Universidade Estadual de Campinas
Faculdade de Engenharia de Alimentos
Juliana Lane Paixão dos Santos
"Modelagem Preditiva da Deterioração de Pães Integrais
Multigrãos por Fungos Filamentosos"
Campinas-SP
Juliana Lane Paixão dos Santos
"Modelagem Preditiva da Deterioração de Pães Integrais Multigrãos por Fungos
Filamentosos"
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do Título de Mestra em CIÊNCIA DE ALIMENTOS
Orientador: Prof. Dr. Anderson de Souza Sant’Ana.
ESTE ARTIGO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA LANE PAIXÃO DOS SANTOS E ORIENTADA PELO PROF. DR. ANDERSON DE SOUZA SANT’ANA.
Campinas - SP 2015
Banca Examinadora
Prof. Dr. Anderson de Souza Sant’Ana (Orientador) Universidade Estadual de Campinas
Profa. Dra. Maria Teresa Pedrosa Silva Clerici Universidade Estadual de Campinas
Dra. Alessandra Regina da Silva Marques Fundação André Tosello
Profa. Dra. Marina Venturini Copetti Universidade Federal de Santa Maria
Prof. Dr. Eduardo Micotti da Glória Universidade de São Paulo - ESALQ
A ATA da Defesa, assinada pelos membros da Comissão examinadora,consta no processo
Agradecimento
Gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuiram de alguma maneira para a realização de mais uma conquista...
A Deus primeiramente, pelas bençãos concedidas, por Seu amor incondicional, por Sua graça e misericórdia sem fim, por Sua presença real em minha vida.
Ao meu amado esposo, Jeverton Ledo, por me incentivar a prosseguir na área acadêmica e científica, por toda paciência, cuidado, amizade, companheirismo, apoio e todo amor.
À minha querida família pela torcida, paciência, amor, zelo e cuidado.
Ao meu orientador, Professor Dr. Anderson de Souza Sant’Ana, por me apresentar a área de microbiologia quantitativa de alimentos e modelagem matemática, pelas orientações e por todas as oportunidades proporcionadas que me trouxeram crescimento e amadurecimento científico.
Aos membros da banca, Profa. Dra. Maria Teresa Pedrosa Silva Clerici, Dra. Alessandra Regina da Silva Marques, Profa. Dra. Marina Venturini Copetti, Prof. Dr. Eduardo Micotti da Glória pela disponibilidade, colaboração, correções e sugestões.
Ao Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Unicamp por me proporcionar a realização da pesquisa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de mestrado concedida.
Ao Laboratório de Micologia da Universidade Federal de Santa Maria, à Profa. Dra. Marina Copetti, Angélica Bernardi e equipe pela colaboração na identificação de espécies fúngicas. Ao acesso a equipamentos e assistência prestada pelo Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular (INFABIC) da Universidade Estadual de Campinas; INFABIC é co-financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (08 / 57906-3) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (573913 / 2008-0).
Aos técnicos Mariana Baratti e Vitor Pelegati pelo auxílio nos experimentos microscópicos, paciência e disponibilidade.
Aos colegas de trabalho do Laboratório de Microbiologia Quantitativa de Alimentos (LMQA), pelo companheirismo, ajuda, amizade, conversas no RU, festas surpresas e muitas risadas.
À amiga Ligia Martins por me ensinar sobre o mundo dos fungos e suas infinitas faces, pela amizade, por todo tempo e ajuda concendida, pelas longas conversas no telefone, pelas risadas, choros, e por ser a minha melhor companhia nos congressos!
À amiga e colega de trabalho Mariana Batista, pela amizade, dedicação, preocupação, parceria, pelas conversas e desabafos, por me acolher em sua kitnet, mesmo eu tendo que levantar de madrugada para realizar experimentos, e por me proporcionar momentos de culinária inesquecíveis.
Ao amigo e colega de trabalho Allan Munford, pela amizade, atenção, por me escutar em momentos de ansiedade e decisões, pelas conversas construtivas no RU, pelo incentivo e parceria.
À amiga Carolina Rezende pela amizade, boas conversas, desabafos, ajuda e companhia. À amiga Letícia Pozza, pela colaboração na pesquisa, amizade, conversas, parceria, companhia e pelas muitas caronas.
À Camila Sena e equipe pela parceria e colaboração na produção dos pães. À amiga Alexandra, pela amizade, orações, pelo compartilhar e pela companhia. À Verônica Alvarenga por todo ensinamento, paciência, e orientação.
À amiga Évelin Wigmann pelo auxílio nos experimentos com fungos, amizade, risadas e conquistas compartilhadas.
Aos amigos e colegas de trabalho Damares, Monyca, Rafael, Ana Paula, Larissa, Beatriz, Bruna, Ramon, Amin, Chacon, Leo, Grazi, Marianna, Carine e Carol pela amizade, pelos momentos descontraídos, risadas e parceria.
Aos amigos de longe ou de perto que estiveram na torcida, acompanharam alguma fase da minha vida e que hoje fazem parte dessa vitória!
“Porque Dele e por Ele, e para Ele, são todas as coisas; a Ele pois, a glória eternamente. Amém”. Romanos 11:36
RESUMO
MODELAGEM PREDITIVA DA DETERIORAÇÃO DE PÃES INTEGRAIS MULTIGRÃOS POR FUNGOS FILAMENTOSOS
A busca dos consumidores por alimentos com apelos de saudabilidade e bem estar tem impulsionado as indústrias de panificação na diversificação de produtos integrais, com introdução de grãos e farinhas especiais. Devido à elevada ocorrência de fungos filamentosos em cereais e às características intrínsecas e extrínsecas dos pães, a deterioração por fungos é de extrema importância e limitante na estabilidade destes produtos, incluindo os integrais. Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de modelo preditivo para ser utilizado como ferramenta em estudos de aumento de estabilidade microbiológica de pães integrais multigrãos. Primeiramente, a identificação e quantificação de fungos filamentosos foi realizada em uma linha de processamento de pães integrais multigrãos (matéria-prima, ar, produto final). Dentre as matérias-primas analisadas, as amostras de farinha de milho integral apresentaram contaminação mais crítica. Espécies fúngicas de importância na deterioração dos pães, como Penicillium paneum, Penicillium polonicum e Paecilomyces variotii foram também isoladas em matérias-primas e no ar do ambiente de processamento. Amostras de ar coletadas nas etapas pós processamento (resfriamento, fatiamento e embalagem) foram as que apresentaram maiores contagens de fungos. As espécies fúngicas relacionadas à deterioração de produtos a base de cereais e que foram isoladas em pães integrais multigrãos foram selecionadas a partir da modelagem de cinética nos meios Dichloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) e Dichloran 18% Ágar Glicerol (DG-18) a 20, 25 e 30°C. Paec. variotii e P. paneum apresentaram as mais elevadas taxas de crescimento dentre as espécies, com 11,13 mm.dia-1 a 30°C e 7,46 mm.dia-1 a 25°C em DG-18, respectivamente. Estas espécies foram, portanto, selecionadas para posterior utilização na modelagem preditiva. O efeito da atividade de água (0,93-0,96), do pH (5,1-5,5), do propionato de cálcio (0,6 ; 0,8 e 1% Base Farinha) e da temperatura (20, 25 e 30°C) sobre o crescimento de P. paneum e Paec. variotii em pães integrais multigrãos foi investigado. O aparecimento de micélios visíveis (>3mm) foi analisado durante 21 dias. Temperaturas mais baixas (20°C) favoreceram o crescimento de P. paneum e mais altas (30°C), de Paec. variotii. Os modelos logísticos de probabilidade de crescimento das espécies em função das variáveis apresentaram >89% de concordância com os resultados observados. Ambas as espécies apresentaram menor probabilidade de crescimento em pães formulados com menor pH (5,1), menor atividade de
água (0,93) e menor concentração de propionato (0,6%). O aumento na concentração de pro-pionato estimulou o crescimento das duas espécies, resistentes a este conservante. O efeito do propionato de cálcio, pH e atividade de água foi também investigado sobre a germinação de esporos individuais de P. paneum através da captação de imagens por hora em microscópio invertido durante até 96 horas. Valores médios de tempo de germinação variaram entre 26 e 51 horas. A influência da atividade de água e do pH foi estatisticamente significativa para o tempo de germinação de P. paneum (ρ<0,05). Após ajuste dos valores estimados de tempo de germinação τ (h) à distribuições estatísticas, observou-se que o aumento da atividade de água resultou em menores desvios, com valores de 11,6, 4,4 e 3,3 para AW de 0,93, 0,94 e 0,95, respectivamente. O atraso na germinação de P. paneum (51h) foi observado em condições de menores níveis de atividade de água (0,93) a pH (5,1). Os conhecimentos adquiridos nestes estudos são importantes ferramentas para o alcance de maior vida útil de pães integrais multi-grãos, e consequente redução de perdas econômicas, devido à deterioração fúngica.
