Conclusão

A contaminação de fungos filamentosos em pães integrais multigrãos, e consequente perda econômica pelo aparecimento de micélios visíveis antes do final da vida de prateleira, tem como principais fontes de contaminação as matérias-primas e o ar do ambiente de processamento. A incorporação de ingredientes integrais à formulação dos pães deve incluir medidas de controle na seleção e estocagem de matérias-primas e o uso de formas diversas de tecnologia de barreiras. A maior parte das espécies fúngicas isoladas do ambiente de processamento foram isoladas também nas matérias-primas. Durante o tempo de exposição entre as etapas de resfriamento, fatiamento e embalagem, as superfícies dos pães estão expostas a uma variedade de fungos filamentosos, entre os quais, espécies deteriorantes como Paec. variotii, isolada tanto dos pães quanto do início ao fim da linha de produção. Semelhantemente, espécies deteriorantes e de importância para a estabilidade dos pães, como P. paneum e P. polonicum, foram isoladas tanto dos produtos finais quanto das matérias- primas. A prevenção da contaminação por esporos fúngicos na superfície de pães no pós processamento continua sendo um problema atual, e deve ser foco de estudos. Os resultados obtidos neste trabalho podem ser utilizados em estudos de seleção de espécies representativas na deterioração dos pães integrais para o desenvolvimento de modelos preditivos que visam o aumento da estabilidade microbiológica destes produtos e consequente redução de perdas na indústria de panificação.

Agradecimentos

Os autores agradecem o suporte financeiro da CAPES, CNPq e FAPESP.

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Figura 1. Frequência de ocorrência % (número de amostras positivas para espécie fúngica/número total de amostras analisadas) das espécies fúngicas isoladas em pães e também nas matérias-primas.

0 10 20 30 40 50 60 70 Pães Farinha de Trigo Int. Farinha de Milho Int. Grãos F re qu ência de o co rr ência ( F O )( %) Aspergillus sydowii Chrysonilia sitophila Paecilomyces variotii Penicillium paneum Penicillium polonicum Penicillium spinulosum Talaromyces mineuloteum

Figura 2. Valores médios (log UFC/m3) e respectivos desvios padrão da quantificação de fungos filamentosos do ar em diferentes pontos do processamento de pães integrais multigrão em diferentes dias de coleta. Letras iguais dentro de cada ponto de coleta indicam que não houve diferença significativa entre os dias de coleta, de acordo com teste tukey (ρ>0,05). Letras iguais entre diferentes pontos de coleta (total) indicam que não houve diferença significativa de acordo com teste t (ρ>0,05).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 Coleta 4 Total

L og UF C/m 3 Pesagem Masseira Pós forno Resfriamento Fatiamento Embalagem a b B a b a b a c a a a a b c a c b a a b a b ab a a a a a a a b b b b

Figura 3. Valores médios (log UFC/m3) e respectivos desvios padrão da quantificação de fungos filamentosos do ar de diferentes pontos da linha de processamento de pães integrais multigrão durante período da manhã e da tarde. *Ponto de coleta com diferença estatisticamente significativa entre os dois períodos, de acordo com teste Tukey (ρ>0,05).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 L og U F C /m 3 Manhã Tarde *

Figura 4. Espécies fúngicas isoladas dos pães integrais multigrãos e encontradas no ar da linha de produção e espécies mais isoladas do ar (Rhizopus sp., Aspergillus seção Nigri e A. flavus).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Núm er o de Is o la do s Penicillium spinulosum Penicillium citrinum Paecilomyces variotii Penicillium polonicum Chrysonilia sitophila Rhizopus sp.

Aspergillus seção Nigri Aspergillus flavus

Figura 5. Função densidade probabilidade do nível de contaminação fúngica estimada em pães integrais multigrão considerando diferentes pontos de coleta de ar do processamento.

Figura 6. Função densidade probabilidade do nível de contaminação fúngica estimada em pães integrais multigrão (log UFC/produto).

Tabela 1. Enumeração de fungos filamentosos e medidas de atividade de água em matérias-primas.

