Efeito do propranolol na formação de biofilmes de C albicans

Sabendo-se que o propranolol inibe o desenvolvimento de tubos germinativos em C. albicans (Figura 10), e que o biofilme maduro é composto por uma mistura de formas morfológicas, o que inclui leveduras, pseudohifas e hifas, (Kojic & Darouiche, 2004), iniciamos experimentos visando avaliar o papel do propranolol na formação de biofilme de C. albicans. Nossos resultados mostraram que a adição de SFB induz a formação de biofilme, como era esperado. Entretanto, a adição de propranolol reverte o

efeito do SFB, inibindo significativamente o desenvolvimento do biofilme de C.

albicans, como mostrado em ensaios com MTT (Figura 11). Vale ressaltar que as

concentrações de propranolol utilizadas não afetam o crescimento de C. albicans (dados não mostrados). Esses resultados foram corroborados por experimentos de microscopia eletrônica de varredura (MEV), os quais evidenciaram que a adição de propranolol diminui, de maneira dose-dependente, a formação de biofilmes em catéteres (Figura 12). Como observado na figura 12, a adição de propranolol altera a estrutura tridimensional do biofilme, o qual, com o aumento na concentração de propranolol, apresenta camadas reduzidas formadas por poucas leveduras e células alongadas.

Figura 11. Efeito do propranolol na formação de biofilme de C. albicans. A avaliação do efeito do propranolol na formação do biofilme foi realizada pelo ensaio de MTT. C. albicans foi cultivada em placas de 96 poços em diferentes condições por 24 h a 36°C para a formação de biofilme. Posteriormente, o sobrenadante da cultura foi descartado e as células aderidas foram lavadas para a realização o ensaio de MTT, conforme descrito previamente. SFB: Soro Fetal Bovino. PO: Propranolol. Letras diferentes apontam para diferenças estatísticas (P < 0,05).

Figura 12. Inibição da formação de biofilme por células de C. albicans cultivadas em

diferentes concentrações de propranolol por 24h. (A) SFB 20%; (B) SFB 20% + Propranolol

500 µM; (C) SFB 20% + Propranolol 750 µM; (D) SFB 20% + Propranolol 1 mM.

O efeito do propranolol ao longo do processo de formação do biofilme de C.

albicans também foi avaliado. Os resultados mostraram que a adição de 1mM de

propranolol mesmo após 4h do início da formação do biofilme inibe fortemente o desenvolvimento dessa comunidade microbiana, assemelhando-se à inibição observada com a adição de propranolol concomitante ao início de sua formação. Prejuízos significativos ao desenvolvimento do biofilme também foram verificados com a adição de propranolol após 5 e 6h do início de sua formação (Figura 13). No entanto, o efeito inibitório do propranolol torna-se menos evidente, porém estatisticamente significativo, quando da adição desse composto a um biofilme pré-formado por 24h (Figura 14). Estes resultados sugerem que o propranolol interfere, principalmente, nos estágios iniciais da formação do biofilme de C. albicans.

Além da adição de SFB ao meio de cultura, muitas outras condições, como cultivo na presença de N-acetilglicosamina (GlcNAc) e L-prolina (Simonetti et al., 1974; Dabrowa et al., 1976), são indudoras de filamentação em C. albicans e, conseqüentemente, facilitam o desenvolvimento de biofilme. Dessa forma, o efeito do propranolol no desenvolvimento do biofilme de C. albicans mediado por GlcNAc também foi analisado. Embora a formação do biofilme na presença de GlcNAc não tenha sido completamente inibida com a adição de 1 mM de propranolol, como observado para o SFB, a atividade do biofilme mensurada pelo ensaio de MTT foi reduzida em cerca de 25% quando comparado ao controle (sem propranolol), sendo o

resultado estatisticamente significativo (dados não mostrados). Esses dados sugerem que o propranolol tem um potente efeito inibitório no desenvolvimento do biofilme de