Palavras-chaves: Pão integral, deterioração, fungos, microbiologia preditiva, Penicillium paneum, Paecilomyces variotii, esporos individuais, germinação.
ABSTRACT
PREDICTIVE MODELING OF MULTIGRAIN WHOLEMEAL BREAD SPOILAGE BY FUNGI
The consumers search for healthier foods with high fiber content has driven bakery diversification of whole products and introduction of special grains and flours. Due to the high occurrence of fungi in cereals and the intrinsic and extrinsic characteristics of breads, spoilage by fungi is very important and limiting for the stability of these products. This study aimed to develop predictive model to be used as a tool to increase studies of microbiological stability of whole multigrain breads. Firstly, identification and quantification of fungi was carried out in a processing line breads multigrain (raw material, air, final product). Among the raw materials analyzed, the whole corn flour samples showed more critical contamination. Fungal species of importance in the spoilage of bread, as Penicillium paneum, Penicillium polonicum and Paecilomyces variotii were also isolated in raw materials and air processing. Air samples collected in post processing steps (cooling, slicing and packaging) had fungal contamination more critical. Fungal species related spoilage of cereal products, which were isolated in multigrain whole breads were selected from the kinetic modeling in Dichloran Rose- Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) and Dichloran 18% glycerol (DG-18) at 20°C, 25°C and 30°C. P. paneum and Paec. variotii showed the highest growth rates with 11.13 mm.day-1 to 30°C and 7.46 mm.day-1 to 25°C in DG-18, respectively. These species were therefore selected for further use in predictive modeling. The effect of water activity (0.93 to 0.96), pH (5.1-5.5), calcium propionate (0.6,. 0.8 and 1%) and temperature (20, 25 and 30°C) on the growth of P. paneum and Paec. variotii in multigrain breads were investigated. The appearance of visible mycelium (> 3 mm) was analyzed for 21 days. Lower temperatures (20°C) favor the growth of P. paneum and higher (30°C), of Paec. variotii. The increase in propionate concentration stimulated the growth of both species. Probabilistic growth models of species depending on variables showed> 89% agreement with the observed results. Both species were less likely to grow in bread formulated with lower pH (5.1), water activity (0.93) and concentration of propionate (0,6%). The effect of calcium propionate, pH and water activity in the individual germinating spores of P. paneum were also investigated by capturing images with time through an inverted microscope for up to 96 hours. Germination time varied between 26 and 51 hours. The water activity and the pH were statistically significant (ρ<0.05). After fitted of the estimated values of germination time (τ) (h) to statistical distributions, there was observed that increase in water activities values resulted in minor
deviations, with values of 11.6, 4.4 and 3.3 for Aw 0 93, 0.94 and 0.95, respectively. The delay in germination of P. paneum (51h) was observed under conditions of lower water activity (0.93) and pH (5.1). The knowledge obtained from these studies are important tools for achieving extended life of multigrain breads and consequent reduction in economic losses, due fungal spoilage.
Keywords: bread, spoilage, fungi, predictive microbiology, Penicillium paneum, Paecilomyces variotii, single cell, germination
Sumário
Introdução geral ………...….16
Capítulo 1: Revisão bibliográfica...19
Parte 1: Microbiologia dos pães...20
1.1 Fatores que contribuem para deterioração de pães integrais multigrãoss...20
1.2 Fungos deteriorantes em pães...21
1.2.1 Fungos pertencentes ao gênero Penicillium e gêneros relacionados...22
1.2.1.1 Penicillium paneum...22
1.2.1.2 Penicillium polonicum...23
1.2.1.3 Penicillium citrinum...23
1.2.1.4 Penicillium spinulosum...24
1.2.1.5 Paecilomyces variotii...24
1.2.2 Fungos pertencentes ao gênero Aspergillus e teleomorfos...24
1.2.2.1. Aspergillus flavus...25
1.2.2.2 Aspergillus niger...25
1.2.2.3 Aspergillus candidus...25
1.2.2.4. Aspergillus sydowii...26
1.2.2.5 Eurotium sp...26
1.2.3 Fungos pertencentes a classe de Zigomicetos...26
Parte 2: Controle da estabilidade microbiológica dos pães frente aos fungos...28
2.1 Efeito da formulação...28
2.1.1 Umidade e atividade de água...29
2.1.2 pH e conservantes químicos...29 2.1.3 Outros aditivos...32 2.2 Efeito da estocagem...33 2.2.1 Temperatura...33 2.2.2 Atmosfera...33 2.3 Efeito do processamento... 35
Parte 3: Microbiologia preditiva como ferramenta para estudos de parâmetros que afetam a vida de prateleira dos pães integrais multigrãos ...35
3.1 Definição...35
3.2 Etapas preliminares...36
3.3.1 Nível primário...38
3.3.2 Nível secundário...38
3.3.3 Nível terciário...38
3.3.4 Validação de modelos... ..39
3.4 Modelagem Preditiva aplicada a Fungos...39
3.5 Modelo de Crescimento: Baranyi e Roberts...44
3.6 Modelagem single cell ...44
3.7 Modelagem Probabilística e Regressão Logística...45
3.8 Modelagem Monte Carlo e Distribuições Estatísticas...46
4. Referências Bibliográficas...48
Capítulo 2: Incidência e quantificação de fungos em matérias-primas, produto final e ar do ambiente de processamento de pães integrais multigrãos e modelagem estocástica da variabilidade da contaminação de pães...61
Resumo...63
1. Introdução...63
2. Material e métodos...65
2.1 Coleta de amostras...65
2.2 Estocagem de amostras de pães integrais multigrãos...65
2.3 Determinação da atividade de água...65
2.4 Quantificação dos fungos filamentosos...66
2.5 Identificação dos fungos filamentosos...66
2.6 Modelagem probabilística da contaminação do produto final por fungos oriundos do ar do ambiente de processamento...66
2.7 Análises estatísticas...67
3. Resultados...67
3.1 Incidência e quantificação de fungos...68
3.1.1 Matérias-primas...68
3.1.2 Pães ao final da vida útil...69
3.1.3 Ar do ambiente de processamento...70
3.2 Modelagem probabilística da contaminação dos pães por fungos oriundos do ar do processamento...71
4. Discussão...72
5. Conclusão...77
Capítulo 3: Variabilidade de parâmetros cinéticos de multiplicação e tempo para aparecimento de micélio de diferentes espécies fúngicas isoladas de pães
integrais multigrãos...93 Resumo...95 1. Introdução...95 2. Material e métodos...97 2.1 Cepas...97 2.2 Inóculo e incubação...97 2.3 Avaliação do crescimento...97 2.4 Modelagem matemática...98 2.5 Análises estatísticas...98 3. Resultados e discussão...99 4. Referências...103
Capítulo 4: Modelagem do crescimento/não crescimento de Penicillium paneum e Paecilomyces variotii em pães integrais multigrãos em função do pH, concentração de conservante, atividade de água e temperatura...115
Resumo...116
1. Introdução...118
2. Material e métodos...119
2.1 Cepas e suspensão de esporos...119
2.2 Produção dos pães...120
2.3 Determinação de Aw ...121 2.4 Planejamento experimental...121 2.5 Inoculação e incubação...121 2.6 Avaliação do crescimento...122 2.7 Modelagem matemática...122 2.7.1 Modelagem primária...122
2.7.2 Modelagem probabilística cresce/não cresce...123
2.8 Análises estatísticas...124
3. Resultados...124
4. Discussão...128
5. Referências...132
Capítulo 5: Modelagem do efeito da atividade de água , do pH e do propionato de cálcio na germinação de esporos individuais de Penicillium paneum ...154
Resumo...156
1. Introdução...157
2. Material e métodos...159
2.1 Cepas e suspensão de esporos...159
2.2 Meio...159
2.3 Desenho experimental ...159
2.4 Avaliação da germinação...160
2.5 Modelagem primária...161
2.6 Modelagem probabilística da contaminação do produto final por fungos oriundos do ar do ambiente de processamento...161
2.7 Análises estatísticas...162
3. Resultados e Discussão...162
4. Referências...167
Discussão geral...184
Introdução Geral
Segundo o “ egulamento Técnico para Produtos de cereais, amidos, farinhas e farelos” aprovado pela AN SA- D , o pão é definido como o produto o tido da farinha de trigo e ou outras farinhas, adicionado de líquido, resultante do processo de fermentação ou não e cocção, podendo conter outros ingredientes, desde que não descaracterizem o produto (BRASIL, 2005).