Amostras (N**) AW Lote 1* Lote 2* Lote 3* Lote 4*

(log UFC/g)* Farinha trigo int.(50) 0,503± 0,02 3,3A±0,77 3,0A ± 0,20 3,0A ± 0,14 3,2A± 0,44 3,1 ± 0,18b Açúcar mascavo (20) 0,629 ± 0,02 2,1A ± 0,30 2,0A ± 0,01 2,0A ± 0,01 2,0A ± 0,01 2,0 ± 0,04c Farinha milho int. (5) 0,530 ± 0,06 4,1C ± 0,23 5,0B 5,9A 4,4C 4,8 ± 0,70a Grãos (45) 0,526 ± 0,06 2,6A ± 0,68 2,8A ± 0,80 2,6A ± 0,50 3,0A± 0,46 2,7 ± 0,35b * Média (log UFC/g) e respectivo desvio padrão de amostras de diferentes lotes. Limite de detecção 2 log UFC/g. * Valores com a mesma letra indicam que não houve diferen a significativa (ρ>0,05) de acordo com o Teste de Tukey (A, B, C) e de acordo com Teste t (a, b e c). ** N: número de amostras analisadas.

.

Tabela 2. Enumeração de fungos filamentosos e medidas de atividade de água em pães em final de vida útil estocados a 5, 20, 25, 30 e 40C em um período de até 29 dias. .

T Aw Casca* Aw Miolo* DG-18 (log UFC/g)* DRBC (log UFC/g)*

5°C 0,964 ± 0,01ab A 0,969 ± 0,01a A 2,7 ±0,02b A 2,7 ± 0,30a A 20°C 0,953 ± 0,01bc A 0,964 ± 0,01a B 3,7 ± 1,55ab A 3,9 ± 1,92a A 25°C 0,966 ± 0,01a A 0,966 ± 0,02aA 6,2 ± 2,55a A 6,5 ± 2,42a A 30°C 0,956 ± 0,02 abc A 0,963 ± 0,01a B 3,6 ± 1,10ab A 3,6 ± 0,41a A 40°C 0,945 ± 0,01c A 0,957 ± 0,01a A 2,9 ± 0,01ab A 3,7 ± 0,99a A * Valores médios e respectivos desvio-padr es. Letras diferentes indicam diferen a significativa (ρ<0,05) de acordo

Tabela 3. Distribuições probabilísticas dos dados de contaminação do ar em diferentes pontos de coleta.

Ponto de Coleta Distribuição estatística

Pesagem RiskExtvalue(2.03614,0.15773) Masseira RiskLaplace(2.1875,0.15648) Pós forno RiskLaplace(2.3971,0.15541) Resfriamento RiskTriang(2.08793,2.59988,2.59988) Fatiamento RiskExtvalueMin(2.5028,0.047233) Embalagem RiskExtvalue(2.316188,0.092268)

Tabela Suplementar. Espécies de fungos filamentosos isolados das amostras de matérias-primas (farinha de

trigo integral, farinha de milho integral, grãos), pães e ar do ambiente de processamento.* N, número de amostras analisadas, n número de amostras contaminadas por fungos filamentosos.

Identificação Isolado Pães Far.Int Far. Mil. Int. Grãos Ar Σ Total %

N (n) * 25 (18) 50 (50) 5 (5) 45 (39) 136(136) 261 (248) Paecilomyces variotti 2 1 4 12 19 2,1 Penicillium aurantiogriseum 2 4 1 7 0,8 Penicillium chrysogenum 2 1 3 0,3 Penicillium citrinum 2 1 1 6 2 12 1,3 Penicillium commune 11 1 1 13 1,4 Penicillium corylophilum 1 1 0,1 Penicillium crustosum 3 3 0,3 Penicillium expansum 1 1 10 12 1,3 Penicillium freii 1 1 0,1 Penicillium griseofulvum 4 4 0,4 Penicillium lividum 1 1 0,1 Penicillium mineoluteum 2 2 0,2 Penicillium olsonii 5 1 6 0,7 Penicillium paneum 188 3 191 20,9 Penicillium paxilii 1 13 13 1,4 Penicillium polonicum 31 21 6 7 11 76 8,3 Penicillium sclerotiorum 12 12 1,3 Penicillium spinulosum 4 1 1 1 7 0,8 Penicillium thomii 8 8 0,9 Penicillium echinutalum 1 1 0,1 Aspergillus candidum 1 1 0,1 Aspergillus candidus 19 3 22 2,4 Aspergillus clavatus 1 2 3 0,3 Aspergillus flavus 5 1 8 126 140 15,3 Aspergillus fumigatus 1 1 0,1 Aspergillus japonicus 11 11 1,2 Aspergillus nidulans 1 1 0,1 Aspergillus niger 2 1 91 94 10,3