C. albicans formado em resposta a diferentes sinais.

Além dos efeitos do propranolol na formação do biofilme, foi avaliada a ação de um segundo beta-bloqueador adrenérgico, o metoprolol. A diferença principal entre esses dois compostos está relacionada à seletividade do receptor beta-adrenérgico. Isso porque existem três diferentes subtipos de receptores !: !1, !2 e !3 (Che et al., 2009). O propranolol é um beta-bloqueador não seletivo, ou seja, ele bloqueia tanto os receptores adrenérgicos !1, encontrados principalmente no miocárdio, quanto os receptores !2, encontrados prilcipalmente no músculo liso de alguns órgãos e em vasos sanguíneos. Já o metoprolol é um beta-bloqueador cardiosseletivo, por atuar apenas nos receptores adrenérgicos !1 (Che et al., 2009). Além disso, o propranolol é mais lipossolúvel que o metoprolol (Dimsdale et al., 1989).

Figura 13. Efeito do propranolol ao longo do desenvolvimento do biofilme de C. albicans. Leveduras de C. albicans foram cultivadas em placas de 96 poços nas diferentes condições experimentas por 24 h a 36°C. Propranolol para uma concentração final de 1 mM foi adicionado após diferentes intervalos de tempo do início da formação do biofilme de C. albicans (0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6h). Posteriormente, o sobrenadante da cultura foi descartado e as células aderidas foram lavadas para a realização o ensaio de MTT, conforme descrito previamente. SFB: Soro Fetal Bovino. PO: Propranolol. Letras diferentes apontam para diferenças estatísticas (P < 0.05).

Figura 14. Efeito do propranolol no biofilme maduro de C. albicans. Leveduras de C.

albicans foram cultivada em placas de 96 poços por 24 h a 36°C. Ao biofilme pré-formado por

24h foi adicionado propranolol para uma concentração final de 0,5, 0,75 ou 1 mM. Posteriormente, o sobrenadante da cultura foi descartado e as células aderidas foram lavadas para a realização o ensaio de MTT, conforme descrito previamente. SFB: Soro Fetal Bovino. PO: Propranolol. Letras diferentes apontam para diferenças estatísticas (P < 0,05).

Os resultados demonstram que, assim como o propranolol, o metoprolol exerce um efeito inibitório na formação de biofilme por C. albicans (Figura 15A). A concentração de 1 mM de metoprolol é suficiente para inibir completamente o desenvolvimento do biofilme, como mostrado na figura 15A. Adicionalmente, o propranolol e o metoprolol atuam de forma sinérgica na inibição do biofilme de C.

albicans, embora o propranolol pareça ser mais efetivo que o metoprolol quando a ação

individual de cada composto é comparada (Figura 15B). Esse maior efeito inibitório do propranolol, observado para concentração de 0,5 mM, deve-se possivelmente a sua maior lipossolubilidade (Dimsdale et al., 1989), o que permite uma melhor penetrabilidade nas células fúngicas.

Figura 15. Efeito do metoprolol na formação de biofilme de C. albicans. A avaliação do efeito do metoprolol na formação do biofilme foi realizada pelo ensaio de MTT. C. albicans foi cultivada em placas de 96 poços em diferentes condições por 24 h a 36°C para a formação de biofilme. Posteriormente, o sobrenadante da cultura foi descartado e as células aderidas foram lavadas para a realização o ensaio de MTT, conforme descrito previamente. Tanto a ação individual de diferentes concentrações do metoprolol (A), quanto a ação conjunta de propranolol e metoprolol para a concentração de 0,5 mM cada (B), foi analisada. SFB: Soro Fetal Bovino. MO: Metoprolol. PO: Propranolol. Letras diferentes apontam para diferenças estatísticas (P < 0,05).

4.2.3. Efeito do propranolol na adesão de C. albicans a superfícies abióticas e