'un puise est plus élevée à des fréquences plus basses. Ajoutons également que la fréquence maximale doit être inférieure à l'inverse de l'échelle de temps utilisée, et à l'inverse du temps de "reset" électronique qui est proportionnel au nombre de canaux. Dans la majorité de nos expériences (échelle de 20 ps, 4095 canaux), nous avons constaté que le "reset" ne pouvait pas être complet en excitant à 40 kHz (Figure H.4.), alors que c'est le cas si la fréquence est de 30 kHz. Aucun problème n'est constaté si 2047 et 1023 canaux sont utilisés avec une fréquence de 40 kHz.

t(ns)

0 1 2 3 4 5 6 7

t(ps)

Figure II.4.: (à gauche): Profil de lampe illustrant un cas où le reset électronique n'est pas complet. Conditions: lampe pulsée à 40 kHz, échelle de temps de 20 fis (4096 canaux). Encadré: agrandissement autour du maximum du signal. Un seul pic est observé pour une fréquence de la lampe pulsée à 30 kHz. (à droite): Illustration des problèmes rencontrés avec une lampe présentant une post-combustion trop importante et non exponentielle. L: IRF(t); D: déclin du [Ru(BPY)2Phen]^'^ dans l'eau; F: fitting monoexponentiel rejeté, (intensité en échelle logarithmique)

-L'acquistion de l'émission de l'échantillon est effectuée en respectant un rapport STOP/START < 2 % (typiquement 200-800 coups par seconde (cps)), limite généralement admise dans la littérature pour respecter les conditions de détection d'un seul photon par expérience. L'équilibrage de l'électronique et du photomultiplicateur sous tension à -33°C pendant une nuit permet d'obtenir un bmit de fond de l'ordre de 5 cps. Le bruit de fond minimal après 2-3 jours est de 2,5 cps. (garantie d'usine: 100 cps !)

L'acquisition de la fonction de réponse de l'instrument (IRF; incluant le profil de la source excitatrice) est effectuée par scattering d'une solution de LUDOX®. La concentration est adaptée afin de ne pas devoir changer la fenêtre spectrale du faisceau pour rester dans les limites suivantes: rapport STOP/START < 2 %, nombre de cps au temps "0" du même ordre de grandeur que pour l'échantillon, temps d'acquisition le plus proche possible de celui de l'échantillon tout en gardant la ligne de base moyenne < 2-3 coups. Typiquement, les mesures sont faites avec ~ 50 cps pour le IRF et = 200-600 cps pour l'échantillon.

Analyse des données

Les méthodes d'analyse des données ont été décrites dans la littérature.

Nous avons utilisé les programmes fournis avec l'appareil (Edinburgh FL900CDT version 1.26).

(i) Pour l'analyse par mono- ou polyexponentielles, l'intensité d'émission en fonction du temps est décrite par l'expression:!'^^1

I(t) = /:

IRF(t') F(t - t') dt' + B E.II.l.

où: riRF(t) est la fonction de réponse de l'instrument, incluant le profil temporel de la source excitatrice. Le profil à excitation infiniment courte vaudrait: F(t) = Z aj e ‘

B est la ligne de base.

L'algorithme d'analyse se base sur une méthode de Marquart modifiée (moindres carrés), avec minimisation du paramètre (E.H.3.). Les critères pour l'acceptation d'un fitting sont en général les suivants: i) le plus proche possible de 1 (il est habituel d'accepter des valeurs < 1,35); ii) une distribution aléatoire des résidus pondérés (E.II.2) et des autocorrélations (E.II.4) autour de zéro; iii) l'addition d'une exponentielle supplémentaire à F(t) n'améliore pas les critères précités. Les limites des critères dépendent souvent du système étudié et de l'appareillage.

-*

Les paramètres sont définis comme suit: résidus pondérés:

_I(t)-Y(t)

où: I(t) est la mesure expérimentale et Y(t) la fonction ajustée. * paramètre "chi-carré":

= Z R(t)2

* autocorrélation (avec C(0) = 1):

C(At) = limj^o R(t)R(t-At) dt

E.II.2.