onsumido mundialmente, o pão é considerado um dos mais populares e importantes para uma dieta balanceada, devido ao seu alto valor nutricional (fonte de fibras, compostos bioativos) versatilidade e características sensoriais.
A ind stria de panifica ão est entre os maiores segmentos industriais do rasil. Em 0 , o setor apresentou um faturamento de ,5 ilh es, indicando um crescimento de ,0 em rela ão a 0 (A P-Associa ão rasileira da nd stria de Panifica ão e Confeitaria, 2015). Estima-se que o consumo per capita de pão no pa s este a em torno de g ano. Este n mero representa um valor ai o se comparado quantidade recomendada pela rgani a ão undial de Sa de ( S), 0 g, e ao consumo de outros pa ses da América Latina como Argentina (82,5kg/ano), Chile (98 kg/ano) e Uruguai (55 kg/ano) (ABIP, 2015). Já o setor de pães industrializados apresentou em 2014 um faturamento de R$ 3,8 bilhões e crescimento de 19% em relação a 2013, correspondente à venda de aproximadamente 358 milhões de toneladas. Este setor obteve um consumo per capita de 2,3 kg/ano, representando aumento de 6% em relação ao ano anterior. Do total de venda de pães industrializados, estima-se que 30-40% se referem à venda de produtos com apelo saudável, como os pães enriquecidos com ingredientes naturais, farinhas integrais e/ou especiais, com cereais integrais, entre outros (Associação Brasileira das Indústrias de Biscoitos, Massas Alimentícias e Pães e Bolos industrializados, ABIMAP, 2015).
O apelo mundial para uma dieta mais saúdavel e para o consumo de produtos com alto teor de fibras tem levado às indústrias de panificação a buscar a diversificação de seus produtos, como por exemplo a produção de pães contendo farinhas integrais e variedade de grãos de cereais, ou não. No entanto, estes produtos apresentam uma vida útil muito curta, ocasionando rápida deterioração e rejeição pelos consumidores. Devido ao seu alto valor de atividade de gua (0,93-0,98) e umidade (38-40%), pH levemente ácido, elevado teor de fibras e carboidratos e por serem comercializados e estocados em temperatura ambiente (20-350C), os pães integrais multigrãos são altamente propensos a deterioração microbiológica, principalmente por fungos (Smith et al., 2004; Nielsen & Rios, 2000; Legan, 1993). A
deterioração de alimentos pela contaminação de fungos e micotoxinas representa uma perda anual de aproximadamente 5-10% em relação ao suprimento mundial. Desta perda, uma parcela de aproximadamente 4-5% se refere aos produtos de panificação (Cook e Johnson, 2010). Dados obtidos na Europa ocidental, apresentam uma estimativa de perda anual em torno de 225.000 toneladas de pães, referente a 242 milhões de euros (Legan, 1993). Neste sentido é de interesse o estudo de barreiras ou combinações de barreiras com foco na inibição/ impedimento do crescimento fúngico.
A microbiologia preditiva é o campo de estudo que combina elementos de microbiologia, estatística e matemática, com a finalidade de desenvolver modelos matemáticos, que descrevam e permitam predizer o comportamento de micro-organismos sob condições ambientais prescritas (McMeekein, 2002; Jagannath et al., 2003). Os modelos preditivos, primeiramente utilizado em estudos com bactérias, tem sido cada vez mais descritos em estudos de modelagem que levam em conta as especificidades de crescimento de fungos em alimentos (Dantigny et al., 2005b, 2007; Marín et al., 2005; Garcia et al., 2010; Sant'Ana et al., 2010; Gougouli et al., 2011, Hucthe et al., 2013; Dagnas et al., 2014; Manso et al., 2015). Além de serem utilizados como ferramenta em substituição aos challenge tests, estes modelos apresentam uma alternativa viável e de baixo custo para o alcance de formulações mais robustas, através da identificação das condições que inibem/retardam a germinação e o crescimento de micro-organismos deteriorantes e, limitantes para a vida útil dos produtos.
Para o aumento do consumo e da qualidade microbiológica dos pães integrais multigrãos, deve-se levar em considera ão que os pães, além de nutritivos e convenientes, se am produtos mais est veis durante a vida útil. A indústria de panificação tem utilizado diferentes métodos a fim de alcançar uma maior estabilidade microbiológica de produtos de panificação durante a vida de prateleira, incluindo técnicas de controle de contaminação (matéria-prima, condições de higiene, layout), controle da germinação seguido de crescimento (formulação, embalagem e condições de estocagem) e técnicas de inativação dos contaminantes (durante processamento). Apesar do uso de v rias técnicas para o controle de deteriora es dentro da ind stria, a e tensão da vida til de produtos de panifica ão para atender às demandas continua a ser um problema atual (Cornea et al., 2011; Kurukshetra, 2011; Belz et al., 2012; Rezazadeh et al., 2013; Nakhchian et al., 2014; Dagnas et al., 2014).
Este estudo teve como objetivo geral a obtenção de ferramentas, como os modelos matemáticos preditivos, para o alcance de formulações de pães integrais multigrãos mais robustas frente aos fungos filamentosos e consequente aumento de vida útil destes produtos.
Para alcance do objetivo geral, foram considerados nesta pesquisa, os seguintes objetivos específicos:
Quantificar, isolar e identificar fungos filamentosos de amostras de matérias-primas, produto final e ar do ambiente de processamento de uma linha de produção de pães integrais multigrãos. Estimar a variabilidade na contaminação da superfície de pães pelo ar, durante período de resfriamento;
Selecionar, através de parâmetros cinéticos de crescimento e da ocorrência em cereais e produtos a base de cereais, cepas de fungos representativas para a deterioração de pães integrais multigrãos;
Desenvolver modelos probabilísticos para determinar a probabilidade de crescimento de cepas fúngicas representativas em pães integrais multigrãos em função de parâmetros intrínsecos (atividade de água, pH, concentração de propionato de cálcio) e extrínseco (temperatura);
Utilizar abordagem em nível de células individuais para estudar a variabilidade do tempo de germinação de esporos fúngicos de Penicillium paneum em função da atividade de água, pH e concentração de propionato de cálcio.
Capítulo 1
PARTE 1: MICROBIOLOGIA DOS PÃES
1.1 FATORES QUE CONTRIBUEM PARA DETERIORAÇÃO DE PÃES INTEGRAIS MULTIGRÃOSS
Os pães, assim como outros alimentos, estão sujeitos às alterações microbiológicas, físicas e químicas ao longo de sua vida de prateleira (Cauvain e Young, 2007). De acordo com a relação entre parâmetros intrínsecos e extrínsecos como, a temperatura de estocagem, umidade relativa, concentração de conservante, pH, material de embalagem, umidade do produto, atividade de água (Aw), entre outros parâmetros haverá predominância de determinado tipo de agente de deterioração.
Os pães industrializados integrais multigrãos apresentam umidade em torno de 40%, atividade de água entre 0.93-0.96, pH entre 5 e 6 (Legan, 1993; Smith et al., 2004), sendo comumente embalados em filmes de polietileno de baixa densidade e estocados à temperatura ambiente (20-35°C).
