Modelagem probabilística cresce/não cresce

As respostas de crescimento obtidas em 4, 8, 12 e 21 dias, foram transformadas em probabilidade de crescimento. A partir de 4 dias observou-se, de maneira geral, os primeiros sinais de micélios visíveis, após 8 dias pode-se perceber o aumento no número de formulações onde houve crescimento em relação as que inibiram o crescimento. O período de 12 dias representa a vida útil comumente associada aos pães integrais multigrãos. Entre 8 e 12 dias pôde-se observar as interfaces de crescimento/não crescimento. Já o período de 21 dias, que representa quase duas vezes a vida útil desses produtos, foi selecionado para observar se alguma das formulações/condições inibiriam o crescimento das espécies deste estudo.

Cada valor de probabilidade foi obtido através de distribuições binomiais (0-1) (Skandamis et al., 2013), utilizando-se a resposta do conjunto das 6 replicatas. Dados de probabilidade foram então modelados pelo uso de regressão logística em função das variáveis de estudo. A equação do modelo de regressão logística secundário incluindo 16 termos está representada na Equação 3.

(3)

onde é a probabilidade de crescimento ou não crescimento da espécie em função do tempo (0-1), é a temperatura, , o valor de atividade de água, pH , o valor de pH, o valor da concentração (%) do conservante propionato de cálcio e , são os coeficientes que serão estimados para cada termo. A equação foi ajustada utilizando o método de regressão logística no software Statistica 7.0. A seleção de variáveis foi feita pelo método backward stepwise, disponível em regressões lineares. As variáveis foram selecionadas utilizando-se ρ<0,05 para fatores estatisticamente significativos na variável resposta.

2.8 Análises estatísticas

Os resultados foram estatisticamente comparados utilizando-se o software Statistica 7.0 para verificação de diferenças entre médias de valores utilizando-se testes de Tukey entre: Aw das fatias de pães no início e fim dos experimentos; entre valores de taxa de multiplicação em função da temperatura, para mesma espécie e t-student entre: taxas de multiplicação entre as espécies para mesmo valor de Aw e temperatura, com valores de probabilidade ρ<0,05 considerados significativos.

3. Resultados

Os valores médios de atividade de água alcançado ao fim do experimento e seus respectivos desvios estão apresentados na Tabela 2 para cada temperatura. De acordo com os resultados, não houve diferença significativa (ρ>0,05) entre os valores de atividade de água (início e fim) nos pães com AW 0,93 e 0,94 a 300C, 0,96 a 250C e em pães com AW 0,95, em todas as temperaturas.

INSERIR TABELA 2

Dados de medidas de diâmetro das colônias (mm) de Penicillium paneume Paec.

variotii nos pães integrais multigrãos foram obtidos após observação de micélio visível (>3mm) durante até 14 dias seguidos, tempo médio associado a vida útil desses produtos. e foram plotados em função do tempo. As curvas de crescimento apresentaram, no geral, uma fase linear, e em condições próximas a ótima de crescimento, uma assíntota superior, indicando o alcance do limite da placa (50mm).

Após ajuste do modelo de Baranyi obteve-se curvas de crescimento com R2>0,98. Os valores de  estimados para P. paneum e Paec. variotii em função da atividade de água e temperatura estão apresentados na Tabela 3. Com exceção da formulação 1, onde não houve crescimento de Paec. variotii em nenhuma das temperaturas após 14 dias e das formulações 4 a 20oC e 10 a 300C, o limite de crescimento (diâmetro da placa de 50 cm) foi alcançado em até 10 dias. Já para C1 esse limite foi também alcançado em período < 14 dias, com exceção das formulações 1, 2 e 3 a 300C.

A Figura 1 apresenta o comportamento de P. paneum em pães com atividade de água de 0,95, pH 5,1, 0,6% de conservante. A 250C, P. paneum apresentou a mais alta taxa de

crescimento nesta formulação, de 7,26 mm.dia-1 e a presença de assíntota após 8 dias. A 200C apresentou comportamento similar, e taxa de 6,14 mm.dia-1 e a 300C, teve crescimento desacelerado, e uma taxa de crescimento de 3,2 mm.dia-1 (Figura 1).