E.II.3.

E.II.4.

(ii) Le programme d'analyse par distribution de durées de vie est basé sur la résolution de l’équation de Fredholm:^^^^] si p = i/x;

rt 1*0®

I(t)=J^IRF(t-t')jQ a(r)e"^^'drdt' E.II.5.

L'algorithme minimise la valeur du tout en incluant une contrainte de minimisation de fénergie" E:

E[a(r)] = Ja2(Ddr E.II.6.

Comme précédemment, les critères d'évaluation de l'ajustement sont le les résidus pondérés et l'autocorrélation.

Le programme d'Edinbugh présente le défaut de ne pas tenir compte d'une ligne de base. Ceci peut conduire à des valeurs de élevées, et à une autocorrélation distribuée autour d'une valeur >0 (au lieu de 0). Néanmoins, l'estimation des durées de vie est en général peu affectée si le bruit de fond est faible, comme c'est le cas dans nos expériences (B = 5 coups).

La Figure 11.5. montre l'autocorrélation correspondant à l'expérience citée dans la partie résultats (Chapitre IV, Figure IV.6.). Le vaut 1,15.

-Figure II.5.: Autocorrélation de l'analyse par distribution de durées de vie du déclin d’émission du [Ru(TAP)2Phen]^+ en présence d'ADN de thymus de veau. L'analyse est présentée au Chapitre IV (Figure IV.6.).

Le programme d'analyse a été testé avec des déclins générées par calcul. Ceux-ci ont été obtenues à partir des fonctions analytiques suivantes;

L'IRF utilisé pour les calculs correspond à une fonction triexponentielle décrivant une mesure expérimentale typique. Le signal simulant l'intensité d'émission en fonction du temps est obtenu par l'expression de convolution E.II.l.Un bruit poissonien est ensuite ajouté à chaque point.

Nous avons ainsi créé un déclin pentaexponentiel. La Figure II.6. montre l'analyse de ce déclin avec une distribution de durées de vie avec l'option "Haute Résolution". Les résidus pondérés et l'autocorrélation sont présentés avec le déclin. L'option "Optimale" ne restitue que deux durées de vie et a été rejetée pour la suite des études.

Les valeurs des durées de vie t (en ns) et des contributions à l'émission %x (en %) injectées dans le déclin généré par calcul sont les suivantes:

t(%x): 14 (2,5) 70 (6,7) 250(16,5) 650 (39,3) 1650(35,0) Les valeurs obtenues par le fîtting sont les suivantes:

x(%T-a): 14,5 (1,5-0,2) 64 (5,2-11) 196 (12,6-36) 598 (42,6-102) 1588 (38,3-151)

On peut constater une très bonne concordance entre les valeurs des durées de vie réelles injectées dans le calcul, et les valeurs obtenues par le fîtting.

-Figure II.6.: Déclin d'émission généré par calcul et analyse par distribution de durées de vie. A gauche: en haut: déclin, IRF et ajustement; en bas: résidus pondérés. A droite: en haut: amplitude en fonction du logarithme des durées de vie; en bas: autocorrélation.

Nous avons également créé un déclin, non plus avec des exponentielles discrètes, mais une distribution "continue" de durées de durées de vie dont les facteurs préexponentiels sont composés d'une somme de 5 gaussiennes. Celles-ci sont centrées autour des mêmes valeurs que dans l'exemple pentaexponentiel. Les valeurs de sigma imposées pour les gaussiennes des trois composantes les plus courtes ont été choisies de manière à obtenir une distribution large couvrant la gamme de =5 à =300 ns et valent respectivement 10, 100 et 100 ns. Pour représenter les deux durées de vie les plus longues en tant qu'exponentielles discrètes, un sigma de 10 ns a été choisi. (En pratique, nous représentons en fait la distribution continue par une somme de 4000 durées de vie uniformément séparées.) Le programme d'analyse restitue dans ce cas le même résultat (à 5% près) que si le déclin est constitué de 5 exponentielles discrètes. La distribution continue dans la gamme des durées de vie < 600 ns n'est donc pas détectée dans ce cas. Par contre, les résultats pour les deux exponentielles discrètes à longue durée de vie sont correctement restituées. Notons que si une distribution est constituée d'une seule gaussienne, celle-ci est par contre correctement restituée par le programme d'analyse.