Aspergillus ochraceus 3 3 0,3 Aspergillus aculeatus 2 2 0,2 Aspergillus parasiticus 2 2 0,2 Aspergillus sydowii 5 2 1 8 0,9 Aspergillus tamarii 23 23 2,5 Aspergillus terreus 2 2 4 0,4 Aspergillus versicolor 1 1 0,1 Eurotium sp. 1 1 0,1 Eurotium amstelodami 10 7 17 1,9 Eurotium chevalieri 5 3 8 0,9 Eurotium repens 1 1 2 0,2 Mucor sp. 0 0 Mucor hiemalis 5 1 6 0,7 Mucor circinelloides 1 1 0,1 Mucor plumbeus 1 1 0,1 Mycelia sterília 7 5 12 1,3 Chrysonilia sitophila 2 2 38 42 4,6 Talaromyces sp. 1 1 2 0,2 Talaromyces variabile 1 1 0,1 Trichoderma sp. 13 13 1,4 Rhizopus sp. 1 49 50 5,5 Fusarium sp. 1 4 2 7 0,8 Alternaria sp. 4 4 0,4 Scopulariopsis sp. 1 1 0,1 Cladosporium sp. 8 3 9 20 2,2 Dematiáceo 1 2 15 18 2 Σ Total 245 125 14 67 464 915 100

Capítulo 3

Variabilidade de parâmetros cinéticos de

multiplicação e tempo para aparecimento de

micélio de diferentes espécies fúngicas isoladas

Variabilidade de parâmetros cinéticos de multiplicação e tempo para aparecimento de micélio de diferentes espécies fúngicas isoladas de pães integrais multigrão

Juliana Lane Paixão dos Santos1, Anderson de Sou a Sant’Ana1

1

Universidade Estadual de Campinas –UNICAMP, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Departamento de Ciência de Alimentos – CEP:13083-862, Campinas, SP, Brasil

Artigo formatado de acordo com as normas de submissão da revista “Microbial Risk Analysis”

Resumo

Este estudo teve como objetivo estimar parâmetros cinéticos de multiplicação ( e max) de seis espécies fúngicas (Paecilomyces variotii, Penicillium paneum, Penicillium polonicum, Penicillium spinulosum, Penicillium citrinum e Aspergillus sydowii) isoladas de pães integrais multigrão. Parâmetros primários de multiplicação foram obtidos após ajuste do modelo de Baranyi e utilizados posteriormente para obtenção do tempo de aparecimento de micélio visível (tv) de cada uma das espécies. Foram obtidas 72 curvas de crescimento após medição do diâmetro das colônias diariamente, em Dichloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) e Dichloran 18% Ágar Glicerol (DG-18) durante período de 14 dias e temperaturas de incubação de 200C, 250C e 300C. A influência da temperatura de estocagem e atividade de água foi observada nas taxas de multiplicação das espécies fúngicas (ρ<0,05). Essa influência está principalmente relacionada às temperaturas ótimas de multiplicação, onde as espécies apresentaram as maiores taxas. Entre as cepas estudadas, Paec. variotii apresentou a mais elevada taxa de multiplicação deste estudo (11,13 ±0,49 mm.dia-1) obtida em condições a 300C e AW 0,95 (ρ<0,05). Nesta mesma temperatura, observou-se maior variabilidade nas taxas de multiplicação entre as cepas estudadas (CV=44%). Valores de tempo de aparecimento de micélios entre as cepas estudadas variaram entre 29-114 horas, sendo o menor tempo observado para Paec. variotii a 300C. Devido a variabilidade entre diferentes espécies fúngicas que podem contaminar e deteriorar os pães integrais durante etapas pós processamento, o uso de cepas representativas como Paecilomyces variotii e P. paneum que apresentaram maiores taxas de multiplicação e menores valores de tv, pode ser excelente ferramenta em estudos posteriores de aumento de vida útil desses produtos.

Palavras-chaves: Fungos, atividade de água, temperatura de estocagem, Penicillium, pães, deterioração, tempo de aparecimento, variabilidade

1. Introdução

Pães integrais, assim como outros produtos de panificação, são altamente propensos a deterioração fúngica [1, 2]. Devido às suas características intrínsecas, pH levemente ácido (5-6), umidade em torno de 40%, atividade de água entre 0,93-0,96 e estocagem em temperaturas ambiente (20-300C), os pães são excelente substratos para o

desenvolvimento de uma ampla variedade de espécies fúngicas. Além de ocasionar perdas, devido a alterações nas características sensoriais dos produtos antes do fim da vida útil, várias espécies fúngicas são também produtoras de micotoxinas, de risco a saúde [3, 4, 5]