Devido à elevada ocorrência de fungos em produtos agrícolas armazenados, tais como trigo e milho (Weidenborner et al., 2000; Berghofer et al., 2003; Dantigny et al., 2005a; Pitt e Hocking, 2009, Biro et al., 2009; Chehri et al., 2010; Eglezos et al., 2010; Asadzadeh et al., 2014), a deterioração fúngica é de particular interesse para a indústria de panificação (Pitt e Hocking, 2009) e limitante para a estabilidade dos pães. Este tipo de deterioração está fortemente relacionada à alta atividade de água deste produto, ao pH levemente ácido que restringe o crescimento de outros micro-organismos. Além disso, o pão é uma excelente fonte de carboidratos e apresenta uma estrutura porosa (rede de glúten e amido gelatinizado), facilitante para a fixação de micélios (Cauvain e Young, 2007).
As etapas de processamento dos pães incluem: pesagem de ingredientes, mistura, divisão, moldagem, fermentação, assamento, resfriamento, fatiamento e embalagem (Cauvain e Young, 2007). Durante a etapa de assamento (2400C), ocorrem diversas interações físicas, químicas e bioquímicas, como a formação de compostos aromáticos, reação de Maillard, gelatinização do amido, formação da crosta, expansão do volume, desnaturação das proteínas, inativação das leveduras e de atividades enzimáticas (Cauvain e Young, 2007). Nesta etapa, o interior do pão alcança temperaturas em torno de 95°C e valores de atividade de água mais elevados (Aw > 0,90) do que na crosta (Aw < 0,50). Este baixo valor de atividade de água encontrado na superície do pão logo após assamento, restringe o crescimento de esporos fúngicos e células vegetativas (Boey et al., 2001; ICMSF, 2005). A contaminação por fungos
em pães ocorre preferencialmente após processamento, através da deposição de esporos provenientes do ar, de manipuladores, superfície de equipamentos de fatiamento, resfriamento e embalagem (Boey et al., 2001, Blackburn, 2006; Cornea et al., 2011).
O nível de esporos de fungos no ar comumente associado às indústrias de panificação pode variar entre 100 a 2500 esporos/m3 (Cauvain e Young, 2007). Além disso, elevado número de esporos fúngicos presentes na farinha e nos grãos, bem como as condições de higiene e de processo podem contribuir para contaminação do produto final (Cook e Johnson, 2010).
1.2 Fungos deteriorantes em pães
Os fungos são amplamente distribuídos no meio ambiente, incluindo o ar, água, solo, e apresentam diferentes condições ótimas de multiplicação, capacidade de esporulação e disseminação (Pitt e Hocking, 2009).
A deterioração de pães por fungos ocorre a partir do aparecimento do micélio visível proveniente de pelo menos um esporo na superfície do produto, evento este que pode ocorrer logo após o término da germinação e antes do final da vida útil do produto, ocasionando rejeição pelo consumidor (Baert et al., 2007). Além da aparência indesejável, os fungos são responsáveis por alterações nas características sensoriais de sabor e odor dos produtos (Berenguer et al., 1991, Hill et al., 1995, Nielsen e Rios, 2000), devido à produção de exoenzimas, como lipases, proteases e carboidrases (Filtenborg et al., 1996).
Os fungos são os principais responsáveis pela deterioração de produtos de panificação em aproximadamente 60% dos casos (Legan e Voysey, 1991). As principais espécies deteriorantes incluem fungos dos gêneros Penicillium, Aspergillus e Eurotium, além de espécies pertencentes aos gêneros Cladosporium, Mucor e Rhizopus, e do gênero Neurospora (Pitt e Hoocking, 2009; ICMSF, 2005; Saranhaj & Gueetha, 2012). Menos frequente que os fungos, a deterioração por bactérias e leveduras está principalmente relacionada presença de elevada carga microbiana na matéria-prima, ausência de conservantes químicos e a falhas nas boas práticas de fabricação (Boey et al., 2001).
As leveduras “pseudo-filamentosas” mais comumente relacionadas a estes produtos incluem Endomyces fibuliger e Hyphopichia burtonii (Pitt e Hocking, 2009; ICMSF, 2005). Os principais gêneros e espécies relacionadas a este tipo de deterioração, bem como o tipo de deterioração comumente relacionada estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Deteriorações fúngicas em pães
Espécie(s) Fúngica(s) Tipo de deterioração
Aspergillus niger “ lac mould”
Cladosporium spp. “ rown/black mould rot”
Penicillium spp. “Blue-green mould”
Rhizopus spp. “Black mould”
Chrysonilia sitophyla “Red bread mould”
Endomyces fibuliger “Chalk mouldy”
Cook e Johnson, 2010; ICPMF, 2005
1.2.1 Fungos pertencentes ao gênero Penicillium e gêneros relacionados Fungos pertencentes ao gênero Penicillium e correlatos (teleomorfos Eupenicillium, Talaromyces) e Paecilomyces, de interesse na deterioração de pães integrais apresentam em comum uma estrutura conidial em formato de penicilli, um aglomerado de fiálides anexadas diretamente a estipe ou anexada após um ou mais estágios de ramificação. Devido a pouca exigência nutricional e por metabolizarem formas complexas de carbono orgânico, fungos pertencentes a estes gêneros estão difundidos em diferentes ambientes. São fungos predominantes em produtos armazenados em condições de alta umidade relativa (>86%) e que se multiplicam preferencialmente entre 20-250C (Pitt e Hocking, 2009; Smith et al., 2004). Colônias de fungos pertencentes ao gênero Penicillium, exceto em alguns casos, apresentam crescimento rápido, são lisas, filamentosas, podendo apresentar textura aveludada, cotonosa e flocosa. Inicialmente, as colônias apresentam coloração branca que se tornam coloridas (principalmente tons de verde e azul, verde acinzentadas, ou amarelas) após esporuladas (Pitt e Hocking, 2009; ICMSF 2005). Fungos pertencentes a estes gêneros e que estão relacionadas a deterioração de produtos de panificação, incluem espécies como Penicillium paneum, Penicillium polonicum, Penicillium citrinum, Penicillium spinulosum e Paecilomyces variotii.
1.2.1.1Penicillium paneum
Penicillia pertencentes a série e seção Roqueforti, como P. paneum, são comumente isolados de produtos de panificação (Nielsen e Rios, 2000; Suhr e Nielsen, 2004; Samson e Frisvad, 2004; Dantigny et al., 2005b). A ocorrência se dá principalmente devido a resistência destes fungos a ácidos orgânicos, como ácido propiônico, benzóico, acético, lático (Samson e Frisvad, 2004). P. paneum é comumente associada a deterioração de produtos fermentados como queijos, iogurtes, pães e cacau (Samson e Frisvad, 00 ; ’ rien et al.,
2006; Storm et al., 2008; Copetti et al., 2011). Esta espécie pode tolerar elevada concentração de conservantes ,como 1% de ácido propiônico, 0.5% de ácido acético e 50 ppm de ácido sórbico e benzóico. Sua ácido-tolerância ocorre devido a sua capacidade em utilizar ácidos como fonte de carbono (Samson et al., 2002; Samson e Frisvad, 2004) e ao efeito simbiótico do fungo com bactérias lácticas e leveduras ácido-tolerantes (Samson et al., 2002). P. paneum se multiplica bem em temperaturas próximas a temperatura ambiente (20-250C) e apresenta a mais alta taxa de crescimento micelial entre as espécies da mesma seção. Seu crescimento em baixa atividade de água é limitado em comparação com outras espécies do subgênero Penicillium (Samson e Frisvad, 2004). P. paneum é reconhecido pela formação de colônias baixas, estipes tuberculadas e ramificadas, estrutura de frutificação em forma de conidióforos agrupados, conídios globosos de coloração verde escuro a verde azulado escuro (Samson e Frisvad, 2004).