2. EXPÉRIENCES D'INHIBITION DE TRANSCRIPTION IN VITRO

Le plasmide utilisé pour les expériences d'inhibition de transcription in vitro est le plasmide commercial pSV-SPORTl (Gibco-BRL)['^^l comportant une région de transcription et les signaux de démarrage et d'arrêt correspondants. L'ADN circulaire plasmidique a une longueur totale de 3160 paires de bases. Des quantités plus élevées de ce plasmide sont repréparées par culture bactérienne après clonage. Au préalable des expériences, il est linéarisé par l'enzyme de

-restriction Bsml (Gibco-BRL) qui le coupe au niveau d'un site de digestion unique. Ceci permet de rendre le plasmide plus accessible à l’enzyme de transcription par déroulement suite à la coupure, étant donné l'absence de protéines se chargeant de cette fonction dans le système in vitro utilisé ici, et d'obtenir un produit de transcription, c'est-à-dire un ARN messager, de longueur fixe au nucléotide près.

Les concentrations des composantes du système de transcription in vitro sont, au moment de l'illumination:

12,5 nanomolaire d'ADN plasmidique, 1,5 unités/microlitre d'ARN polymérase de bactériophage Sp6 (Gibco-BRL),l^^^l 0,5 unités/microlitre d'inhibiteur de ribonucléase (Gibco- BRL), de 48 millimolaire Tris-HCl pH 7,9, 7,2 millimolaire de MgClj, de 1,2 millimolaire dithiothréitol, de 2,4 millimolaire spermidine et des concentrations variables de complexe (voir "Résultats") dans un volume total de 10 microlitre.

Le pH (stabilisé par le tampon Tris-HCl), les concentrations en sel (les ions Mg^^ sont indispensables à la fixation d'une polymérase à sa cible d'ADN) et en stabilisateurs d'enzyme (dithiothréitol pour les ponts disulfure, spermidine bloquant des protéases contaminantes éventuelles) sont cruciaux pour une activité optimale d'une enzyme, donc aussi de la Sp6 ARN polymérase. L'inhibiteur de ribonucléases est toujours ajouté à cause du danger de contamination par ces enzymes omniprésentes, qui dégraderaient l'ARN messager produit très rapidement. L'eau bi-distillée utilisée pour dissoudre ces composantes et pour compléter le milieu au volume final est traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC) pour inhiber ces ribonucléases éventuelles et autoclavé pour stérilisation complète.

Le milieu final est constitué en ajoutant et mélangeant les différents composants à partir de solutions-stock qui sont maintenues au froid (dans un bain de glace) (pour l'enzyme et les nucléotides thermo-dégradables) respectivement à l'obscurité (pour le complexe photo- dégradable) jusqu'à ce moment. Il s'agissait des solutions- stock suivants: (i) plasmide -i- tampon -i- eau, (ii) complexe, (iii) Sp6 ARN polymérase -i- dithiothréitol + inhibiteur de ribonucléase.

Pour les différentes expériences, le milieu est recouvert de 10 microlitre d'huile minérale (Perkin-Elmer) pour éviter toute évaporation dûe à réchauffement lors de l'illumination. Ce milieu est exposé dans un tube Eppendorff de 0,5 millilitre fixé, avec le capuchon ouvert du côté de l'illumination, dans une position horizontale au rayon focalisé émise par une lampe à mercure haute pression de 150 Watt pendant des intervals de temps variables (voir "Résultats"). Sur le trajet optique du rayon est placé un filtre. Celui-ci est constitué d'un réservoir de 1,4 cm