INSERIR FIGURA 1

De acordo com os resultados obtidos, valores de  para P. paneum foram afetados estatisticamente pela temperatura (ρ<0,05), principalmente em valores de atividade de água mais elevados (AW > 0,93). O aumento da temperatura ocasionou redução no crescimento de P. paneum nos pães integrais. Valores médios de  variaram de 3,12 mm.dia-1 a 0,96/300C a 5,97mm.dia-1 a 0,96/250C. Semelhantemente, Paec. variotii teve suas taxas de multiplicação influenciadas pela temperatura (ρ<0,05) com o aumento de atividade de água e apresentou mais rápido crescimento micelial com o aumento da temperatura (300C). Esta espécie apresentou valores médios de taxa de crescimento entre 3,59 mm.dia-1 a 0,94/200C a 5,32 mm.dia-1 a 0,96/300C. Valores de  entre as espécies P. paneum e Paec. variotii foram estatisticamente diferentes em pães com AW 0,93 a 200C e a 250C; 0,95 para todas as temperaturas; e 0,96 a 300C (ρ<0,05) (Tabela 3). As taxas de crescimento de cada espécie em função da atividade de água não foram estatisticamente diferentes (ρ>0,05) (dados não mostrados).

INSERIR TABELA 3

Respostas de crescimento/não crescimento foram obtidas para P. paneum e Paec. variotii em pães integrais multigrãos formulados com diferentes valores de Aw, pH e concentração de propionato de cálcio para 4, 8, 12 e 21 dias de incubação, sendo considerado crescimento positivo, as amostras que apresentaram diâmetro de colônia  3mm (Tabela 4).

INSERIR TABELA 4

Durante os 4 primeiros dias após inoculação, P. paneum cresceu em 30% das formulações de pães integrais multigrãos a 250C. Já Paec. variotii cresceu em 19% das formulações neste mesmo período a 300C. Após 8 dias, P. paneum cresceu em 94% das

formulações a 200C e 250C, com exceção das formulações de atividade de água (0,93 e 0,94), baixo pH (5,1) e menor nível de concentração de propionato (0,6%). Já a 300C, os resultados de não crescimento de P. paneum foram de 41, 19 e 8% das formulações para 8, 12 e 21 dias respectivamente (Tabela 4). Diferentemente, Paec. variotiinão cresceu em 64, 39 e 5% das formulações a 200C em 8, 12 e 21 dias, respectivamente. Este fungo teve seu crescimento favorecido com o aumento da temperatura (Tabela 4).

Modelos de regressão logística foram ajustados aos dados de crescimento/não crescimento das espécies P. paneume Paec. variotiiem pães integrais multigrãos em função da temperatura, atividade de água, pH, concentração de propionato e tempo. Após seleção de parâmetros através de regressão pelo método “backward stepwise”, incluiu-se no modelo probabilístico para P. paneum, os parâmetros atividade de água e tempo (lineares), temperatura (quadrático), e as interações entre temperatura e conservante, temperatura e pH e pH e atividade de água (Ρ<0,05) (Equação 4). Já para para Paec. variotii, foram incluídos os parâmetros pH, conservante e tempo (lineares), temperatura e atividade de água (quadráticos), e as interações entre atividade de água e pH, temperatura e pH, atividade de água e conservante (Ρ<0,05) (Equação 5). P. paneum (4) Paecilomyces variotii (5)

Os modelos obtidos apresentaram variância de 49 e 62% para P. paneume Paec.

variotii, respectivamente. O bom ajuste dos modelos foi avaliado pela razão de verossimilhança (Tabelas 5 e 6). O nível de concordância entre respostas observadas e predita foi de 93,7% para P. paneum e 89,6% para Paec. variotii. No geral, modelos obtidos apresentaram falhas na predição de 9,6% e 20,4% nas respostas de P. paneum e Paec. variotii, respectivamente. Para obtenção destes índices considerou-se como crescimento positivo os

valores preditos com probabilidade Ρ>0,5. Os parâmetros obtidos para as duas espécies e os respectivos índices de ajuste dos modelos estão apresentados nas tabelas 7 e 8.

INSERIR TABELAS 5, 6, 7 E 8

Valores de Hosmer-Lemeshow e seus correspondentes valores p foram utilizados para verificar possível falta de ajuste dos modelos. Os valores de 54 e 37 para P. paneum e Paec. variotii, respectivamente apresentaram ρ<0,05.

Para obtenção de predições de probabilidade de crescimento (valores entre 0 e 1) de P. paneum ou Paecilomyces variotii em pães integrais, utilizou-se a equação 6, substituindo-se pelos modelos secundários de regressão logística preditos (Equações 4 e 5).

