Efeito do farnesol na morfogênese de P brasiliensis

Uma vez que a transição dimórfica é fundamental para o estabelecimento da infecção por P. brasiliensis, o efeito do farnesol nesse processo foi avaliado. Para tanto, células leveduriformes foram cultivadas a 25°C na presença de concentrações de farnesol menores ou iguais a 25 !M. Os resultados mostraram que na presença de 25 µM de farnesol (CIM) há a inibição completa da morfogênese devido ao efeito fungistático verificado anteriormente (Figura 4C). Entretanto, o cultivo de P.

brasiliensis em presença de concentrações de farnesol inferiores a 25 µM, as quais não

afetam o crescimento do fungo (Figura 4A), prejudicam a transição de levedura para micélio, como observado por microscopia óptica após 24 e 48 h de incubação a 25°C (Figura 5A). Quando cultivadas na ausência de farnesol, todas as células desenvolveram tubos germinativos após 24 h, enquanto que o cultivo em concentrações crescentes de farnesol foi inversamente proporcional a filamentação de P. brasiliensis (Figura 5B). Após 24 h, cerca de 85% das leveduras crescidas em 15 µM de farnesol não possuem tubos germinativos (Figura 5B) e, quando possuem, estes são significativamente

os efeitos de concentrações inferiores a 15 µM de farnesol são de retardo do processo de morfogênese, já que após 48 h de cultivo houve um aumento tanto no número de células com tubos germinativos, quanto no tamanho dessas estruturas, quando comparado aos resultados em 24 h (Figura 5B e 5C). A capacidade de P. brasiliensis em aumentar em quantidade e em tamanho os tubos germinativos ao longo do tempo na presença de concentrações de farnesol inferiores a 15 µM reforçam que as células estão viáveis nessas condições, como anteriormente mostrado na figura 4.

Resultados similares foram obtidos para a transição de micélio para levedura de

P. brasiliensis, como verificado após 4 dias de incubação do micélio a 36°C. O cultivo

de P. brasiliensis em concentrações baixas de farnesol (5 e 10 !M) retarda o processo de transição dimórfica desse patógeno (Figura 6), enquanto 25 !M de farnesol abole completamente a transição por comprometer a viabilidade celular.

A atividade de farnesol na morfogênese de fungos também foi descrita para C.

albicans (Hornby et al., 2001; Mosel et al., 2005). C. albicans produz e secreta farnesol,

o qual se acumula no meio de cultura e promove a inibição da filamentação desse patógeno (Hornby et al., 2001). Os mesmos autores mostraram que a adição exógena de farnesol comercial possui o mesmo efeito que o sobrenadante de uma cultura crescida de C. albicans (meio condicionado) no dimorfismo desse fungo. Entretanto, esse efeito do farnesol não é observado na transição dimórfica do fungo Cerastocystis ulmi, agente etiológico doença de Dutch. Hornby et al. (2003) mostraram que tanto a adição de farnesol comercial até uma concentração de 100 !M, quanto a suplementação da cultura de C. ulmi com o meio condicionado (CM) de C. albicans não influenciam na transição desse patógeno de levedura para micélio. Em contrapartida, o co-cultivo de C. albicans com o fungo Aspergillus nidulans revelou uma inibição do crescimento e do desenvolvimento de A. nidulans dependente da produção de farnesol por C. albicans (Semighini et al., 2006). A co-cultura de C. albicans e P. aeruginosas também promove redução nos níveis da molécula de quorum-sensing quinolona (PQS) e do fator de virulência piocianina da bactéria, sendo sugerido que essa alteração seja causada pelo farnesol secretado por C. albicans (Cugini et al., 2007). Dessa forma, sabendo-se que o farnesol é uma QSM secretada por C. albicans, e que essa molécula parece mediar interações interespecífica, como relatado para outros microrganismos, verificamos o efeito do sobrenadante de uma cultura de C. albicans crescida até atingir a fase estacionária (CM) no dimorfismo de P. brasiliensis.

Figura 5. Efeito do farnesol na filamentação de P. brasiliensis. Leveduras de P.

brasiliensis foram cultivadas por 24 e 48 h a 25°C em diferentes concentrações de farnesol. (A)

Morfologia das células de P. brasiliensis avaliadas por microscopia óptica após serem cultivadas na presença de diferentes concentrações de farnesol. (B) Porcentagem de células com tubo germinativo após 24 e 48 h de cultivo na presença ou na ausência de farnesol. (C) Tamanho médio dos tudos germinativos formados em resposta a diferentes concentrações de farnesol. As barras representam o erro padrão e letras diferentes apontam para diferença estatística (P % 0,001).

Figura 6. Efeito do farnesol no processo de transição de micélio para levedura em P.

brasiliensis. P. brasiliensis (forma miceliana) foi incubado por 4 dias a 36°C na presença de

diferentes concentrações de farnesol. (A) Controle (sem farnesol);! (B) 5! !M farnesol; (C) 10 !M farnesol; (D) 25 !M farnesol.

Os resultados obtidos demonstraram que o CM de C. albicans afeta a filamentação de células de P. brasiliensis. Concentrações superiores a 40% de CM de

C. albicans inibem bruscamente a transição de levedura para micélio em P. brasiliensis,

sugerindo que a formação de tubos germinativos nesse fungo é controlada por algum fator solúvel presente no CM de C. albicans (Figura 7). Ainda, a inibição da filamentação de P. brasiliensis foi mantida mesmo após tratamento do CM de C.

albicans com proteinase K, ou após exposição a altas temperaturas, sugerindo que o

fator responsável pela inibição é termoestável e não apresenta característica protéica (dados não mostrados). O efeito inibitório do CM de C. albicans também é verificado no crescimento de leveduras de P. brasiliensis (dados não mostrados).

Com base nesses resultados e em relatos da literatura, propõe-se que fungos patogênicos, como C. albicans, provavelmente secretam fatores solúveis que atuam inibindo o desenvolvimento de outros microrganismos. No caso de C. albicans, é sabido que esse patógeno secreta duas moléculas de QS: o farnesol e o tirosol. Como mostrado anteriormente, o farnesol possui efeito similar ao CM de C. albicans em P. brasiliensis, uma vez que inibe o dimorfismo e o crescimento deste último. Adicionalmente, verificamos que concentrações iguais ou inferiores a 300 µM de tirosol, a outra QSM de

brasiliensis (dados não mostrados). Esses resultados indicam um possível envolvimento

do farnesol em interações interespecíficas entre C. albicans e P. brasiliensis.

Figura 7. Efeito de diferentes concentrações do meio condicionado (CM) de C. albicans no

dimorfismo de P. brasiliensis. Leveduras de P. brasiliensis foram crescidas por 24 h a 25°C

em presença de diferentes concentrações de CM de C. albicans. O percentual de células de P.

brasiliensis que apresentaram formação de tubos germinativos esse período na presença de

diferentes concentrações de CM de C. albicans foi calculado. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão de 3 experimentos. Letras diferentes apontam para diferenças estatísticas (P < 0,05).

4.1.3. Efeito do farnesol na integridade de estruturas celulares de P. brasiliensis