Os principais gêneros comumente relacionados aos produtos de panificação incluem Penicillium, Aspergillus e Eurotium [6, 7, 8]. A predominância de determinado gênero e espécie está principalmente relacionada as suas condições fisiológicas, como faixa de atividade de água e temperatura de multiplicação, bem como à tolerância a fatores como baixa tensão de oxigênio e conservantes [6]. Espécies fúngicas como Paecilomyces variotii, Penicillium paneum, Penicillium polonicum, Penicillium spinulosum, Penicillium citrinum, Aspergillus sydowii tem sido isolada de cereais e/ou produtos a base de cereais [6, 9, 10, 11, 12]. P. paneum, P. polonicum, P. citrinum e A. sydowii apresentam em comum, temperaturas ótimas de multiplicação próximas a temperatura ambiente (20-300C) em que os pães são comumente estocados e comercializados [6 e 10]. Já Paec. variotii, contaminante ubíquo, apresenta condição ótima de multiplicação entre 35-400C, podendo se multiplicar até 480C. P. spinulosum, espécie psicrófila, pode se multiplicar em baixas temperaturas, com mínimo de 00C e máxima de 300C [6]. Além disso, essas espécies são em sua maioria, xerofílicas, podendo se multiplicar em valores tão baixos quanto 0,78, como A. sydowii [6]

A deterioração de pães por fungos ocorre após contaminação por esporos fúngicos que em condições favoráveis, de temperatura e umidade, podem germinar e formar micélio visível antes do final de vida útil [13].

A obtenção de parâmetros cinéticos de multiplicação após ajuste de modelos matemáticos tem sido utilizada em diversos estudos de estabilidade microbiológica [14, 15, 16; 17; 18; 19, 20]. Dentre os modelos primários, o modelo de Baranyi [21] inicialmente utilizado em estudos de crescimento bacteriano, é frequentemente utilizado para descrever a multiplicação de fungos [15, 22, 23, 24, 25].

Devido a variabilidade entre espécies fúngicas que podem contaminar e deteriorar pães antes do final da sua vida útil, é de extrema importância a realização de seleção de cepa ou de um coquetel de cepas, enquadradas no “fail-safe”, ou se a, que representam o pior caso, como cepa com maior taxa de multiplicação, resistente à conservantes, entre outros [26]. Uma vez selecionadas, essas cepas poderão ser utilizadas em estudos de challenge testes e/ou modelagem preditiva, que visem o aumento da estabilidade microbiológica desses produtos.

A partir do exposto, este estudo teve como objetivos, i) estimar, através de ajuste do modelo de Baranyi, as taxas de multiplicação e tempo de lag de 6 espécies fúngicas isoladas de pães integrais multigrão; ii) estimar tempos de aparecimento de micélio visível

para cada espécie em função dos parâmetros cinéticos obtidos; e, através da análise dos parâmetros, iii) selecionar cepa(s) representativa(s) a partir das maiores taxas de multiplicação, menores tempo de aparecimento de micélios visíveis e importância na ocorrência de pães e cereais.

2. Material e Métodos

2.1 Cepas

Espécies fúngicas (Paec. variotii (LMQA-001) (E1), P. paneum (LMQA-002)

(E2), P. polonicum (LMQA-003) (E3), P. spinulosum (LMQA-005) (E4), P. citrinum (LMQA-

006) (E5), e A. sydowii (LMQA-004)(E6)) isoladas de pães integrais multigrão foram

utilizadas para este estudo (Santos et al., 2015). As cepas foram mantidas em tubos de ágar 0,5% (Acumedia, Michigan, USA) estéreis até utilização no experimento.

2.2 Inóculo e Incubação

Cada espécie foi inoculada centralmente através do uso de agulha de platina estéril em placas de Petri (90x15cm) contendo 20 ml de meios com diferentes valores de atividade de água: Dichloran 18% Ágar Glicerol (DG-18, Acumedia, Michigan, USA DG-18 ágar) (Aw= 0,952; pH=5,6) e Dichloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC, Merck, Darmstadt, Germany) (Aw= 0,994; pH=5,6). Após inoculadas, as placas foram embaladas em filme de polietileno e incubadas a 200C, 250 e 300C. Cada placa foi realizada em duplicata e o experimento foi repetido duas vezes (n=144).

2.3 Avaliação do crescimento

O crescimento radial micelial das colônias foi observado diariamente durante 336 h (14 dias). As medidas de diâmetro (mm) da colônia em duas direções perpendiculares foram obtidas utilizando-se um paquímetro digital com resolução 0,01mm (Digimess -100.175BL, Brasil).