1.2.1.2 Penicillium polonicum
Pertencente ao subgênero Penicillium, seção e série Viridicata, Penicillium polonicum, assim como outras espécies desta seção, é reconhecida como importante deterioradora e produtora de micotoxinas em cereais e produtos a base de cereais, contendo farinha de trigo. Esta espécie já foi isolada de grãos como trigo, centeio, cevada, aveia e tem o ar de ambientes internos como habitat típico (Samson e Frisvad, 2004). Produzem conidióforos contendo três estágios de ramificação (terverticiliado), e fiálides robustas, conídios globosos de coloração escura e conidióforos com paredes rugosas. As colônias apresentam textura fasciculada, crescem muito rápido e são responsáveis pela produção de vários extrólitos. Esta espécie, assim como as outras pertencentes a esta série, é psicrotolerante e cresce bem em baixa atividade de água (xerofílica). Tolera muito bem concentrações de até 5% de NaCl, crescendo melhor no meio com 5% de NaCl do que em meio sem o sal (Samson e Frisvad, 2004).
1.2.1.3 Penicillium citrinum
P. citrinum é reconhecido por seus penicilos, que consistem de 3 a 5 métulas divergentes contendo longas e definidas colunas de conídios. Mesofílica, esta espécie está amplamente distribuída e presente em diversos habitats. Apresenta temperatura mínima de crescimento de 50C, máxima de 370C e ótima entre 26 e 300C. Pode crescer em atividade de água mínima de 0.8 a 250C e na faixa de pH entre 2 e 10. P. citrinum foi isolada de cereais, como trigo, cevada, grãos e da farinha (Pitt e Hocking, 2009, Wigmann et al., 2015).
1.2.1.4. Penicillium spinulosum
P. spinulosum tem como característica a produção de conídios com espinhos diminutos em sua superfície (Pitt e Hocking, 2009). Espécie xerofílica, pode germinar em valores de atividade de água abaixo de 0.80 a 22-250C. Psicrotrófica, é capaz de crescer em temperaturas inferiores a 00C, e máxima de 300C. Já foram isoladas linhagens de P. spinulosum a partir de trigo e farinhas (Pitt e Hocking ,2009).
1.2.1.5 Paecilomyces variotii
Fungos pertencentes ao gênero Paecilomyces se diferenciam do gênero Penicillium devido principalmente ao formato das fiálides e ao formato e coloração dos conídios (Pitt e Hocking, 2009). Paecilomyces variotii, conhecida como “mouldy leather” apresenta conídios alongados, elipsoidal a fusiformes, colônias lisas, de aparência flocosa, coloração marrom ou marrom oliva oriunda dos conídios. Apresentam formação de penicilli de hifas áereas, estipes curtas, de padrão irregular e fiálides longas. Por ser um contaminante ubíquo, Paec. variotii tem sido isolada de cereais (Loiveke et al., 2004), pães e produtos cárneos (Pitt e Hocking, 2009), cacau e chocolate em pó (Copetti et al., 2011), bebidas e também do ar ambiente das linhas de produção na indústria de alimentos (Dantigny et al 2005a; Pitt e Hocking, 2009). Paec. variotii é uma espécie xerofílica e capaz de crescer em valores de atividade de água de até 0.80, e apresenta resistência a sorbatos (Pitt e Hocking, 2009) e a baixa tensão de oxigênio. Apresenta temperatura ótima de crescimento entre 35-400C máxima de 480C e mínima de 50C. Paec. variotii é a estrutura anamorfa de Byssochlamys spectabilis (teleomorfo) que apresenta uma estrutura de termo-resistência, o cleistotécio (Pitt e Hocking, 2009).
1.2.2 Fungos pertencentes ao gênero Aspergillus e teleomorfos
Os fungos do gênero Aspergillus são caracterizados pela presença de conidióforo que finaliza em forma de vesícula e pela célula-pé basal, que dá origem as estipes. Diferentemente dos fungos pertencentes ao gênero Penicillium, o crescimento das fiálides oriundas da vesícula ou da métula é sincrônico. Espécies pertencentes a este gênero estão associadas principalmente com a deterioração pós-colheita de produtos agrícolas, como cereais e oleaginosas (Pitt & Hocking, 2009). Algumas espécies produzem substâncias como
isopreno que podem causar alteração de odor em produtos de panificação e também podem ser relativamente resistentes aos conservantes de ácidos fracos como sorbatos e propionatos (Vinas et al., 1990; Guynot et al., 2002).
1.2.2.1. Aspergillus flavus
A. flavus é caracterizada por apresentar colônias verdes a amarelo-oliva, conídios globosos, verde pálidos, finamente enrugados (Pitt e Hocking, 2009). Apresenta temperatura máxima de crescimento de 480C, mínima entre 10 e 120C, e ótima de 33°C (Domsch et al., 1980, ICMSF, 1996). A multiplicação de A. flavus ocorre em ampla faixa de pH (2,1-11,2) com ótimo próximo a neutralidade (Wheeler et al., 1991; Pitt e Hocking, 2009) e atividade de água mínima em torno de 0.80. A contaminação em produtos a base de cereais, farinha de trigo e pães (Marín et al., 2002; Pitt e Hocking, 2009; Weidenborner et al., 2000; Kurukshetra, 2011) e ar de ambiente de processamento (Kure et al., 2004; Cornea et al., 2011; De Clercq et al., 2015) é comumente reportada.
1.2.2.2. Aspergillus niger
Presente em regiões tropicais, de clima quente e úmido, A.niger ocorre tanto no campo quanto em produtos estocados. Apresenta conídios esféricos de coloração preta que conferem proteção à radiação UV. Apresenta temperatura mínima de crescimento entre 6-80C, máxima entre 45-470C e ótima entre 35-370C (Pitt e Hocking, 2009). Xerofílica, esta espécie é capaz de germinar em atividade de água de 0.77 a 350C. Pode estar presente em cereais, como milho (Pitt e Hocking, Magnoli et al., 2007a) e cevada (Pitt e Hocking, 2009; Soldevilla et al., 2005; Lugauskas et al., 2006; Viswanath et al., 2006), farinhas (Weidenborner et al., 2000) e também em produtos de panificação (Marin et al., 2002; Guynot et al., 2005)
1.2.2.3. Aspergillus candidus
A. candidus é comumente relacionado à deterioração de cereais armazenados, farinhas e produtos a base de cereais, como os pães (Pitt e Hocking, 2009; Lugauskas et al., 2006). Xerofílica, pode crescer em atividade água de até 0.75. A temperaura ótima para esta espécie pode variar desde 20-240C até 45-500C, com máxima entre 41-42 e 50-55°C e mínima de 3-40C a 11-130C (Pitt e Hocking, 2009). Conídios de A. candidus podem sobreviver após processamento térmico de 500C por 10 minutos mas são destruídos após tratamento a 600C por 10 minutos (Pitt e Hocking, 2009). A. candidus é a espécie mais tolerante a reduzidos níveis de oxigênio dentre as espécies do gênero, sendo capaz de se multiplicar em atmosferas
com até 45% de O2. Além disto, apresenta alta tolerância ao ácido propiônico (Frisvad e Samson, 1991).
1.2.2.4. Aspergillus sydowii
Amplamente distribuída, A. sydowii é reconhecida como espécie fúngica de estocagem e pode estar relacionada a grãos de cereais como cevada, trigo e farinha e pães (Dantigny et al., 2005a; Pitt e Hocking, 2009). Espécie mesofílica apresenta temperatura mínima de crescimento de 90C, máxima de 390C, produção de conídios de coloração azul, vesículas pequenas e formação de conidióforos menores. A sydowii pode se multiplicar em valores de atividade de água de até 0,78 (Pitt e Hocking, 2009).
1.2.2.5 Eurotium sp.
O gênero Eurotium é caracterizado por ser um dos vários estágios teleomorfos (sexuados) produzidos pelas espécies Aspergillus, caracterizado pela produção de cleistotécios amarelos e pela formação de ascosporos. Todas as espécies pertencentes a este gênero são xerofílicas e predominantes em condições de baixa umidade relativa (<86%) (Pitt e Hocking, 2009).
