Efeito do propranolol na modulação da expressão de genes que codificam adesinas de C albicans

Sabendo-se que a adesão de C. albicans a superfícies, etapa inicial para a formação do biofilme, é mediada tanto por fatores inespecíficos, como forças hidrofóbicas e eletrostáticas, quanto por adesinas específicas (Ramage et al., 2005), avaliamos o efeito do propranolol nos níveis de expressão dos genes que codificam as adesinas HWP1, ALS1 e ALS3. O papel dessas proteínas no desenvolvimento de biofilmes por C. albicans vem sendo relatado por alguns autores. Análises funcionais têm mostrado, por exemplo, que a proteína HWP1 é requerida para a adesão de células fúngicas a células epiteliais (Staab et al., 1999) e para a formação do biofilme por C.

albicans in vitro e in vivo (Nobile et al., 2006a e 2006b). Do mesmo modo, Nobile et al.

(2008) sugerem que as proteínas ALS1 e ALS3 são cruciais para o biofilme de C.

albicans. Em adição, os níveis de expressão do gene Als3 aumentam durante os estágios

iniciais de formação do biofilme (Nailis et al., 2009), reforçando ainda mais o papel desta proteína no desenvolvimento de comunidades microbianas por C. albicans.

Nesse contexto, os níveis de expressão dos genes Hwp1, Als1 e Als3 foram quantificados em experimentos de PCR em tempo real. Como verificado na tabela 3, a

adição de SFB a uma cultura de C. albicans, condição essa que induz a filamentação e a formação de biofilme (Figura 11), eleva significativamente os níveis de expressão dos genes que codificam as três adesinas estudadas. Esses resultados estão de acordo com trabalhos prévios que mostram que a expressão dos genes Als3 e Hwp1 é drasticamente aumentada durante a fase de micélio de C. albicans (Hoyer et al., 1998; Sundstrom, 2002). Em contrapartida, a adição de 0,75 mM de propranolol reverte o efeito indutor mediado pelo SFB, resultando em um decréscimo no acúmulo dos transcritos Als1, Als3 e Hwp1 em 82,4%, 94,1% e 97,1%, respectivamente (Tabela 3). Esse resultado indica que o efeito do propranolol no processo de adesão de C. albicans a superfícies, e, por conseguinte, o efeito do propranolol na formação do biofilme por esse fungo, deve-se, ao menos em parte, à diminuição da expressão de adesinas específicas.

A inibição da expressão do gene Als3 por propranolol foi também descrita recentemente por Ueno et al. (2009). Esses autores mostraram ainda que 1 mM de propranolol reprime a expressão do gene que codifica a adesina ALS8. A expressão de ambas as adesinas (ALS3 e ALS8), assim como das outras adesinas aqui analisadas (ALS1 e HWP1), é regulada pelo fator de transcrição EFG1 de C. albicans (Zhao et al., 2004; Stoldt et al., 1997; Fu et al., 2002; Sharkey et al., 1999). A proteína EFG1 é um importante regulador de processos morfogenéticos em C. albicans (Ernst, 2000) e a expressão relativa do gene que codifica esse fator transcricional também é diminuída em resposta ao propranolol (Ueno et al., 2009). Contudo, nossos resultados corroboram a hipótese formulada por Ueno et al. (2009) de que o propranolol atua reprimindo a via cAMP-EFG1, a qual regula a expressão de genes específicos da fase miceliana de C.

albicans.

Tabela 3. Efeito do propranolol nos níveis de expressão de genes que codificam as adesinas

ALS1, ALS3 e HWP1 de C. albicans. SFB: Soro Fetal Bovino. PO: Propranolol.

Fold Change

Gene Controle SFB 20% _{PO 0,75 mM} SFB 20% +

Als1 1,0 1,7 0,3

Als3 1,0 8,5 0,5

4.2.5. Conclusão

Em suma, nossos resultados mostraram que o propranolol tem um potente efeito inibitório na formação de biofilme por C. albicans in vitro. O mecanismo de ação do propranolol no desenvolvimento do biofilme está fortemente relacionado com seu efeito na filamentação de C. albicans. Propranolol inibe a formação de tubos germinativos como conseqüência da repressão da via cAMP-EFG1 de C. albicans (Ueno et al., 2009). A ativação dessa via em resposta a alguns sinais externos, como presença de SFB e GlcNAc, leva ao acúmulo do fator transcricional EFG1, o qual induz a expressão de genes específicos da fase miceliana de C. albicans. O resultado é a filamentação desse fungo (Ernst, 2000). Adicionalmente, Baker et al. (2002) propuseram que o propranolol inibe a morfogênese de C. albicans por seqüestrar o ácido fosfatídico (PA), impedindo a formação de diacilglicerol (DAG). Conjuntamente, esses estudos sugerem que o fator de transcrição EFG1 possa ser regulado via sinalização das moléculas PA e/ou DAG. Assim, propranolol atuaria inibindo a expressão de EFG1, como mostrado por Ueno et

al. (2009), e, por conseqüência, diminuiria a expressão de genes induzidos por esse fator

transcricional, como os genes que codificam as adesinas ALS1, ALS3, e HWP1. Como conseqüência, a ação do propranolol teria efeito negativo na adesão de células de C.