(6)

Os valores de probabilidade de crescimento de P. paneum nos pães integrais multigrãos variaram entre 0,46 e 0,80. Como expresso pelo modelo obtido, o parâmetro que mais afetou a positivamente a probabilidade de crescimento de P. paneum nos pães foi a atividade de água (ρ<0,05), seguido do efeito negativo da interação da atividade de água com o pH (ρ<0,05). As interfaces de crescimento/não crescimento de P. paneumnessa matriz está relacionada à combinação de menores valores de atividade de água ( 0,94), de pH (5,1) e de propionato (0,6 %), onde o crescimento foi inibido e obteve-se as menores probabilidades de crescimento (Ρ<0,6), como observado após 8 dias de estocagem dos pães a 200C (Figura 2). Esta formulação, entretanto, foi mais estável (Ρ<0,6) após 12 dias somente a 300C (Figura 3). As maiores probabilidades de crescimento (Ρ>0,6), entretanto, foram observadas em pães com valores mais elevados de atividade de água Aw 0,95, pH 5,5, maior concentração de

propionato (1%) e estocados a 250C. A temperatura, em combinação com outros parâmetros

intrínsecos (pH e propionato), também foi estatisticamente significativa (ρ<0,05) na resposta de crescimento de P. paneum.

INSERIR FIGURA 2 E 3

Os valores de probabilidade de crescimento de Paec. variotii variaram entre 0,34 e 0,76. O crescimento de Paec. variotii foi fortemente influenciado pelo pH e pela concentração de propionato (ρ<0,05). Formulações com menor concentração de propionato (0,6%) e mais baixo valor de pH (5,1) resultaram em menor probabilidade de crescimento

(Ρ<0,5) de Paec. variotii e estão na interface onde o crescimento não ocorreu como observado na Figura 4, após 12 dias de estocagem a 250C. A interação entre a atividade de água pH e propionato também apresentou forte influência nos resultados (ρ<0,05). Valores mais baixos de probabilidade (Ρ<0,5) foram também preditos para pães em formulações com 0,6% de propionato, pH 5,1 e com valores de atividade de água Aw 0,95, como apresentado na Figura 5, após 12 dias de estocagem a250C. As mais altas probabilidades de crescimento (Ρ>0,5) de Paec. variotii foram obtidas para os pães com valores de atividade de água elevados (Aw 0,95), pH 5,5, maior concentração de propionato (1%) e estocados a 300C.

INSERIR FIGURAS 4 E 5 4. Discussão

Apesar da preocupação por parte das indústrias e estabelecimentos em se alcançar maior estabilidade microbiológica de produtos de panificação, faltam dados e estudos que abordem a probabilidade de crescimento de espécies fúngicas deterioradoras em pães. Além disso, a maior parte dos estudos de modelagem preditiva não abordam de forma específica as características e níveis dos parâmetros intrínsecos relacionados a esses produtos e não incluem, em sua maioria, a influência de conservantes, importante barreira tecnológica.

As faixas dos parâmetros utilizados neste estudo foram selecionadas de acordo com os valores comumente encontrados em pães (Legan, 1993; Smith et al., 2004; Santos et al., 2015a) e que podem ser atingidos durante processamento, através de reformulações e/ou por alteração em parâmetros de processos, como tempo de fermentação e tempo e temperatura de forneamento.

A redução de atividade de água pode ser alcançada pela adição de diferentes solutos com alta atividade osmótica como açúcar, sal ou poli-álcoois, incorporados diretamente nos pães (Smith et al., 2004), como também por alterações de parâmetros de processo. Entretanto, essa redução com foco no controle de crescimento fúngico, deve considerar, os efeitos adversos na qualidade e aceitação sensorial dos pães, como acidez muito pronunciada e perda de maciez.

A elevada influência da atividade de água na probabilidade de crescimento de P. paneum e Paec. variotii nos pães está relacionada a importância desta variável nas etapas de germinação de esporos fúngicos e na taxas de multiplicação de fungos deteriorantes em alimentos (Garcia et al., 2010; Huchet et al., 2013; Burgain et al., 2013; Dagnas et al., 2014). A redução no valor da atividade de água leva a um decréscimo da germinação e multiplicação

dos fungos até uma taxa mínima, onde estes fenômenos não são observados. Valores de atividade de água das fatias de pães (0,93-0,96) ao final do experimento (21 dias) apresentaram em geral, baixos desvios (<0,004) e não apresentaram diferença significativa (ρ>0,05) em 50% dos casos (Tabela 2).