Dentre as espécies descritas, E. amstelodami é a mais comumente relacionada a cereais, incluindo farinha de trigo e produtos de panificação (Guynot et al., 2002; Pitt e Hocking, 2009). Fungos pertencentes a este gênero tem a capacidade de multiplicar em ambiente com até 1% de oxigênio (Hocking, 1990), sendo reportados como causadores de alteração de odor em produtos de panificação (Berenguer et al., 1991).
1.2.3 Fungos pertencentes a classe de Zigomicetos
Fungos pertencentes a classe de Zigomicetos apresentam como principais carcaterísticas a rápida multiplicação (>10mm de diâmetro da colônia/dia em condições ótimas), com produção de micélios aéreos e não septados, o que garante uma movimentação rápida do conteúdo celular, conhecida como fluxo protoplasmático. Além disso, apresentam reprodução por esporangiósporos, esporos produzidos assexuadamente no interior de um saco chamado de esporângio e, por zigosporos na reprodução sexuada (Pitt e Hocking, 2009). Fungos pertencentes a esta classe não resistem à condições extremas como baixa atividade de água, tratamentos térmicos e químicos (Pitt e Hocking, 2009). Dentro os gêneros de interesse na deterioração de alimentos tem-se os Mucor e os Rhizopus. Fungos pertencentes ao gênero Mucor são amplamente distribuídos na natureza, no solo, e em habitats úmidos, comumente
isolados no ar de ambientes internos (Samson et al., 2004). Algumas espécies podem crescer sob condições de anaerobiose. M. racemosus foi reportado em cereais e produtos a base de cereais, possui a capacidade de crescer em am iente com atmosfera modificada (< e ≥ 97% de CO2 ) (Hocking, 1990) e apresenta aparência de leveduras, quando cresce sob estas condições adversas.
Espécies do gênero Rhizopus apresentam como principal característica a formação de rizóides (Pitt e Hocking, 2009), presente na base dos esporangiósporos, presença de columelas e de esporangiósporos secos, de paredes estriadas. A distribuição de esporos de fungos pertencentes ao Rhizopus através do ar ocorre mais facilmente levando a um maior número de esporos potencialmente dispersos e facilitando a contaminação de equipamentos, superfícies e alimentos. Rhizopus stolonifer ocorre particularmente em regiões tropicais e subtropicais e está associado a diversos tipos de deterioração de vegetais, incluindo trigo, farinhas (Weidenborner et al., 2000; Pitt e Hocking, 2009). Apresenta faixa de multiplicação entre 5-30°C, com temperatura ótima de multiplicação de 25°C e máxima de 35-37°C (Pitt e Hocking, 2009). R. stolonifer produz o mais rápido crescimento micelial reportado: 2mm/h (aproximadamente 5cm/dia) a 25°C e Aw de 0,99. Assim como espécies pertencentes ao gênero Mucor, pode ocorrer em condições de anaerobiose (Pitt e Hocking, 2009).
O resumo de algumas espécies fúngicas de importância na deterioração de pães, incluindo dados de crescimento e de resistência estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Características de espécies de fungos deteriorantes em pães.
Penicillium polonicum 20-25 Penicillium spinulosum Penicillium citrinum 26-30 Penicillium paneum 25 Aspergillus sydowii 25-27 Paecilomyces variotii 35-40 Aspergillus flavus 33 Aspergillus niger 35-37 Espécie Tótim Aspergillus candidus 20-45 < 0 5 9 5 10-12 6-8 Tmín 3-11 30 37 37 37 48 43-48 45-47 Tmáx 55 Awmín pH 0,75 0,78 2,1-11,2 0,77 < 2 0,78 0,8 0,8 2-10 < 0,80 NaCl
Baixa tensão de O2, sorbatos
Baixa tensão de O2, álcool, ácidos orgânicos
Radiaçao UV
Resistência
PARTE 2: CONTROLE DA ESTABILIDADE MICROBIOLÓGICA DOS PÃES FRENTE AOS FUNGOS
Os pães integrais multigrãos são comumente embalados em filmes de polietileno de baixa densidade e fechados com fitilhos, que não são barreiras ao ar. A adição de conservantes, com foco no propionato de cálcio, ou sua combinação com outros conservantes como sorbatos é considerada como uma das principais barreiras tecnológicas nestes produtos (Saranhaj et al., 2012).
A indústria de panificação tem utilizado diferentes métodos a fim de alcançar uma maior estabilidade microbiológica de produtos de panificação durante a vida útil. Dentre os métodos utilizados estão as técnicas de controle de contaminação (matéria-prima, condições de higiene, layout), controle da germinação seguido de crescimento durante formulação, embalagem e condições de estocagem e técnicas de inativação dos contaminantes durante processamento (Smith et al., 2004; Membre, 2013).
Sabe-se que a taxa de multiplicação de fungos em pães é dependente da formulação e processamento (Seiler, 1992). A vida útil de produtos com alto teor de umidade e atividade de água, como os pães industrializados, é muito dependente da atividade de água e pH e a reformulação destes produtos, com redução de ambos os parâmetros, pode ser uma excelente alternativa para aumento da estabilidade microbiológica. Os grãos estão sujeitos à contaminação microbiana durante desenvolvimento e colheita e esta contaminação pode ser carreada até o produto final (Cauvain e Young, 2007).
A deterioração de pães por fungos ocorre quando o produto é contaminado por esporos fúngicos que germinam e formam micélio visível antes do final de vida de prateleira (Dagnas e Membré, 2013). A contaminação e o crescimento fúngico (germinação e proliferação) são dependentes da carga inicial de esporos presentes na matéria-prima, ambiente industrial, condições de processo, formulação do produto, e das condições de estocagem e comercialização (Boey et al., 2001; Blackburn, 2006; Cornea et al., 2011; Pitt e Hocking, 2009).
2.1 Efeito da formulação
Uma abordagem prática, comum e de baixo custo-benefício para alcance de maior estabilidade dos pães pelas indústrias de panificação se refere ao controle de crescimento de fungos durante a estocagem e comercialização do alimento. Este controle pode ser alcançado através da reformulação do produto com foco na redução da atividade de água (Aw) e pH, e na
forma de uso de conservantes químicos (incorporado diretamente no produto ou aplicado na superfície através de spray) (Rosso e Robinson, 2001).
2.1.1. Umidade e atividade de água
Pães integrais multigrãos apresentam alto valor de umidade, de aproximadamente 40%. Esse valor pode variar de acordo com a quantidade de água adicionada, ao teor de fibras presente, bem como às condições de tempo e temperatura de forneamento. O valor de atividade de água comumente encontrado nestes produtos varia entre a faixa de 0,93-0,97. Este parâmetro é de extrema importância em estudos de estabilidade microbiológico, pois está altamente relacionado ao desenvolvimento de fungos devido a influência na germinação dos esporos fúngicos e proliferação de hifas (Pitt e Hocking, 1977; Santour et al., 2001). A redução no valor da atividade de água leva a um decréscimo da germinação e multiplicação dos fungos até o alcance de uma taxa mínima, onde não acontecem mais estes fenômenos. A inibição ocorre devido ao efeito de estresse da célula, liberação de água a fim de manter o equilíbrio osmótico com consequente inativação das atividades metabólicas (Jay, 2005) . O alcance do menor valor possível de atividade de água para controle de crescimento fúngico deve considerar também os efeitos adversos na qualidade e aceitação do produto, como perda de maciez em pães.
A germinação e a multiplicação dos fungos são também dependentes da natureza dos solutos relacionados à diminuição do valor de atividade de água (Aw) (Huang et al., 2009). Esta redução pode ser alcançada por desidratação (evaporação) obtida na etapa de assamento ou por adição de solutos com alta atividade osmótica como açúcar, sal ou poli-álcoois, incorporados diretamente nos pães (Smith et al., 2004). O nível de solutos necessário para inibição e controle de fungos deteriorantes não pode levar à alterações negativas nas características sensoriais e de textura dos produtos.
Considerando valores de atividade de água mínimos de crescimento, os fungos podem ser divididos em dois grandes grupos: xerofílicos, capazes de crescer em atividade de água abaixo de 0,85 e os não xerofílicos que crescem em atividade de água >0,85 (Pitt, 1975). O efeito significativo deste parâmetro nas taxas de multiplicação de fungos deteriorantes tem sido descrito por vários autores (Garcia et al., 2010; Huchet et al., 2013; Burgain et al., 2013; Dagnas et al., 2014).