albicans a superfícies. Portanto, com base nos resultados apresentados nesse trabalho e

em trabalhos relatados na literatura, concluimos que o propranolol atua em ao menos duas etapas fundamentais para o desenvolvimento do biofilme de C. albicans: (I) o propranolol inibe o processo de adesão de células fúngicas, o qual representa a etapa inicial de formação do biofilme; (II) o propranolol inibe a filamentação de C. albicans, processo requerido para o desenvolvimento e estruturação de um biofilme maduro.

Em adição às contribuições para o entendimento do mecanismo de formação de biofilmes por C. albicans, nossos resultados podem auxiliar no desenvolvimento de estratégias alternativas para a prevenção da formação dessas microcomunidades. E embora o uso de propranolol no tratamento de infecções por Candida possa não ser recomendado devido sua atividade em células de mamífero, especula-se o uso desse composto visando recobrir a superfície de catéteres e outros instrumentos médicos, e assim previnir a colonização das células fúngicas e conseqüente formação de biofilmes.

4.3. Comparação do transcritoma de C. neoformans quando na interação com amebas e macrófagos murinos

C. neoformans é um patógeno oportunista freqüentemente encontrado em solos

contaminados com excreta de aves (Ellis & Pfeiffer, 1990). A infecção por C.

neoformans, que ocorre pela inalação de propágulos do ambiente pelo hospedeiro,

parece ocorrer de forma acidental, já que C. neoformans é um fungo de vida livre que independe de um hospedeiro animal para sua propagação (Hogan et al., 1996). Caso ocorra a exposição ao fungo, o estabelecimento da infecção e o conseqüente desenvolvimento da criptococose vai depender da resultante entre a resposta imunológica do hospedeiro e a virulência de C. neoformans. Uma das primeiras linhas de defesa da resposta imune inata do hospedeiro é desempenhada pelos macrófagos alveolares, os quais são capazes de fagocitar eficientemente C. neoformans (Fan et al., 2005). Entretanto, a fagocitose não resulta sempre na morte das células fúngicas, que podem sobreviver e se replicar no interior de fagócitos in vivo, como mostrado por Feldmesser et al. (2000). Essa habilidade de C. neoformans de se comportar como um patógeno intracelular facultativo, o qual requer estratégias sofisticadas que permitam sua sobrevivência no ambiente hostil de fagossomos, torna-se particularmente curiosa por este ser um fungo saprofítico que não necessita de hospedeiro animal para sua replicação. Uma hipótese para essa questão é que tal capacidade de C. neoformans foi inicialmente desenvolvida para conferir vantagem em seu ambiente natural, sendo posteriormente favorável durante a infecção de hospedeiros mamíferos. Nesse sentido, Steenbergen et al. (2001) sugeriram que a capacidade de C. neoformans em sobreviver e se replicar no interior de macrófagos é uma conseqüência adaptativa conferida por fatores que propiciam ao fungo vantagens contra predadores ambientais. Essa hipótese foi testada investigando-se as interações entre C. neoformans e a ameba A. castellanii. Os resultados mostraram que A. castellanii rapidamente internaliza as leveduras de C.

neoformans, as quais são capazes de se replicar no ambiente intracelular. Além disso,

isolados mutantes de C. neoformans para dois importantes determinantes de virulência em hospedeiro mamífero (cápsula e fosfolipase) são incapazes de sobreviver no interior da ameba, sugerindo que fatores de virulência requeridos para a persistência do fungo em animais são também requeridos para a persistência em amebas (Steenbergen et al.

2001). Com base nesses dados, foi proposto que C. neorfomans tenha sofrido pressão evolutiva em seu ambiente natural decorrente da predação por protozoários do solo, o que promoveu a seleção de estratégias que permitiram sua sobrevivência intracelular em macrófagos de mamíferos. Este resultado provavelmente advém da semelhaça entre o ambiente intracelular dos macrófago e das amebas, os quais constituem tanto uma condição de estresse nutricional como oxidativo. Nesse contexto, visando avaliar a resposta do fungo a esses ambientes intracelulares, propusemos comparar o perfil transcritômico de leveduras de C. neoformans quando na interação com a ameba A.

castellanii e macrófagos murinos.

4.3.1. Cinética da internalização de leveduras de C. neoformans por amebas e