O bom ajuste dos modelos obtidos aos dados experimentais foi representado pelo elevado grau de concordância entre os valores preditos e observados, através da razão de verossimilhança para P. paneum (93,7%) e Paec. variotii (89,6%). Valores obtidos pelo teste de Hosmer-Lemeshow foram elevados, indicando que os dados não foram muito bem descritos pelos modelos (ρ<0,05). Entretanto, apesar de ser amplamente utilizado como um dos principais índices de ajuste em modelos de regressão logística, este teste deve ser interpretado com cautela pois os resultados podem ser influenciados por má predição de resultados individuais, além de não indicar a dimensão dos desvios (Bewick et al., 2005).

A influência mais pronunciada da atividade de água na probabilidade de crescimento de P. paneum em relação a Paec. variotii pode estar relacionada a maior resistência de Paec. variotii a baixos valores de atividade de água (>0,80) (Pitt e Hocking, 2009). Entretanto, o crescimento de P. paneum poderá ocorrer em formulações de pães com valores de atividade de água menores ou iguais a 0,93, em combinação com pH mais elevados (pH>5,3). Semelhante efeito foi observado em estudo de crescimento de Penicillium roqueforti em AW 0,92 em combinação a valores de pH (5-8) (Valík et al., 1999).

A influência da temperatura nas probabilidades de crescimento das duas espécies foi predominantemente combinada com outros fatores significativos, como pH e propionato (ρ<0,05). A temperatura desempenha importante papel na germinação de esporos e multiplicação de fungos, sendo considerada o segundo fator de maior impacto na multiplicação de fungos, depois da atividade de água (Samapundo et al., 2005; Gougouli e Koutsoumanis, 2010; Gougouli et al., 2011; Dagnas e Membré, 2013). As taxas de multiplicação de P. paneum e Paec. variotii em pães integrais foram dependentes da temperatura e foram mais elevadas em condições próximas às das temperaturas ótimas de crescimento, de 20-250C para P. paneume 350-400C para Paec. variotii(Samson e Frisvad, 2004; Pitt e Hocking, 2009). Essas condições resultaram em mais rápido crescimento micelial e consequentemente, mais rápida deterioração dos pães. As flutuações de temperatura durante estocagem dos pães (temperatura ambiente de regiões tropicais) podem, portanto favorecer o crescimento destas espécies deteriorantes. Entretanto, uma vez que a temperatura não é um fator controlado durante a comercialização dos pães, outros parâmetros intrínsecos devem ser foco de atenção para obtenção de formulações mais robustas.

A redução do pH a níveis próximos a 5,0 em combinação com baixos níveis de propionato (0,6%), contribuiu em quase todas as condições, a um atraso no aparecimento de micélio visível. Apesar do pH não apresentar um efeito direto na germinação (Sautour et al., 2001) ou na proliferação do micélio (Wheeler et al., 1991), este parâmetro pode apresentar efeitos indiretos, como o impacto na microbiota bacteriana competitiva e na proporção entre as formas dissociada e não dissociada de ácidos orgânicos (Sofos e Busta, 1991). O efeito deste parâmetro no crescimento de espécies fúngicas tem sido descrito em diversos estudos (Guynot et al., 2002; Gock et al., 2003; Guynot et al., 2005). Através de recente estudo do efeito antifúgico de ácido orgânicos como ácido sórbico e ácido acético observado em fungos do gênero Aspergillus, foi observado que após um acréscimo de 0,5 no valor do pH foi necessário o uso do dobro da concentração dos ácidos para inibição do crescimento fúngico (González et al., 2015), o que reforça a importância da combinação entre esses parâmetros para alcance de maior estabilidade do produto.