Devido a sua leve acidez, os pães integrais multigrãos são mais susceptíveis aos fungos, que são menos fastidiosos em relação ao pH do que as bactérias, podendo crescer em ampla faixa de valores.
O pH não apresenta um efeito direto na germinação e na proliferação do micélio (Sautour et al., 2001; Wheeler et al., 1991). Seu efeito está prinicipalmente relacionado aos impactos na microbiota bacteriana competitiva e na proporção entre as formas dissociada e não dissociada de ácidos orgânicos (Sofos e Busta, 1991). A eficiência antimicrobiana dos ácidos fracos é muito dependente do pH. Em valores de pH iguais ao pKa do ácido, tem-se 50% das moléculas na forma dissociada e 50% na forma não dissociada (efetiva). Sabe-se que um aumento de 0,5 no valor de pH pode resultar no dobro de concentração de ácido orgânicos, como sórbico e acético, necessária para garantir mesmo efeito antifúngico (González et al. 2010). Além disso, a ação antifúngica devido ao uso de ácidos orgânicos, irá variar de acordo com composição química do alimento, pH, o ácido utilizado, espécies predominantes e a relação dessas espécies à susceptibilidade frente ao(s) ácido (s) (González et al., 2010, Stratford et al., 2009). Ácidos fracos são ácidos lipofílicos e podem penetrar a membrana celular na forma não dissociada. No interior da célula (pH elevado), ocorre dissociação da molécula com liberação de íons que são impermeáveis a membrana. Os efeitos causados na célula microbiana incluem o impedimento do metabolismo, desnaturação das proteínas e/ou dano físico à membrana celular (Sofos e Busta, 1991).
A deterioração por fungos em pães é retardada pela adição de conservantes químicos como ácidos propiônicos, sórbicos, acéticos e seus sais, geralmente reconhecidos como seguros (GRAS). As formas de sais são as mais comumentes utilizadas pela indústria devido a sua alta solubilidade em água e por ser de mais fácil manuseio em relação aos respectivos ácidos corrosivos (Blackburn, 2006). Os conservantes químicos apresentam ação fungiostática, não sendo portanto, letais para os esporos. Em altas concentrações, e dependendo do espectro de ação, podem ocasinar perdas de volume e efeitos adversos nas características sensoriais dos pães (Blackburn, 2006).
Os conservantes mais comumente utilizados nas indústrias de panificação incluem propionatos e sorbatos. O limite de concentração de cada conservante é controlado pela legislação de cada país. De acordo com a União Européia, ácido propiônico e sórbico e suas formas de sais podem ser utilizados na formulação de pães em concentrações máximas de 3000 e 2000 ppm, respectivamente (União Européia, 1995). No Brasil não existe um limite máximo para adição de propionatos, enquanto os sorbatos podem ser dosados em concentração máxima de 0,1% na forma de ácido nos pães (ANVISA,1999).
Os propionatos são incorporados na massa antes da etapa de mistura e apresentam como principais vantagens a alta solubilidade, sabor neutro, baixa toxicidade , além do baixo efeito sobre as leveduras (Blackburn, 2006). Sua forma de ação está relacionada a liberação dos íon propionato e Ca2+ e posterior formação do ácido propiônico quando em contato com a água, que é estimulada em baixo pH. A presença do ácido provoca diminuição do pH intracelular e inibe enzimas e micro-organismos (Lin et al., 1995).
O propionato de cálcio (E282) apresenta um pka de 4,8. Nesta condição de pH, 50% das moléculas estão na forma dissociada e 50% na forma não dissociada. Dessa forma, um controle do pH na massa é de extrema importância para alcance efetivo da ação fungiostática. São utilizados para controle de fungos deteriorantes e também contra bactérias causadoras do “rope” em pães (B. subtilis) (Smith et al., 2004). Apesar da eficácia na utilização do propionato de cálcio em pães industrializados, algumas espécies de fungos apresentam resistência, mesmo em altas concentrações do conservante, como P. roqueforti, que pode apresentar uma fase lag estendida seguida de multiplicação (Suhr e Nielsen, 2004; Harris et al., 1986). A adição de propionato de cálcio nos pães em concentração de 0,3% e pH 4.5 apresenta ação de controlar uma ampla faixa de fungos deteriorantes em pães. Entretanto, em concentrações sub-ótimas, há estímulo do crescimento de algumas espécies, em pH próximo a 6,0 e consequentemente não há controle para espécies como P. paneum., P. roqueforti, E. repens e P.verrusocum (Arroyo, 2003; Arroyo et al., 2005).
O ácido sórbico em sua forma de sal (cálcio e potássio), tem sido utilizado pelas indústrias de panificação na forma de spray sobre a superfície do pão imediatamente após assamento ou antes de serem embalados (Blackburn, 2006). Sorbatos apresentam maiores efeitos adversos (Legan, 1993) e seu espectro de ação possui eficiência contra leveduras, fungos, e pouca ação contra bactérias. Ácido sórbico e sorbato de potássio são agentes antifúngicos efetivos em valores de pH até 6,0. Assim como propionatos, sua ação aumenta com a diminuição do pH. Em comparação ao propionato, o sorbato tem se mostrado ser duas vezes mais efetivo no controle de fungos em pães (Smith et al., 2004). Entretanto apresenta efeito adverso na atividade das leveduras e consequente redução do volume dos pães. A fim de não inibir o efeito das leveduras na fermentação dos pães, o sorbato tem sido aplicado de várias maneiras, na forma encapsulada, spray na superfície do pão, ou incorporado no interior de material de embalagem (Smith et al., 2004). Seu uso, assim como propionato, está muito relacionado ao valor de pH do pão. O uso de sorbato de potássio em concentração de 0.3%, pH 4,5 e AW 0,93-0,97 mostrou controle efetivo em diversas espécies de fungos deteriorantes, com exceção do P. roqueforti. Em condições de menor acidez (pH 6,0), nenhum controle foi
observado (Guynot et al., 2002). A avaliação de diferentes concentrações de benzoato, sorbatos e propionatos em produtos de panificação, mostrou que o sorbato de potássio é o mais efetivo na prevenção de deterioração fúngica na concentração máxima utilizada (0,3%), independente do valor de AW. Para a mesma concentração, mas com um aumento do pH de 4,5 para 5,5, o conservante foi efetivo somente em reduzido valor de Aw. O mesmo foi observado para os conservantes propionato e sorbato, na concentração máxima permitida (Guynot, Ramos e Marin, 2005). O uso de propionato de cálcio no limite máximo, combinado com valores de pH até 4,8, e Aw até 0,97, inibiou totalmente o crescimento fúngico por um período de duas semanas, com exceção de P. roqueforti, P. commune e E. rubrum. Além disso, o crescimento da espécie P. roqueforti foi estimulado pela presença de propionato (Suhr e Nielsen, 2004).
Além da influência do valor de pH, os conservantes também tem sua eficiência reduzida devido à presença de elevado número de esporos de fungos. Apesar de seu efeito antifúngico, o uso de conservantes não pode ser utilizado para substituir boas práticas de fabricação (Smith et al., 2004).
Devido a preocupação do consumidor em relação à redução do uso de conservantes químicos em produtos alimentícios, faz-se necessária uma abordagem que inclua o efeito da concentração do conservante em relação a outros parâmetros intrínsecos como atividade de água e pH, ou seja, parâmetros que influenciam a eficácia do uso de conservantes químicos em produtos de panificação (Membré et al., 2001; Guynot et al., 2005, Marín et al., 2002, Suhr e Nielsen , 2004).