2.4 Modelagem matemática

Valores de taxa de multiplicação (max , mm.dia-1) e do tempo de lag (, dias) foram estimados após ajuste do modelo Baranyi e Roberts [21] aos dados de diâmetro da colônia em função do tempo (Equações 1 e 2), utilizando software DMFit, um add-in do Excel. (1) (2)

onde, é o diâmetro da colônia em função do tempo (mm), é a taxa máxima de multiplicação (mm.dia-1),  (dias) é o tempo obtido pela intersecção e é o diâmetro máximo da colônia atingido.

O tempo (tv) de aparecimento de micélios visíveis para cada espécie foi calculado a partir da Equação 3:

(3)

onde é o diâmetro mínimo para micélio visível (3 mm).

2.5 Análise estatística

Os resultados foram estatisticamente comparados utilizando-se o software Statistica 7.0 para verificação de diferenças entre médias. Os testes F, Tukey e t-student com valores de probabilidade ρ<0,05 sendo considerados significativos foram utilizados. Gráficos de distribuições de frequência foram gerados no Microsoft Excel. Coeficientes de variação

, onde DP se refere aos desvios padrão dos parâmetros entre cepas para mesmo tratamento dividido pela média dos parâmetros entre cepas para mesmo tratamento.

3. Resultados e Discussão

Foram obtidas 72 curvas de crescimento com dados de diâmetros das colônias (mm) por tempo (dias). Medidas de diâmetros foram obtidas pela média das duas direções de crescimento da colônia. Parâmetros de cinética de multiplicação ( e ) estimados após ajuste dos dados ao modelo de Baranyi (Equação 1) estão apresentados na Tabela 1.

INSERIR TABELA 1

O crescimento radial das espécies foi avaliado em meios com diferentes valores de atividade de água (DRBC e DG-18) nas temperaturas de 200C (Figura 1), 250C (Figura 2) e 300C (Figura 3). Todas as curvas de crescimento apresentaram comportamento linear, após tempo de lag e, em alguns casos assíntota superior, indicando limite máximo de multiplicação delimitado pelo diâmetro da placa (80cm). O tempo de lag foi estimado para todas as curvas de crescimento com exceção da espécie E5 nas temperaturas de 200 e 250 C, pois não foi possível obter-se tal parâmetro após ajuste do modelo.

INSERIR FIGURAS 1, 2 E 3

Pães integrais apresentam umidade de aproximadamente 40% e valores de atividade entre 0,94-0,96 [2]. O uso de meio DG-18 (Dichloran 18% Glicerol agar), recomendado para quantificação e seleção de fungos xerofílicos em produtos com atividade de água < 0,95 [27, 28] foi utilizado em comparação ao meio que apresenta maior atividade de água (DRBC) para análise do efeito da atividade de água no crescimento das espécies fúngicas.

Valores médios de taxa de crescimento e tempo lag obtidos para cada espécie nas diferentes condições de estudo estão representados como distribuições de frequência (Figuras 4 e 5).

INSERIR FIGURAS 4 E 5

Valores de taxa de multiplicação entre 1,4 e 11,1 mm.dia-1 foram obtidos neste estudo. Valores entre 3,0-4,6 mm.dia-1 foram os mais frequentemente obtidos (38,9%). Menos frequentes, as taxas de multiplicação mais elevadas (> 7 mm.dia-1) foram observadas nas espécies E1 e E2 em suas temperaturas ótimas de crescimento. A distribuição entre os

valores de tempo lag incluem valores entre 0,7-4,2 dias. Entretanto, apesar da variação, mais de 50% dos valores estão relacionados aos menores tempos, entre 0,7 e 1,4 dias. O maior tempo de lag foi observado para a espécie E1 a 200C em DG-18. Nesta mesma condição esta espécie apresentou a menor taxa de multiplicação.

De acordo com os resultados obtidos e análise estatística com aplicação de teste F, a 200C, observou-se taxas de multiplicação ( das espécies E1 e E6 significativamente superiores (ρ<0,05) em DG-18 (5,04 ± 0,82) em relação a DRBC (4,08±0,47) para E1 e (2,72± 0,07) em relação a DRBC (2,05±0,05) para E6. A 250C, as taxas de multiplicação das espécies E1 DRBC (5,77±0,02) e DG-18 (7,71± 0,10), E2 DRBC (7,46±0,01) E DG-18 (6,99 ± 0,30), E5 DRBC (3,14±0,01) e DG-18 (3,90± 0,05) foram significativamente superiores (ρ<0,05) em DG-18. Semelhante efeito foi observado a 300