A germinação e o aparecimento de micélios visíveis das duas espécies foi estimulado pelo aumento da concentração de propionato de cálcio, conservante mais comumente utilizado nas indústrias de panificação. A ácido-tolerância de P. paneum ocorre devido a sua capacidade em utilizar ácidos como fonte de carbono e ao efeito simbiótico com bactérias láticas e leveduras ácido-tolerantes (Samson et al., 2002; Samson e Frisvad, 2004). A capacidade desta espécie em crescer em concentrações de até 1% de ácido propiônico, 0,5% de ácido acético e 50 ppm de ácido sórbico/benzóico (Samson e Frisvad, 2004), reforça sua importância como espécie representativa na deterioração de pães. Além disso, P. paneum e Paec. variotii são capazes de tolerar baixos níveis de oxigênio presentes no interior das embalagens (Samson e Frisvad, 2004; Pitt e Hocking, 2009). O estímulo do crescimento, devido ao aumento da concentração de conservante foi também observado no crescimento de P. roqueforti em pães de centeio (Suhr e Nielsen, 2004), e no crescimento de espécies P. paneum., P. roqueforti, Eurotium repens e Penicillium verrusocum em concentrações subótimas de propionato de cálcio em pH próximo a 6,0 (Arroyo, 2003; Arroyo et al., 2005).

Através dos resultados, observou-se que os pães integrais multigrãos são excelentes substratos para o crescimento das duas espécies. As condições ótimas (Aw 0,95 e temperatura ótima de crescimento de 250C e 300C para P. paneum e Paec. variotii, respectivamente), favoreceram também as maiores taxas de crescimento: P. paneum (8,15 mm.dia-1) em pães com Aw 0,96 estocados a 250C e Paec. variotii(7,48 mm.dia-1) em pães com AW 0,96 estocados a 300C. Esses valores podem ser comparados a taxas estimadas em condições de elevada atividade de água (Aw>0,98), 250C em meios sintéticos, como valores

de 6,48 mm.dia-1 e 7,39 mm.dia-1 para P. paneume Paec. variotii, respectivamente (Rosso e Robinson, 2001) e taxas > 7 mm.dia-1 em DG-18 para as duas espécies (Santos et al., 2015b).

O aumento da vida útil dos pães, como os integrais multigrãos, é um dos grandes desafios das indústrias de panificação. O inóculo utilizado neste estudo, de 102-103 esporos (5l de 105 conídios/mL), foi estipulado, a fim de simular uma provável contaminação que pode ocorrer nos pães após etapa de processamento e antes da embalagem e representa também, a concentração comumente utilizada em challenge tests (Services, 2001). Entretanto, este inóculo, mesmo sendo baixo, pode superestimar uma real contaminação dentro do ambiente industrial. Além disso, o período total de experimento de 21 dias representa o dobro do período comumente estabelecido para a vida de prateleira de pães integrais multigrãos. Como pôde ser observado no rápido crescimento e aparecimento de P. paneum e Paec. variotii (< 4 dias) em fatias de pães que apresentavam condições ótimas (AW 0,96 e temperaturas ótimas) para a germinação e crescimento desses fungos.

As observações de não crescimento após 21 dias de estocagem, em 6 condições (AW 0,93, pH 5,1, e 0,6% de propionato a 200C, 250C e 300C; AW 0,94 pH 5,1 0,6% de propionato a 200C, 250C e 300C) de pães inoculados com Paec. variotii em 3 condições (AW 0,93, pH 5,1, 0,6% de propionato; AW 0,93, pH 5,1, 0,8% de propionato; 0,96; pH 5,3 e 0,6% a 300C) para P. paneum (tabelas suplementares 1 e 2), reforça a importância da utilização de formulações mais estáveis, como barreira tecnológica frente aos fungos, limitantes para a vida de prateleira de pães.

Modelos de regressão logística oferecem a possiblidade de incluir respostas de não crescimento, que podem ser de grande utilidade quando se pretende evitar a ocorrência de um evento, como o crescimento e aparecimento visível de micélios, limitante para a vida de prateleira dos pães. Os modelos obtidos, uma vez validados, poderão ser utilizados como ferramentas para simular o efeito de alterações dos parâmetros das formulações dos pães integrais multigrãos. Além disso, informações obtidas das condições onde não houve crescimento, ou o crescimento foi retardado, atividade de água (0,93), pH (5,1) e propionato de cálcio (0,6%) podem ser úteis para o desenvolvimento de formulações mais estáveis, em combinação com outros fatores, como as características sensoriais dos produtos e embalagens adequadas. Devido à demanda dos consumidores por alimentos mais saudáveis e livre de conservantes químicos, e, à menor probabilidade de crescimento de cepas representativas, na mais baixa concentração de propionato de cálcio (0,6%), faz-se necessária a investigação da combinação da redução na concentrações de conservantes químicos, como propionato e sorbatos em combinação a outras barreiras tecnológicas tecnológicas no crescimento dessas

espécies fúngicas.