2.1.3. Outros aditivos
A acidez dos pães e redução do pH para alcance de valores entre 5,0 e 6,0 é alcançada após fermentação, como também pela adição de acidulantes, ácidos orgânicos (cítrico, láctico, ácido acético) ou culturas de bactérias lácticas (Smith et al., 2004). O uso de ácido acético (E260) se estende também a ação de conservante e apresenta vantagens em relação aos ácidos propiônicos e sórbicos, devido a seu baixo custo, e baixa toxicidade, além de ser considerado pelos consumidores como conservante natural (Blakcburn, 2006). Não há nível máximo permitido para adição de ácido acético, sendo seu uso portanto limitado a níveis que não interfiram nas características sensoriais do pão, como alteração de odor e sabor. Ácido acético e seus sais possuem tanto ação antimicrobiana, como também são utilizados como acidulantes, agentes flavorizantes e sequestrantes. Assim como a maior parte dos
conservantes, ácido acético e seus sais apresentam melhor efeito em pH até 6,0 e apresentam maior atividade contra bactérias e leveduras do que fungos. São menos efetivos, quando comparados em % (massa/massa) no controle de fungos deteriorantes do que ácido propiônico ou ácido sórbico (Blackburn, 2006), sendo necessário uma concentração 50 vezes maior do que a do ácido sórbico para mesmo efeito antifúngico em espécies do gênero Aspergillus, por exemplo (González et al., 2015; Stratford, 2009).
2.2 Efeito da estocagem
2.2.1 Temperatura
A temperatura desempenha um papel dominante na germinação de esporos e multiplicação de fungos, e é considerado o segundo fator de maior impacto na multiplicação de fungos. Interações entre temperatura e atividade de água apresentam também significante efeito na multiplicação de fungos (Abellana et al., 2001;Samapundo et al., 2005; Panagou et al., 2010; Dagnas et al., 2014). A temperatura de estocagem tem efeito no tipo de fungo que irá se multiplicar nos pães. Em temperaturas de refrigeração (0-5°C), há predominância de algumas espécies dos gêneros Penicillium e Fusarium, enquanto em temperaturas mais elevadas pode haver predominância de fungos dos gêneros Aspergillus e Eurotium (Pitt e Hocking, 2009). Estudos que incluam possíveis flutuações na temperatura de estocagem em combinação com outros fatores em produtos de panificação tem sido descritos (Abellana et al., 2001; Gougouli e Koutsoumanis, 2010; Huchet et al., 2013; Kalai et al., 2014, Dagnas et al., 2014 ).
2.2.2 Atmosfera
Os fungos relacionados à deterioração de alimentos são estritamente aeróbios (Walker e White, 2005). Entretanto, alguns fungos como P. roqueforti e Mucor plumbeus, são capazes de se multiplicar em atmosfera com concentrações de oxigênio tão baixas como 0,5% (Taniwaki, 2009) ou 2% (Samapundo et al., 2007). A redução da concentração de oxigênio na embalagem de pães deve ser combinada com o efeito tóxico de outro composto, como dióxido de carbono ou nitrogênio (Smith et al., 1986). O uso de atmosfera modificada (MAP) tem sido utilizado em estudos de extensão de vida útil em diversos produtos de panificação, como no pão branco (Rodríguez et al., 2000), pão de centeio (Nielsen e Rios, 2000) e pão de soja (Fernandez et al., 2006). A interação entre os fatores pH, atividade de água e dióxido de carbono (CO2) foram estudadas no crescimento de sete espécies deteriorantes em bolos
(Guynot et al., 2003). A variação dos níveis de atividade de água de 0,80 a 0,90 apresentou efeito significativo no crescimento fúngico. Em níveis de AW de 0,85, as fases lag aumentaram de duas vezes com o aumento da concentração de CO2 de 0 a 70%. Níveis de 100% de CO2 não apresentaram crescimento fúngico obervado após 28 dias de incubação a 250C, independente do valor de AW (Guynot et al., 2003). Pães integrais enriquecidos com cálcio foram avaliados pela presença de atmosfera modificada (60% CO2, 40% N2). O produto permaneceu aceitável após 24 dias inbubados a 200C, sem alterações microbiológicas, mas com decrescente alteração na qualidade sensorial (Fik et al., 2012).
O uso combinado de vapor de etanol e absorvedores de oxigênio tem sido utilizado em estudos de extensão de vida útil de produtos de panificação (Del Nobile et al., 2003; Latou et al., 2010). O uso de etanol durante processo de fabricação de pães pode ser incorporado diretamente no produto na forma de spray sobre a superfície ou no head-space da embalagem na forma de vapor (Latou et al., 2010; Dao e Dantigny, 2011). O efeito inibidor do etanol está relacionado às etapas de germinação (Dao et al., 2010) e proliferação de fungos (Dantigny et al., 2005b). O etanol pode causar a paralisação ou retardamento do crescimento através da destruição das membranas celulares (Ingram, 1989). A concentração mínima de etanol estimada para que não ocorra nenhum crescimento de fungos é de aproximadamente 4% para Penicillium chrysogenum e de 3-5% para grande parte dos fungos (Dantigny et al., 2005b).
Mais recentemente, o uso de embalagens ativas, contendo em seus filmes antifúngicos naturais, como óleos essenciais e/ou temperos tem sido alvo de estudos. A ação antifúngica pode acontecer tanto com o contato direto da embalagem com o produto, quanto pela fase de vapor no interior da embalagem, através da liberação de compostos voláteis (da Cruz Cabral et al., 2013, Matan et al., 2006; Ojagh et al 2010). Esta abordagem tem sido estudada em combinação com outros fatores, como temperatura, atividade de água, para alcance de maior estabilidade microbiológica dos produtos alimentícios suceptíveis a deterioração fúngica (Manso et al., 2015).
Em condições de umidade relativa inferior a 90%, a multiplicação de fungos na casca do pão não irá ocorrer (Cauvain e Young, 2007). Além disso, em ambientes de baixa umidade, as superfícies dos pães fatiados podem desidratar antes do crescimento visível do fungo. Em condições de alta umidade, entretanto, os fungos irão se multiplicar rapidamente, principalmente em pães embalados (Boey et al., 2001).
2.3 Efeito do processamento
As etapas pós forneamento (resfriamento, corte e embalagem) são as principais fontes de contaminação de esporos fúngicos no interior da indústria. A superfície do equipamento de corte apresenta alto risco, uma vez que pode acumular substratos para o crescimento de fungos. A etapa de resfriamento deve ocorrer em tempo suficiente para que o produto adquira textura adequada apropriada ao corte e não seja embalado ainda quente e com isso, evitar a condensação no interior da embalagem, condições ideais para a proliferação de fungos. Além disso, pães fatiados apresentam mais superfícies expostas à contaminação.
A contaminação por fungos após etapa letal do processo (forneamento) pode ser reduzida através da separação das instalações de produção e estocagem, utilização de ar filtrado nas áreas de embalagem e resfriamento, eficiente sistema de limpeza de equipamento de corte e das boas práticas de fabricação (ICMSF, 2005). Alguns métodos sugeridos para inativação de contaminantes microbianos das indústrias de pães incluem: aplicação de luz ultravioleta, radiação infravermelha, aquecimento por micro-ondas, baixas doses de irradiação, tecnologia de luz pulsada e alta pressão. Entretanto, o uso destas técnicas apresenta limitações como alto custo, utilização de embalagem específica (ótimas propriedades termoplásticas), problemas de condensação na embalagem, entre outros (Blackburn, 2006, Smith et al., 2004), sendo, portanto, de pouca aplicação nas indústrias de panificação.
PARTE 3: MICROBIOLOGIA PREDITIVA COMO FERRAMENTA PARA ESTUDOS DE PARÂMETROS QUE AFETAM A VIDA DE PRATELEIRA DOS PÃES INTEGRAIS MULTIGRÃOS
3.1 Definição
A microbiologia preditiva é um campo de estudo que combina elementos de microbiologia, estatística e matemática, com a finalidade de desenvolver modelos matemáticos que descrevam e permitam predizer o comportamento de micro-organismos sob condições ambientais prescritas (incluindo variações) (McMeekein, 2002; Jagannath et al., 2003). Desta forma, os modelos preditivos, uma vez validados, podem ser utilizados para predizer com rapidez e segurança a resposta dos micro-organismos sob várias condições, dentro da faixa de valores pré-estabelecidos para cada variável.
O comportamento microbiano em alimentos (multiplicação, sobrevivência e morte) é determinado pelas propriedades do alimento (atividade de água, pH, potencial de
