Considerações finais

O entendimento dos mecanismos que permitem a adaptação de patógenos intracelulares ao ambiente inóspito do interior de fagócitos mostra-se essencial para o conhecimento dos processos pelos quais esses microrganismos estabelecem a infecção em seus hospedeiros (Jenner & Young, 2005). Dentre estes mecanismo destaca-se a reprogramação transcricional do patógeno em resposta à interação com as células fagocitárias. Nesse sentido, comparamos a resposta transcritômica do fungo C.

neoformans recuperado do interior de macrófagos ou amebas, uma vez que é sugerido

na literatura que a capacidade desse fungo em sobreviver e se replicar no fagossomo de macrófagos é conseqüência de uma vantagem adaptativa selecionada no ambiente natural de C. neoformans e que lhe confere a capacidade de sobreviver no interior de predadores ambientais, como amebas (Steenbergen et al., 2001). A análise transcritômica em larga escala foi realizada utilizando-se a metodologia de microarranjo de DNA, a qual permite a apreciação simultânea do acúmulo de transcritos de milhares de genes, podendo fornecer uma compreensão global da resposta do patógeno à interação com o fagócito.

Os dados descritos no presente trabalho demonstraram que 6h de interação de C.

neoformans com a ameba A. castellanii e com macrófagos murinos resultaram na

modulação de 656 e 293 genes, respectivamente. De um modo geral, a internalização de

C. neoformans por ambos fagócitos resulta na reprogramação metabólica do fungo,

ativando vias importantes na adaptação a ambientes privados de nutrientes e oxigênio. Além disso, genes envolvidos na resposta a diferentes tipos de estresse, tais quais estresses oxidativo/nitrossativo, térmico e osmótico, tiveram sua expressão regulada positivamente. Esses dados reforçam a idéia do fagossomo como um microambiente hostil para a sobrevivência de patógenos, cujas principais características são hipóxia, carência nutricional, e presença de espécies reativas de oxigênio/nitrogênio. Em contrapartida, genes relacionados à maquinaria de transcrição e tradução foram, de um modo geral, regulados negativamente pelo fungo em resposta à fagocitose, sugerindo a repressão desses processos em resposta a situações de estresse como uma possível forma de poupar energia enquanto as células se adaptam ao ambiente intracelular (Brown et al. , 2007). Genes que codificam fatores de virulência de C. neoformans importantes para o estabelecimento da infecção em hospedeiro mamífero foram induzidos após fagocitose do fungo por amebas, corroborando a hipótese de que alguns atributos de virulência de C. neoformans foram selecionados e vêm sendo mantidos ao

longo da evolução. Por fim, especula-se que as diferenças observadas durante os experimentos de cinética de internalização de C. neoformans por amebas e macrófagos podem resultar em diferenças no perfil de modulação de alguns genes. Por exemplo, uma vez que a fagocitose mediada por macrófagos ocorre muito rapidamente quando comparada à fagocitose mediada por amebas, alguns genes de C. neoformans cuja expressão está sendo modulada no tempo de 6h de interação com A. castellanii podem ter tido sua expressão regulada mais precocimente em virtude do evento de internalização do fungo pelo macrófago já ter ocorrido mais cedo. Nesse sentido, sugerimos a relevância da análise da resposta transcritômica de C. neoformans após outros tempos de interação com macrófagos e amebas.

Vale notar que, dos 293 genes de C. neoformans cuja expressão foi modulada em resposta à interação com macrófagos, 38% também tiveram sua expressão alterada quando da interação com amebas. Partindo-se da premissa de que as diferenças nos níveis de transcritos observadas possuam significância biológica, podemos presumir que genes de C. neoformans que apresentaram a expressão modulada de forma similar quando da internalização por amebas e macrófagos são potencialmente importantes para a sobrevivência intracelular desse patógeno. Nesse contexto, avaliamos a importância de um gene, que codifica um transportador de açúcar cuja expressão foi drasticamente aumentada quando da interação de C. neoformans com ambos os fagócitos. Nossos resultados preliminares confirmam o papel desse gene, envolvido no transporte de manitol e outros polióis, na virulência de C. neoformans. Ainda, outros genes diferencialmente expressos identificados no presente trabalho estão potencialmente relacionados ao estabelecimento da infecção por este patógeno, sendo, dessa forma, futuros alvos de estudo.

É importante ressaltar que os dados gerados por experimentos de microarranjo de DNA apenas indicam o acúmulo de transcritos de um determinado gene em resposta a uma dada condição de estudo, devendo portanto serem interpretados com cautela. Isso porque em eucariotos existem várias etapas de regulação da expressão gênica, que variam desde as modificações na cromatina, à síntese do transcrito primário e seu processamento, até a regulação da síntese protéica e as modificações pós-traducionais (Lehninger et al., 2000). Dessa forma, embora os resultados aqui obtidos forneçam uma idéia aproximada do estado metabólico de C. neoformans em resposta à fagocitose por amebas e macrófagos, para alguns genes é possível que não haja uma correlação direta

por exemplo, que a relação entre transcrição e tradução nem sempre é linear, podendo variar de acordo com o processo biológico em questão (Ideker et al., 2001; Griffin et al. 2002; Beyer et al. 2004). As melhores correlações quanto ao acúmulo de mRNAs e proteínas foram verificadas para genes envolvidos no metabolismo e na síntese protéica, indicando que os mesmos são preferencialmente regulados em nível transcricional (Beyer et al. 2004).

Em suma, o presente trabalho forneceu dados importantes para o melhor entendimento dos mecanismos de origem e manutenção de fatores de virulência por patógenos oportunistas de vida livre. Esses estudos possibilitam ainda a definição de potenciais alvos terapêuticos e poderão contribuir no desenho de novas estratégias para o tratamento da criptococose.

PERSPECTIVAS

PERSPECTIVAS

Como perspectivas futuras desse trabalho podemos citar:

1. Analisar os principais efeitos do farnesol na expressão diferencial de genes de P. brasiliensis.

2. Avaliar a ação do farnesol no combate à PCM em modelo murino de infecção.

3. Verificar a ação do propranolol na formação de biofilmes de C. albicans in

vivo em modelo murino de infecção .

4. Verificar a ação do propranolol na formação de biofilmes de outros patógenos.

5. Analisar a resposta transcricional de C. neoformans em outros tempos de interação com amebas e macrófagos.

6. Repetir os experimentos de infecção animal com a linhagem mutante M1 de

C. neoformans, utilizando também a linhagem mutante reconstituída.

7. Avaliar o papel de outros genes de C. neoformans cuja expressão foi modulada quando da interação do fungo com amebas e/ou macrófagos no estabelecimento da infecção em hospedeiro animal.